李潔春，宋欣芫，楊學(xué)山，韓舜愈，祝霞*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州， 730070) 2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州， 730070)

葡萄酒酒精發(fā)酵過程中，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)將糖轉(zhuǎn)化為酒精和CO2的同時(shí)，還可產(chǎn)生醇、酯、酮、醛、酸等多種揮發(fā)性次級(jí)代謝產(chǎn)物，構(gòu)成了葡萄酒的主要香氣成分[1-2]。酵母多糖作為良好的發(fā)酵助劑，可以明顯提升酒體香氣品質(zhì)，改善口感，并具有使用便捷、可控、通用性較強(qiáng)等特點(diǎn)[3]。甘露聚糖作為酵母細(xì)胞壁的主要成分，其蛋白端通過與酒體中香氣物質(zhì)作用，可以增加香氣的穩(wěn)定性，提高葡萄酒香氣持久性[4]。JUEGA等[5]將甘露聚糖添加到經(jīng)3株釀酒酵母(W1、W2、W3)發(fā)酵的阿爾巴利諾葡萄酒中，發(fā)現(xiàn)不同酒樣中的揮發(fā)性香氣成分存在一定差異，其中W1葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)含量最高，尤其是萜烯類物質(zhì)香葉醇和芳樟醇等含量明顯增加。尹寧寧等[6]研究指出，外源性添加300 mg/L的甘露聚糖，可使蛇龍珠干紅葡萄酒樣中酯類和萜稀類物質(zhì)含量分別提高25.2%、50%，酸類物質(zhì)含量降低7.5%。甘露聚糖(150 mg/L)也可以通過與葡萄酒中的部分香氣物質(zhì)結(jié)合降低其揮發(fā)性[7]。RIBERIRO等[8]、門穎[9]在干白葡萄酒中添加200 mg/L的甘露聚糖，可以提高其感官評(píng)分。酵母多糖除甘露聚糖(35%)外，還包括不溶性的β-葡聚糖(50%～60%)，可被廣泛應(yīng)用于食品、藥物、化妝品和化學(xué)工業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域[10-12]。然而，β-葡聚糖的低水溶性限制了其應(yīng)用效果和范圍[13]。為了進(jìn)一步促進(jìn)其實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用，研究者采用生物酶解[14-15]、氧化降解等[16]方法，將β-葡聚糖裂解為聚合度較低的低聚糖，從而增加其水溶性，同時(shí)保持較高的生物活性及抗氧化功能。但關(guān)于β-葡聚糖在葡萄酒釀造中的相關(guān)研究未見報(bào)道。

本研究以霞多麗(Chardonnay)釀酒葡萄為原料，在酒精發(fā)酵前外源性添加不同質(zhì)量濃度的水溶性β-葡聚糖，利用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(headspace solid phase micro-extraction combined with gas chromatography-mass，HS-SPME/GC-MS)檢測發(fā)酵酒樣中的揮發(fā)性香氣化合物，探討其對(duì)霞多麗干白葡萄酒香氣品質(zhì)的影響，以期為水溶性β-葡聚糖在葡萄酒釀造生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

霞多麗釀酒葡萄，2020年9月采自甘肅武威莫高釀酒葡萄種植基地，還原糖含量240 g/L，總酸含量6.47 g/L(以酒石酸計(jì))。

Arome White釀酒酵母(S.cerevisiae)，意大利Enartis公司；水溶性β-葡聚糖SG 90，安琪酵母股份有限公司；2-辛醇(色譜純)，美國Sigma公司；L-蘋果酸、纖維二糖、肌醇、維生素B1、維生素B6、生物素等均為國產(chǎn)分析純，上海源葉生物科技有限公司；檸檬酸、MgSO4、MnSO4、酒石酸氫鉀、偏重亞硫酸鈉、(NH4)2HPO4、無水葡萄糖、KH2PO4、K2SO4等常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純，天津光復(fù)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

TRACE 1310-ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Scientific公司；SPME手動(dòng)進(jìn)樣手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C精密pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DK-S12電熱恒溫水浴鍋，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HX502T型電子天平，慈溪市天東衡器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模擬葡萄汁的配制

模擬葡萄汁的配制參考馬騰臻[17]的方法。模擬 汁成分(mg/L)：葡萄糖220 000、纖維二糖200、(NH4)2HPO41 500、KH2PO4750、K2SO4500、7H2O·MgSO4250、 CaCl20.117、NaCl 200、L-蘋果酸300、檸檬酸200、酒石酸氫鉀2 500、偏重亞硫酸鈉80、肌醇20、維生素B515、維生素B10.25、維生素B60.25、生物素0.003、維生素B32。

1.3.2 釀酒酵母菌株活化

按產(chǎn)品說明書推薦方法對(duì)Arome White釀酒酵母菌株進(jìn)行活化。將活性干酵母溶于10倍體積無菌水中，37 ℃靜置20 min，再加入等體積的霞多麗葡萄澄清汁，28 ℃活化25 min，備用接種。

1.3.3 水溶性β-葡聚糖對(duì)釀酒酵母菌株生物量的影響

參考王安娜[18]的方法。在2 L的模擬葡萄汁(2.5 L棕色罐)中分別添加不同質(zhì)量濃度(100、200、300、400、500 mg/L)的水溶性β-葡聚糖，以未添加水溶性β-葡聚糖為對(duì)照組(CK)，按0.2 g/L接種釀酒酵母，25 ℃培養(yǎng)箱控溫培養(yǎng)。每隔24 h測定模擬汁中酵母細(xì)胞的生物量(OD600)，繪制釀酒酵母菌株生長曲線，比較不同質(zhì)量濃度的水溶性β-葡聚糖對(duì)釀酒酵母菌株生長的影響差異。每個(gè)樣品設(shè)置平行3組，結(jié)果取平均值。

1.3.4 葡萄酒微釀實(shí)驗(yàn)

葡萄酒酒精發(fā)酵工藝如下：

霞多麗釀酒葡萄→篩選、除梗、破碎、除去皮渣→加40 mg/L SO2、20 mg/L果膠酶→低溫澄清48 h(4 ℃) →倒灌→澄清汁置于2.5 L棕色發(fā)酵罐(添加水溶性β-葡聚糖)→接種釀酒酵母→25 ℃ 恒溫發(fā)酵→殘?zhí)?4 g/L時(shí)結(jié)束酒精發(fā)酵

待酒精發(fā)酵結(jié)束后，分別取待測酒樣于50 mL離心管中，于-20 ℃密封保存待測基本理化指標(biāo)及揮發(fā)性香氣化合物，每組處理重復(fù)3次。

1.3.5 基本理化指標(biāo)的測定

參照GB 5009.237—2016《葡萄酒、果酒通用分析方法》的方法進(jìn)行測定[19]。

1.3.6 揮發(fā)性香氣成分分析

參照祝霞等[20]的香氣物質(zhì)萃取方法及GC-MS條件，并略作修改。各發(fā)酵酒樣重復(fù)測定3次。

1.3.6.1 香氣成分富集

取8 mL待測酒樣加入15 mL頂空瓶中，同時(shí)添加2.5 g NaCl、10 μL 2-辛醇(質(zhì)量濃度為81.06 mg/L)，加磁力攪拌轉(zhuǎn)子后封口膜封口并搖勻，放入恒溫加熱磁力攪拌器中，40 ℃水浴平衡30 min，然后插入萃取針(旋出萃取頭)頂空萃取30 min。

1.3.6.2 GC-MS條件

GC條件：色譜柱DB-WAX 60 m×2.5 mm×0.25 μm，進(jìn)樣口溫度240 ℃，傳輸線溫度230 ℃，離子源溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣；載氣(He)流速1 mL/min；進(jìn)樣時(shí)間5 min；柱溫升溫程序：40 ℃保持5 min，以3.5 ℃/min升至180 ℃，保持15 min。

MS條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度180 ℃；離子源溫度200 ℃；質(zhì)譜掃描范圍50～350m/z。

定性定量分析：通過NIST-11、Wiley及香精香料譜庫對(duì)香氣化合物質(zhì)譜圖進(jìn)行初步檢索比對(duì)，并結(jié)合人工圖譜解析進(jìn)行定性分析，確認(rèn)各個(gè)香氣物質(zhì)的化學(xué)成分。對(duì)已有標(biāo)準(zhǔn)品的高級(jí)醇、酯類和萜烯類等化合物，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2>0.995)定量，無標(biāo)準(zhǔn)品的化合物采用化學(xué)結(jié)構(gòu)、官能團(tuán)相似、碳原子數(shù)相近的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行半定量。

1.4 感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)參照GB/T 15037—2006[21]及祝霞等[20]的方法，對(duì)酒樣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。所有酒樣進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)，并由10名具有一定葡萄酒品嘗經(jīng)驗(yàn)或經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的人員(男、女各5人)對(duì)酒樣進(jìn)行感官評(píng)定。分別從外觀(澄清度、顏色強(qiáng)度)，香氣(花香、果香、甜味、脂肪味)和風(fēng)味(酸度、濃郁度、余味長短、平衡感)共10個(gè)方面對(duì)酒樣進(jìn)行評(píng)價(jià)，使用10分結(jié)構(gòu)化數(shù)值進(jìn)行量化。0～10分表示感官逐漸增強(qiáng)。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

香氣物質(zhì)數(shù)據(jù)作圖用Excel 2010和Origin 2018軟件。結(jié)果用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示，并用SPSS 19.0進(jìn)行主成分分析以及Duncan′s多重差異顯著性分析(P< 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水溶性β-葡聚糖對(duì)釀酒酵母生物量的影響

由圖1可知，隨著水溶性β-葡聚糖添加量的增加，Arome White釀酒酵母的生長速率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。酒精發(fā)酵3 d后，酵母的生長趨于穩(wěn)定；在發(fā)酵至第7 天時(shí)，釀酒酵母的OD600值由大到小依次為300 mg/L(2.509)>400 mg/L(2.461)>500 mg/L(2.398)>200 mg/L(2.271)>100 mg/L(2.221)>CK(2.046)，與對(duì)照組相比，分別提高了22.68%、20.28%、17.20%、11.00%、8.55%。其中300 mg/L的OD600值最大，分別是100、200 mg/L的1.13和1.10倍。 綜合分析，在模擬汁酒精發(fā)酵時(shí)添加水溶性β-葡聚糖有利于Aroma White釀酒酵母菌株的生長，且添加量為300、400、500 mg/L時(shí)效果更好，因此選擇這3個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行香氣化合物分析檢測。

圖1 水溶性β-葡聚糖對(duì)釀酒酵母生物量的影響

2.2 發(fā)酵酒樣基本理化指標(biāo)

由表1可知，對(duì)照組(CK)的酒精度最高；300 mg/L 處理組葡萄酒的總酸和揮發(fā)酸含量顯著低于CK(P<0.05)。4個(gè)處理組葡萄酒的色度間存在顯著差異，其中300 mg/L處理組酒樣色度值最低(0.38)，較對(duì)照降低了79.3%(P<0.05)。酵母多糖可以“包裹”酒中的多酚，降低其與單寧的作用，在某種程度上增加葡萄酒抗氧化的能力，從而間接的保護(hù)了葡萄酒的色澤穩(wěn)定[22-23]。綜合分析，各處理組發(fā)酵酒樣理化指標(biāo)均符合GB/T 15037—2006的要求[21]。

表1 酒樣基本理化指標(biāo)

2.3 霞多麗干白葡萄酒香氣成分檢測

不同處理組酒樣的主要香氣物質(zhì)GC-MS檢測結(jié)果如圖2所示。酒樣共檢測出69種香氣化合物，其中酯類35種，醇類20種，酸類5種，萜烯類3種，醛酮類6種。由表2可知，對(duì)照組(CK)檢出63種香氣化合物，總含量為26.22 mg/L，水溶性β-葡聚糖添加組(300、400、500 mg/L)分別檢測出64、63、64種香氣物質(zhì)，總量依次為53.71、49.66、45.15 mg/L。

2.3.1 酯類化合物

酯類物質(zhì)是酒精發(fā)酵過程中產(chǎn)生的主要次級(jí)代謝產(chǎn)物，分為乙酸酯、脂肪酸乙酯和其他酯類，對(duì)葡萄酒的花果香氣具有重要貢獻(xiàn)[24-25]。由圖2可知，酯類物質(zhì)含量隨水溶性β-葡聚糖濃度的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)。其中300 mg/L添加組共檢出32種酯類物質(zhì)，含量是對(duì)照組的2.10倍(34.55 mg/L)，其次為400、500 mg/L水溶性β-葡聚糖添加組，含量和種類都為(33.14 mg/L，32種)。

A-酯類物質(zhì)；B-醇類物質(zhì)；C-酸類物質(zhì)；D-萜烯類物質(zhì)；E-醛酮類物質(zhì)

實(shí)驗(yàn)共檢出9種乙酸酯。添加水溶性β-葡聚糖可顯著增加葡萄酒中乙酸酯類物質(zhì)總量，當(dāng)添加量為300 mg/L時(shí)，含量最高(11.46 mg/L)，是對(duì)照組的1.93倍。其中乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、乙酸己酯的氣味活性值(odor activity value，OAV)>0.1。乙酸乙酯是葡萄酒中重要的香氣物質(zhì)，其含量低于150 mg/L能夠增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性，各處理組中乙酸乙酯的含量為0.55～1.14 mg/L，其中300 mg/L添加組中乙酸乙酯的含量最高，是CK的1.66 倍。乙酸異戊酯和乙酸己酯能夠?yàn)槠咸丫茙硐憬逗屠娴认銡猓?00 mg/L添加組中這2種酯類物質(zhì)的含量最高，分別為6.67、1.31 mg/L。 乙酸苯乙酯在各處理組之間均存在顯著差異(P<0.05)，且300 mg/L水溶性β-葡聚糖添加組的含量最高，與CK相比，增加了38.46%。

實(shí)驗(yàn)共檢測出13種脂肪酸乙酯，是酯類物質(zhì)中種類最多，含量最高的物質(zhì)。由圖2可知，300和400 mg/L 水溶性β-葡聚糖添加組的脂肪酸乙酯含量較高，分別是CK組的2.20和2.35倍。其中，癸酸乙酯(果香，脂肪味)、辛酸乙酯(果香，茴香味)、己酸乙酯(香蕉，青蘋果味)、丁酸乙酯(香蕉，菠蘿味)等脂肪酸乙酯的OAV>0.1，賦予葡萄酒更濃郁的果香品質(zhì)。

2.3.2 高級(jí)醇類化合物

葡萄酒中的高級(jí)醇含量低于300 mg/L時(shí)，對(duì)葡萄酒香氣具有積極的作用[26]。實(shí)驗(yàn)共檢出20種高級(jí)醇類化合物，其中300 mg/L水溶性β-葡聚糖添加組的醇類物質(zhì)含量最高(17.85 mg/L)，是對(duì)照組的2.12倍，400、500 mg/L添加組的高級(jí)醇類化合物含量分別為15.38、14.64 mg/L，分別是對(duì)照組的1.83和1.74倍。正戊醇、正辛醇和苯乙醇的OAV>0.1。正戊醇為葡萄酒帶來雜醇味等獨(dú)特氣味，其中300 mg/L 處理組中含量最高(6.13 mg/L)，是CK的1.66倍。

2.3.3 酸類化合物

酸類物質(zhì)大部分來源于酵母菌和乳酸菌代謝的副產(chǎn)物[27]。實(shí)驗(yàn)共檢出5種酸類化合物，由圖2-C可知，添加水溶性β-葡聚糖顯著降低了葡萄酒中酸類物質(zhì)含量(P<0.05)，500 mg/L添加組的酸類物質(zhì)含量最低(0.70 mg/L)，與對(duì)照組相比，降低了40.17%。 300、400 mg/L添加組的酸類物質(zhì)含量分別為0.83、0.78 mg/L，分別比對(duì)照組降低了29.06%和33.33%。所檢測到的5種酸類物質(zhì)中，辛酸的含量比對(duì)照組降低了7.4%～19.5%，有利于減輕葡萄酒的酸敗味和脂肪味。

2.3.4 萜烯類化合物

酒樣中共檢測出香茅醇、芳樟醇和大馬士酮3種萜烯類物質(zhì)。其中300 mg/L處理組的萜烯類物質(zhì)總量最高(0.065 mg/L)，是CK組的2.27倍。其次為300、400 mg/L處理組，分別比對(duì)照組提升了33.21%和12.31%。芳樟醇和大馬士酮含量為0.014、0.022 mg/L，相比于CK組分別提升了9.7%、36.8%，能夠?yàn)槠咸丫铺峁┮欢ǖ拿倒寤ㄏ愫吞鹣鉡28-29]。

2.4 香氣成分的主成分分析

由于酒樣中檢測到的揮發(fā)性香氣物質(zhì)種類繁多，含量差異較大。為綜合分析添加不同質(zhì)量濃度水溶性β-葡聚糖的產(chǎn)香特征，故對(duì)香氣化合物中OAV>0.1的物質(zhì)進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)，并以特征值大于1進(jìn)行主成分抽提，得到PC1和PC2貢獻(xiàn)率分別為52.916%和28.586%。 2個(gè)主成分累計(jì)解釋總方差81.503%，即這2個(gè)主成分能基本反映原數(shù)據(jù)全部的變異(圖3、圖4)。

圖4 香氣化合物PCA的樣品分布圖

由圖3可知，乙酸苯乙酯(花果香)、乙酸己酯(果香)、辛酸乙酯(果香)、苯乙醇(玫瑰香，花香)、乙酸乙酯(香蕉味，果香)等物質(zhì)在PC1正半軸上的得分較高，即反映了葡萄酒中的花香和果香特征；異丁酸(脂肪味)、辛酸(奶油味)、丁酸(奶酪味)等物質(zhì)在PC1負(fù)半軸的得分較高，即反映了脂肪味等不良的香氣特征；芳樟醇(柑橘味，果香)、大馬士酮(花香)等物質(zhì)在PC2正半軸得分較高，即反映了花果香等香氣特征；癸醛(柑橘味，果香)、丁酸乙酯(香蕉，果香)、己酸乙酯(青蘋果，果香)等物質(zhì)在PC2負(fù)半軸得分較高，即反映了果香等香氣特征。

圖3 香氣化合物主成分分析的因子載荷圖

由圖4可知，處理組酒樣的香氣特征可在這2個(gè)主成分所形成的二維平面上被很好地分開，其中300 mg/L 處理組在PC1、PC2正半軸有較高得分，主要體現(xiàn)了脂肪酸乙酯和乙酸酯類物質(zhì)的香氣信息，因而其酒樣的花香、果香特征突出；400、500 mg/L處理組酒樣香氣特征相似，均在PC1正半軸有較高得分，但PC2得分較低，該區(qū)域突出的香氣特征是花香以及微弱的果香味。CK分布在PC1的負(fù)半軸區(qū)域，該區(qū)域最突出的香氣特征是脂肪味，且CK處理酒樣與其他處理組差異較大。綜合分析可知，酒精發(fā)酵前添加水溶性β-葡聚糖有利于改善葡萄酒香氣品質(zhì)單一、特點(diǎn)不突出等問題。

2.5 感官評(píng)價(jià)結(jié)果

由圖5可知，添加不同質(zhì)量濃度的水溶性β-葡聚糖對(duì)葡萄酒感官評(píng)價(jià)的影響不同。CK組酒樣中，除澄清度評(píng)分較高外，其余指標(biāo)評(píng)分均較低。從香氣(花香、果香、甜味、脂肪味)方面分析，添加水溶性β-葡聚糖能明顯增強(qiáng)酒樣的花香、果香和甜味特征，降低酒樣的脂肪味。整體來看，與CK組相比，添加水溶性β-葡聚糖更有利于提升葡萄酒的果香和花香特征，特別是300 mg/L處理組，可顯著改善葡萄酒的香氣特征。

圖5 霞多麗干白葡萄酒感官分析雷達(dá)圖

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)以霞多麗釀酒葡萄為原料，利用HS-SPME/GC-MS檢測外源性添加不同質(zhì)量濃度的水溶性β-葡聚糖，對(duì)發(fā)酵酒樣中揮發(fā)性香氣化合物的影響。結(jié)果顯示，水溶性β-葡聚糖能顯著增加葡萄酒中香氣物質(zhì)的含量(P<0.05)；其中添加300 mg/L的水溶性β-葡聚糖能夠顯著促進(jìn)葡萄酒中醇、酯類物質(zhì)的合成；主成分分析結(jié)合感觀分析結(jié)果表明，與對(duì)照組和其他處理組相比，300 mg/L組葡萄酒的花香和果香特征明顯增強(qiáng)提高了葡萄酒的感官品質(zhì)。研究結(jié)果可為提升霞多麗干白葡萄酒香氣品質(zhì)提供理論支持，但其對(duì)葡萄酒發(fā)酵香氣的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。