張曉紅，楊 紅

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710032)

卵巢癌是致死率最高的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，由于卵巢癌起病隱匿和廣泛的腹膜轉(zhuǎn)移，75%的患者在診斷時(shí)已是中晚期，導(dǎo)致卵巢癌成為預(yù)后最差且死亡率最高的婦科腫瘤[1]。脂肪酸代謝增強(qiáng)是惡性腫瘤的特異性代謝表型，有研究表明卵巢癌細(xì)胞中脂代謝增強(qiáng)[2-3]。還有研究發(fā)現(xiàn)，線粒體脂肪酸β氧化增強(qiáng)是多種癌癥的重要能量來(lái)源[4]。

肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(carnitine palmitoyl transferase system，CPTs)是參與脂肪酸β氧化調(diào)控的線粒體定位酶[5]。CPTs家族由兩個(gè)獨(dú)立的蛋白組成，分別是位于線粒體外膜的CPT1和位于線粒體內(nèi)膜的CPT2。很多研究報(bào)道了CPT1過(guò)表達(dá)與人類多種類型的腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)[6-7]。此外，最近的兩項(xiàng)研究也證實(shí)了CPT2在肝細(xì)胞癌的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[8-9]。然而，CPT2在其他類型癌癥(包括卵巢癌)中的表達(dá)和生物學(xué)作用在很大程度上仍然是未知的。因此，本研究將分析CPT2在卵巢上皮癌組織中的表達(dá)及臨床意義，初步探討CPT2在卵巢上皮癌發(fā)病中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2015年3月至2016年12月在西京醫(yī)院接受治療的20例卵巢上皮癌患者的新鮮組織標(biāo)本作為病例組，術(shù)前未行任何治療，術(shù)后病理明確診斷，同時(shí)收集癌旁組織標(biāo)本作為對(duì)照組。收集2010年1月至2014年8月就診于西京醫(yī)院的121例初治卵巢上皮癌患者的組織病理石蠟切片作為病例組；選擇經(jīng)病理確診的對(duì)側(cè)正常卵巢組織或癌旁組織的病理石蠟切片作為對(duì)照組。所有患者術(shù)后給予紫杉醇類+鉑類聯(lián)合化療，臨床資料收集完整，隨訪至少5年。樣本的收集經(jīng)過(guò)患者知情同意和空軍軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

卵巢癌細(xì)胞株A2780、SKOV3、ES2、HEY和正常卵巢上皮細(xì)胞株IOSE80為西京醫(yī)院婦產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室?guī)齑婕?xì)胞，直接復(fù)蘇使用。細(xì)胞培養(yǎng)所需的DMEM和RPMI1640培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)室自行配制，使用前加入胎牛血清和青鏈霉素。

1.2 方法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR

對(duì)新鮮組織使用專用RNA試劑盒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以U6為內(nèi)參照，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。按照以下流程進(jìn)行PCR反應(yīng)：預(yù)變性95℃ 5min；擴(kuò)增95℃變性1min，55℃退火2min，72℃延伸1min，設(shè)置35次循環(huán)；溶解曲線95℃ 15s，60℃1min，95℃ 15s。2-△△Ct法計(jì)算各組細(xì)胞中CPT2的mRNA相對(duì)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)反應(yīng)相關(guān)引物見表1。

表1 qRT-PCR反應(yīng)相關(guān)引物

1.2.2 Western blot

提取組織蛋白，試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定后，加入5×Loading進(jìn)行100℃煮沸蛋白變性。配制10%分離膠，按照每孔60～160μg量上樣，80V電壓電泳，待分子Marker分開后調(diào)電壓至120V，100V恒壓轉(zhuǎn)膜1h，使用TBST配制含有5%脫脂奶粉的封閉液，室溫?fù)u床上孵育1h。按照Marker上顯示的分子量進(jìn)行裁膜，一抗4℃過(guò)夜孵育，第二天室溫復(fù)溫30min，使用TBST溶液清洗3次/5min，隨后孵育二抗1h，再使用TBST溶液洗膜3次/5min，發(fā)光處理結(jié)果。CPT2抗體購(gòu)自abcam(EPR13626)，使用濃度1∶1 000。β-actin抗體購(gòu)自Proteintech(20536-1-AP)，使用濃度1∶1 000。

1.2.3免疫組化

將組織切片依次置于二甲苯與不同濃度的酒精溶液中進(jìn)行水化；切片水化后分別加入過(guò)氧化氫與BSA溶液進(jìn)行處理；隨后依次加入稀釋過(guò)的一抗、二抗與蘇木素；最后，切片經(jīng)脫水、透明、封片和晾干后即可在顯微鏡下對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析。CPT2抗體購(gòu)自abcam(EPR13626)，使用濃度1∶200。

根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的百分率將染色結(jié)果分為5個(gè)等級(jí)，將染色強(qiáng)度分為4個(gè)級(jí)別，總分=染色陽(yáng)性率評(píng)分×強(qiáng)度評(píng)分。將總分≤1分、>1～ ≤4分、>4～ ≤8分、>8分分別定義為陰性(-)、弱陽(yáng)性(+)、中度陽(yáng)性(++)、強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，陰性和弱陽(yáng)性代表低表達(dá)，其余為高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。獨(dú)立樣本資料采用Student′st檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)(百分率)[n(%)]表示，采用χ2檢驗(yàn)；總生存期采用Kaplan-Meier分析方法檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞和20對(duì)卵巢上皮癌組織中CPT2的表達(dá)

應(yīng)用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)4株卵巢癌細(xì)胞、1株正常卵巢上皮細(xì)胞、20對(duì)卵巢上皮癌組織及癌旁組織中CPT2的表達(dá)，結(jié)果顯示：卵巢癌細(xì)胞與正常卵巢上皮細(xì)胞、卵巢上皮癌組織與癌旁組織相比，CPT2 mRNA表達(dá)均較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(細(xì)胞：t=4.381，P<0.05；組織：t=5.380，P<0.05)，見圖1。

注：A為與正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80相比，卵巢癌細(xì)胞中CPT2表達(dá)較低，*P<0.05；B為與癌旁組織相比，卵巢上皮癌組織中CPT2表達(dá)較低。

2.2 Western blot檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞和20對(duì)卵巢上皮癌組織中CPT2的表達(dá)

應(yīng)用Western blot實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞和20對(duì)卵巢上皮癌組織及癌旁組織中CPT2的表達(dá)，結(jié)果顯示：卵巢癌細(xì)胞[(0.76±0.08)μg/L]與正常卵巢上皮細(xì)胞[(1.24±0.14)μg/L]、卵巢上皮癌組織[(3.00±0.15)μg/L]與癌旁組織[(5.27±0.26)μg/L]相比，CPT2蛋白表達(dá)均較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(細(xì)胞：t=10.258，P<0.05；組織：t=23.915，P<0.05)，見圖2、圖3。

注：A為Western blot檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞與正常卵巢上皮細(xì)胞中CPT2的表達(dá)；B為Western blot檢測(cè)20對(duì)卵巢上皮癌組織與癌旁組織中CPT2的表達(dá)(T：癌組織；P：癌旁組織)。

圖3 20對(duì)卵巢上皮癌與癌旁組織中CPT2的蛋白水平檢測(cè)結(jié)果(相對(duì)表達(dá)率用log2表示)

2.3 免疫組化檢測(cè)卵巢上皮癌組織中CPT2的表達(dá)

對(duì)121例卵巢上皮癌患者的石蠟病理切片進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果顯示：與癌旁組織相比，卵巢上皮癌組織中的CPT2表達(dá)顯著較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.730，P<0.05)，見圖4。

注：*P<0.05。圖4 癌旁組織和卵巢上皮癌組織中CPT2的表達(dá)(放大倍數(shù)×200和×400)

2.4 卵巢上皮癌患者臨床病理參數(shù)與CPT2表達(dá)水平的關(guān)系

在121例卵巢上皮癌患者中，Ⅰ型卵巢癌47例，CPT2低表達(dá)占29.8%，Ⅱ型卵巢癌74例，CPT2低表達(dá)占59.5%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；Ⅲ～Ⅳ期97例，CPT2低表達(dá)占57.7%，Ⅰ～Ⅱ期24例，CPT2低表達(dá)占8.3%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；低分化93例，CPT2低表達(dá)占59.1%，高中分化28例，CPT2低表達(dá)占10.7%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；有網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移53例，CPT2低表達(dá)占58.5%；無(wú)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移68例，CPT2低表達(dá)占39.7%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移69例，CPT2低表達(dá)占65.2%，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例，CPT2低表達(dá)占26.9%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；說(shuō)明CPT2表達(dá)與卵巢上皮癌分型、分期、組織學(xué)分級(jí)、有無(wú)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)，見表2。

表2 CPT2表達(dá)水平與121例卵巢上皮癌患者臨床病理參數(shù)的比較結(jié)果[n(%)]

2.5 卵巢上皮癌患者的預(yù)后與CPT2表達(dá)水平的關(guān)系

生存分析曲線顯示，與CPT2高表達(dá)的卵巢上皮癌患者相比，CPT2低表達(dá)的患者總體生存期(OS)明顯較短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.781，P=0.029)，見圖5A；Kaplan Meier生存預(yù)后分析也證實(shí)這一結(jié)果(HR=0.790，95%CI：0.650～0.950，P=0.011)，見圖5B；以上說(shuō)明在卵巢上皮癌組織中，CPT2的低表達(dá)與患者的不良預(yù)后顯著關(guān)聯(lián)。

注：A為總生存率分析；B為Kaplan-Meier plot生存曲線。

3 討論

3.1 不同類型癌組織中CPTs的表達(dá)

脂代謝異常與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。本研究中發(fā)現(xiàn)，脂肪酸β氧化限速酶CPT2在卵巢癌細(xì)胞和卵巢上皮癌組織中的mRNA、蛋白水平均表達(dá)下調(diào)，提示CPT2在卵巢癌細(xì)胞的基因或轉(zhuǎn)錄水平均表達(dá)下調(diào)。然而，最近有研究報(bào)道，NKX2-8通過(guò)表觀遺傳學(xué)抑制脂肪酸β氧化的關(guān)鍵酶，包括CPT1A和CPT2[10]。因此，NKX2-8等幾個(gè)翻譯后因子也可能參與卵巢癌細(xì)胞中CPT2的下調(diào)，但尚需進(jìn)一步證實(shí)。CPT2的下調(diào)與卵巢上皮癌患者生存期較差顯著關(guān)聯(lián)。既往研究也報(bào)道了CPT2在肝癌組織中下調(diào)，且與腫瘤的組織學(xué)分化顯著相關(guān)[8-9]。相反，CPT1亞單位CPT1A和CPT1C的表達(dá)被證明是過(guò)表達(dá)的，并在幾種不同類型的人類惡性腫瘤中發(fā)揮潛在致癌基因的功能，包括結(jié)直腸癌[11]、甲狀腺乳頭狀癌[12]和肺癌[13]。這些差異可能是由于CPT1在線粒體外膜，而CPT2在線粒體內(nèi)膜，并在不同的腫瘤類型中發(fā)揮不同的作用所致，這仍然需要進(jìn)一步研究探索。

3.2 CPT2在癌組織中發(fā)揮促癌作用

卵巢癌細(xì)胞和卵巢上皮癌組織中CPT2的顯著下調(diào)提示其可能對(duì)卵巢癌的發(fā)生具有潛在的促癌作用。與本研究結(jié)果一致的是，既往關(guān)于肝細(xì)胞癌的研究也報(bào)道了CPT2沉默可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移能力，進(jìn)一步研究表明CPT2通過(guò)增強(qiáng)硬脂酰輔酶A去飽和酶-1(SCD-1)介導(dǎo)的脂肪生成來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移[8]。此外，CPT2沉默還可誘導(dǎo)順鉑耐藥細(xì)胞的化療耐藥，提示CPT2可能導(dǎo)致應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[9]。與CPT2相比，CPT1A和CPT1C在結(jié)直腸癌細(xì)胞和甲狀腺乳頭狀癌中均有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用[11-12]。以CPT1A為治療靶點(diǎn)可提高鼻咽癌[14]放療的療效?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明CPTs功能障礙在腫瘤進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。

綜上所述，CPT2在卵巢癌細(xì)胞和卵巢上皮癌組織中表達(dá)下調(diào)，且與不良預(yù)后有關(guān)，提示CPT2可能發(fā)揮重要的腫瘤抑制作用，表明CPT2可作為卵巢上皮癌治療的潛在預(yù)后標(biāo)志物和干預(yù)靶點(diǎn)。