楊世緣，胡 月，周宇寧，桂志鵬，徐袁瑾

牙周炎是一種由牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)、福賽坦氏菌和密螺旋體等多種牙周致病菌感染引起的牙周支持組織炎癥。根據(jù)2018年第四次全國口腔流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，牙周炎在我國中老年人群中發(fā)病率很高，其中35～44歲年齡組、55～64歲年齡組、65～74歲年齡組附著喪失(≥4 mm)的檢出率分別為33.2%、69.9%、74.2%[1]。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)牙周炎可增加諸多疾病(如動脈粥樣硬化、不良妊娠結(jié)局、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、誤吸性肺炎和癌癥)發(fā)生的風(fēng)險，影響患者的全身健康[2]。因此，預(yù)防和治療牙周炎對于全身健康至關(guān)重要。在減少致病菌、控制牙周炎發(fā)展的基礎(chǔ)上重建牙周骨組織是牙周炎治療的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的牙周缺損修復(fù)手段如骨移植和引導(dǎo)性組織再生通常無法實現(xiàn)完全再生已破壞的牙周骨組織[3]。組織工程的出現(xiàn)和迅速發(fā)展，被認(rèn)為是實現(xiàn)牙周骨組織再生的理想方法。

近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)褪黑素在唾液中的濃度與牙周炎的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，同時還發(fā)現(xiàn)褪黑素具有抑菌、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和促進骨再生等特性，為牙周炎的診斷及治療研究拓寬了思路[4-5]。本文對褪黑素在牙周炎中發(fā)揮的作用及其機制的相關(guān)研究進行總結(jié)，并著重分析褪黑素應(yīng)用在牙周骨組織工程領(lǐng)域的潛力，擬為今后治療牙周炎尋找新的有效治療靶點提供重要基礎(chǔ)。

1 褪黑素

褪黑素(N-乙?；?5-甲氧基色胺)是一種內(nèi)源性吲哚類激素(分子量為232.3)，存在于細(xì)菌、真菌、扁蟲、軟體動物、海星、昆蟲、酵母、植物、魚、兩棲動物、爬行動物、鳥類和哺乳動物等眾多生物中。在脊椎動物中，褪黑素除了由神經(jīng)內(nèi)分泌器官(松果體)集中產(chǎn)生外，還可在視網(wǎng)膜、腸、皮膚等其他部位少量合成[6]。褪黑素具有很高的脂溶性和水溶性，可通過受體依賴性途徑和非受體依賴性途徑參與調(diào)節(jié)眾多生理功能，如控制晝夜節(jié)律、調(diào)節(jié)體溫、調(diào)節(jié)性發(fā)育和生殖周期以及活化免疫系統(tǒng)等[7-8]。褪黑素受體包括膜受體和核受體兩類。褪黑素膜受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，包括兩種哺乳動物亞型，褪黑素受體1型(melatonin receptor 1，MT1)和褪黑素受體2型(melatonin receptor 2，MT2)，分別由350和363個氨基酸殘基組成，具有高度的序列同源性，都能以高親和力與褪黑素結(jié)合。褪黑素核受體維甲酸Z受體(retinoid Z receptor，RZR)/維甲酸相關(guān)孤核受體(retinoic acid-related orphan receptor，ROR)包括3個亞型(α，β，γ)和4個α-亞型剪接變體，其中僅RORα亞型的剪接變體c和RORγ亞型與核中褪黑素作用有關(guān)[6]。而褪黑素的非受體依賴途徑是通過清除自由基發(fā)揮直接抗氧化作用以及誘導(dǎo)抗氧化酶間接抗氧化而實現(xiàn)的[9]。

2 唾液褪黑素與牙周炎的相關(guān)性

口腔中的內(nèi)源性褪黑素，來自體循環(huán)中未與血清白蛋白結(jié)合的褪黑素。唾液中的褪黑素含量是血液循環(huán)中褪黑素含量的1/4～1/3，白天的濃度為1～5 pg/mL，午夜高峰時的濃度可達到50 pg/mL[10]。Shimozuma等[11]發(fā)現(xiàn)褪黑素生物合成中介導(dǎo)5-羥色胺向褪黑素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶在嚙齒類動物的唾液腺和人下頜下腺中也有表達，這表明褪黑素也可以在這些組織中局部合成。同時，還有研究報道MT1和MT2受體在口腔上皮細(xì)胞、黏膜固有層的成纖維細(xì)胞、上頜牙槽骨的成骨細(xì)胞、唾液腺導(dǎo)管細(xì)胞和腺泡細(xì)胞中存在[12]。

近年來，許多人認(rèn)為唾液褪黑素水平可以作為診斷牙周炎的生物標(biāo)志物，并進行相關(guān)研究。Cutando等[13]檢測37例牙周患者的唾液和血漿褪黑素水平，發(fā)現(xiàn)社區(qū)牙周指數(shù) (community periodontal index，CPI)評分越高的患者，唾液褪黑素水平和唾液/血漿褪黑素比越低。Almughrabi等[14]則對健康受試者、菌斑性牙齦炎患者、慢性牙周炎患者和侵襲性牙周炎患者齦溝液和唾液中的褪黑素濃度進行了檢測，發(fā)現(xiàn)齦溝液和唾液中的褪黑素濃度在健康組和菌斑性牙齦炎組較高，在慢性牙周炎組和侵襲性牙周炎組明顯降低，但在慢性牙周炎組和侵襲性牙周炎組之間沒有統(tǒng)計學(xué)上的差異，因此認(rèn)為褪黑素可能對牙周組織具有保護作用。Bertl等[15]發(fā)現(xiàn)在牙周非手術(shù)治療(nonsurgical periodontal therapy，NSPT)前，牙周炎患者的唾液褪黑素水平低于健康對照組，而在NSPT后，牙周炎患者唾液中降低的褪黑素水平有所恢復(fù)，其恢復(fù)的程度與牙周局部炎癥的減輕呈顯著正相關(guān)。然而，也有相反的研究結(jié)果。Lodhi等[16]選取30例受試者，發(fā)現(xiàn)牙周炎組中唾液褪黑素濃度最高，其次是牙齦炎組，健康組最低。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病(diabetes mellitus，DM)和非DM患者中，血漿和唾液中的褪黑素濃度與CPI呈現(xiàn)出雙相關(guān)系，即在CPI評分為0～2時，隨CPI指數(shù)增大褪黑素濃度降低；在CPI評分為2～4時，隨CPI增大褪黑素濃度升高，并在CPI評分為4時褪黑素濃度達到頂峰[17-18]。

3 褪黑素改善牙周狀態(tài)的機制

3.1 褪黑素的抑菌作用

牙周炎的發(fā)生與生物膜中的菌群失調(diào)有關(guān)。P.gingivalis是一種革蘭陰性口腔厭氧菌，在牙周炎患者的齦下菌斑中有較高的檢出率，是目前公認(rèn)的牙周炎主要致病菌之一。P.gingivalis可通過多種途徑參與牙周炎發(fā)病過程，包括釋放牙齦蛋白酶K(gingipain K，Kgp)、牙齦蛋白酶R(gingipain R，Rgp)等細(xì)胞外蛋白水解酶促進宿主蛋白降解，產(chǎn)生溶血素促進紅細(xì)胞釋放血紅素，憑借細(xì)胞壁組分P.gingivalis來源的脂多糖(Porphyromonasgingivalis-derivedlipopolysaccharide，P.g-LPS)刺激宿主細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素(interleukin，IL)等。Zhou等[5]發(fā)現(xiàn)褪黑素對P.gingivalis不僅具有體外抗菌活性，還能降低其Kgp和Rgp的表達、抑制其溶血活性以及減少P.g-LPS刺激的人牙齦成纖維細(xì)胞IL-6和IL-8的釋放。

3.2 褪黑素的抗炎、抗氧化作用

牙周支持組織的破壞在很大程度上是由于宿主持續(xù)釋放促炎細(xì)胞因子、自由基和活性氧(reactive oxygen species，ROS)導(dǎo)致的。近年來，有大量研究表明褪黑素可以抑制促炎細(xì)胞因子的釋放，減輕氧化應(yīng)激損傷，有效改善牙周健康。Kara等[19]發(fā)現(xiàn)褪黑素可降低實驗性牙周炎大鼠血清中炎癥因子IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的水平和減輕氧化應(yīng)激損傷。Virto等[20]發(fā)現(xiàn)褪黑素輔助治療牙周炎伴肥胖大鼠時，有效降低了牙齦組織中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1和TNF-α的水平，可有效控制牙周炎癥并顯著減少牙槽骨吸收。Kose等[21]發(fā)現(xiàn)全身性褪黑素治療伴或不伴DM的實驗性牙周炎大鼠時，可顯著降低實驗性牙周炎大鼠牙齦組織中髓過氧化物酶和血清中氧化應(yīng)激指數(shù)水平。此外，在接受NSPT處理的2型DM的慢性牙周炎患者中，褪黑素補充治療可顯著下調(diào)患者血清中的炎癥指標(biāo)TNF-α、IL-6，上調(diào)抗氧化指標(biāo)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶，有效改善牙周狀態(tài)[22-23]。

3.3 褪黑素的免疫調(diào)節(jié)作用

牙周炎的組織破壞與宿主對牙菌斑生物膜中微生物產(chǎn)生的免疫應(yīng)答關(guān)系密切，因此，調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答，減少免疫應(yīng)答給機體帶來的損害對牙周炎的治療至關(guān)重要[24]。近年來，許多臨床證據(jù)顯示中性粒細(xì)胞與牙周組織破壞密切相關(guān)，且其數(shù)量與牙周炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[25]。Kose等[21]發(fā)現(xiàn)褪黑素能減少實驗性牙周炎大鼠下頜骨中性粒細(xì)胞的浸潤。巨噬細(xì)胞作為牙周組織中免疫應(yīng)答的第一道防線，一方面通過發(fā)揮防御功能維持牙周組織穩(wěn)態(tài)，另一方面通過分泌IL-1和一氧化氮(nitric oxide，NO)等物質(zhì)導(dǎo)致牙周組織的破壞，加重牙周炎[26]。Choi等[27]發(fā)現(xiàn)褪黑素能通過抑制STAT1途徑減少中間普氏菌來源的脂多糖誘導(dǎo)的鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和NO。以上研究均提示褪黑素可能成為牙周炎宿主調(diào)節(jié)治療的有效藥物。

4 褪黑素與牙周骨組織再生

近年興起的組織工程旨在通過單獨或組合使用支架材料、種子細(xì)胞、外源性因子(化學(xué)或生物)修復(fù)受損的組織，獲得高效、可預(yù)期的牙周骨再生。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作為一種理想的種子細(xì)胞，目前被廣泛應(yīng)用在牙周組織缺損修復(fù)中。支架材料可以以接種或不接種離體細(xì)胞的形式摻入骨缺損部位以促進骨形成[28]。外源性化學(xué)因子通過各種方法被添加到支架材料上產(chǎn)生生物活性，以加快再生過程。褪黑素作為一種具有抗菌、抗炎和抗氧化作用的外源性化學(xué)因子，其結(jié)合MSCs和/或支架材料促進骨再生的作用已在許多研究中得到報道，有望應(yīng)用在牙周骨組織工程領(lǐng)域中[4]。

4.1 褪黑素與MSCs

4.1.1 褪黑素促進生理狀態(tài)下MSCs成骨分化 2006年，Radio等[29]發(fā)現(xiàn)褪黑素通過上調(diào)MT2和激活絲裂原活化的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase 1/2，MEK 1/2)/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2)信號通路，在一定程度上提高了人間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells，hMSCs)中堿性磷酸酶的表達水平。Sethi等[30]發(fā)現(xiàn)褪黑素加入的時間點會影響hMSCs的分化，在成骨的起始或最終階段加入可提高細(xì)胞的分化率，而中間階段加入則不影響結(jié)果。Lee等[31]發(fā)現(xiàn)褪黑素以劑量依賴的方式激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)從而促進hMSCs的成骨分化。Rafat等[32]證明褪黑素預(yù)處理骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)可促進其成骨分化并抑制其凋亡。Zhou等[33]研究表明褪黑素通過抑制MT2依賴的核轉(zhuǎn)錄因子κB (nuclear transcription factor kappa B, NF-κB)信號通路顯著加速BMSCs的成骨分化。Jiang等[34]發(fā)現(xiàn)褪黑素可通過激活A(yù)MPK/β-catenin信號通路協(xié)同骨形態(tài)發(fā)生蛋白-9 (bone morphogenetic protein-9，BMP-9)促進MSCs成骨分化。Li等[35]發(fā)現(xiàn)褪黑素通過上調(diào)miR-92b-5p的表達，靶向沉默細(xì)胞間粘附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的表達來促進BMSCs的成骨分化。

4.1.2 褪黑素恢復(fù)病理狀態(tài)下MSCs成骨分化的能力 褪黑素不僅能促進生理狀態(tài)下MSCs的成骨分化，還能恢復(fù)病理狀態(tài)下MSCs被抑制的成骨分化能力。H2O2和鐵超載的微環(huán)境導(dǎo)致BMSCs成骨分化能力降低，褪黑素分別通過上調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)表達和阻斷p53/ERK/p38信號通路來恢復(fù)BMSCs的分化能力[30, 36-37]。此外，還有研究報道褪黑素可恢復(fù)被鎘抑制的hMSCs成骨分化能力[38]。褪黑素治療去卵巢大鼠時，其有明顯的抗骨質(zhì)疏松作用，并能保持BMSCs成骨分化潛能[39]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)用褪黑素處理青春期特發(fā)性脊柱側(cè)凸患者來源的hMSCs后，能上調(diào)其與成骨分化有關(guān)基因的表達，并通過上調(diào)軟脂?；椎鞍?，激活MEK1/2/ERK1/2信號通路促進其成骨分化[40-41]。另外，還有研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可通過上調(diào)Yes相關(guān)蛋白的表達和減少ROS的產(chǎn)生恢復(fù)BMSCs被TNF-α抑制的成骨分化能力[42-43]。

4.1.3 褪黑素與牙周膜干細(xì)胞 在牙周膜組織中，有一群稱為牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)的MSCs，其能分化為成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成膠原細(xì)胞和成脂肪細(xì)胞，被認(rèn)為是牙周骨組織工程中最有潛力的種子細(xì)胞[44-45]。Otero等[46]證明在杜氏改良Eagle培養(yǎng)基中添加50 μmol/L褪黑素能促進PDLSCs成骨分化。Zheng等[47]研究表明，在生理濃度(1 pmol/L～10 nmol/L)下，褪黑素抑制了PDLSCs中成骨相關(guān)基因的表達；在藥理學(xué)濃度(1 μmol/L～1 mmol/L)下，褪黑素促進了PDLSCs的成骨分化。

4.2 褪黑素與支架材料

外源性添加褪黑素促進成骨作用已在許多研究中得到報道[4]。支架材料作為牙周骨組織工程中一個關(guān)鍵要素，可提供一個有利于種子細(xì)胞粘附、增殖、分化及生長的三維支架式外環(huán)境，同時也可作為外源性化學(xué)因子的載體。支架材料可分為天然衍生材料、人工合成材料和復(fù)合材料三大類。

4.2.1 天然衍生材料 天然衍生材料指的是自然界形成的或來源于自然界的有機材料(膠原、殼聚糖、藻酸鹽)和無機材料(天然骨、珊瑚材料)。因豬的基因型與人類相似，天然來源的豬骨常被用于骨再生[48]。有學(xué)者將褪黑素與豬骨充填在比格犬下頜骨種植體周圍縫隙中，進行3個月的隨訪，研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素和豬骨聯(lián)合使用與單獨使用豬骨相比，種植體和骨的整合明顯增強，種植體周圍區(qū)域骨生長及血管和結(jié)締組織的形成增加，而牙槽嵴頂?shù)奈諟p少[49]。還有研究發(fā)現(xiàn)，在向兔脛骨近干骺端植入豬骨植入物后的2個月內(nèi)，添加褪黑素的植入物附近皮質(zhì)骨再生快于不添加褪黑素的對照組[50]。

4.2.2 人工合成材料 人工合成材料是指由人工合成的材料，分為有機(聚己內(nèi)酯、聚乳酸-羥基乙酸共聚物)和無機(鋁酸鈣、合金)兩大類。

聚己內(nèi)酯(polycaprolactone，PCL)因其廉價、降解緩慢、機械性能理想等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于組織工程中。Gurler等[51]用電噴霧法將褪黑素負(fù)載在PCL微粒上置入大鼠顱骨缺損處，發(fā)現(xiàn)其能明顯促進缺損處骨再生。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)是一種具有良好生物相容性、機械強度和可降解性的高分子聚合物，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在緩控釋給藥系統(tǒng)的研究中。Zhang等[52]用PLGA微球包封褪黑素，使其成為一種褪黑素緩釋系統(tǒng)，該緩釋系統(tǒng)可以在一段時間內(nèi)產(chǎn)生具有相對穩(wěn)定濃度的褪黑素微環(huán)境，并能促進MSCs在體外的成骨分化。β-環(huán)糊精呈外親水、內(nèi)疏水的特征結(jié)構(gòu)，近年來常將許多疏水性化合物封裝到其空腔中以改善化合物的水溶性。Terauchi等[53]將褪黑素與2-羥丙基-β-環(huán)糊精制備形成包合物，改善了褪黑素的水溶性并在體外顯著增強了MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化能力。

鋁酸鈣(calcium aluminate，CA)作為一種合成無機陶瓷，具有低毒性和良好的機械強度，被認(rèn)為是理想的合成骨替代物。Clafshenkel等[54]發(fā)現(xiàn)與CA支架相比，CA-褪黑素支架顯著促進了人成骨細(xì)胞的增殖、存活和粘附。由于鈦合金具有與天然骨接近的彈性模量和良好的骨傳導(dǎo)性，近年來作為支架材料或作為支架材料表面涂層廣泛應(yīng)用在骨組織工程中，但使用過程中磨損的鈦顆粒會導(dǎo)致周圍骨溶解[55]。Ping等[56]發(fā)現(xiàn)褪黑素可抑制鈦顆粒誘導(dǎo)的溶骨并促進溶骨部位的骨形成，并證明了褪黑素是通過Wnt/β-catenin信號途徑抑制鈦顆粒誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成，減輕MSCs成骨分化抑制作用。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)用塑料帽狀支架引導(dǎo)大鼠顱骨缺損處骨再生時，添加褪黑素明顯增加支架上新骨的形成，且垂直骨生成明顯增加[57]。

4.2.3 復(fù)合材料 復(fù)合材料是指由兩種或兩種以上不同性質(zhì)的材料，通過物理或化學(xué)的方法，在宏觀或微觀上組成具有新性能的材料。最近，Lai等[58]用直接滴加法和自旋輔助技術(shù)制備了負(fù)載褪黑素的殼聚糖/明膠多層涂層TiO2納米管，并測定該涂層能有效持續(xù)釋放褪黑素，與未負(fù)載褪黑素TiO2納米管相比能有效促進MSCs粘附、擴散、增殖和成骨分化。Liu等[59]則設(shè)計了一種雙相水凝膠，該水凝膠由兩個結(jié)合良好形狀可調(diào)的水凝膠相組成，分別稱為骨再生水凝膠(bone-regenerating hydrogel，BRH)和軟骨再生水凝膠(cartilage-regenerating hydrogel，CRH)，BRH和CRH中的納米盒(β-環(huán)糊精)分別裝載了成骨和成軟骨分化誘導(dǎo)劑(褪黑素和卡托基寧)，發(fā)現(xiàn)藥物和凝膠的聯(lián)合使用比單獨使用凝膠更能有效促進骨再生和軟骨再生。

5 結(jié) 論

牙周炎作為一種主要的口腔疾病，會導(dǎo)致牙齦退縮和牙槽骨吸收[60]。牙周炎早期多無明顯自覺癥狀，常常在接受檢測和治療之前，牙周炎已達到嚴(yán)重程度。因此，早期診斷和治療對牙周炎至關(guān)重要。唾液褪黑素濃度有望用于牙周炎臨床診斷，但牙周狀態(tài)與唾液褪黑素濃度之間的關(guān)系尚無明確定論，還有待進一步探索[13-18]。此外，還有大量研究表明外源性添加褪黑素可改善牙周炎牙周狀態(tài)，但具體機制尚不清楚[19-23]。

褪黑素能促進MSCs成骨分化并與不同支架材料聯(lián)合使用明顯促進骨再生，顯示出其在牙周骨組織工程領(lǐng)域的巨大潛力，但目前研究仍存在如下問題：①褪黑素對牙周骨組織工程中理想的種子細(xì)胞PDLSCs的影響仍不明確；②與何種支架聯(lián)合使用才能實現(xiàn)褪黑素在局部的長期緩釋。綜上所述，要實現(xiàn)褪黑素在牙周炎診治和牙周骨組織工程中的臨床應(yīng)用，還需要研究者們不斷探索和完善。