尹延順,姜欣,宋濤,孟君，張林，董建輝，皇甫潔,馮婧,楊親正,李紅*

1(齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 生物工程學院，山東 濟南，250353)2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015) 3(國家酒類品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心，北京，100015)4(株洲千金藥業(yè)股份有限公司千金研究院，湖南 株洲，412000)

果酒是以果實為原料，經(jīng)過破碎、壓榨取汁、發(fā)酵或者浸泡等工藝釀制而成的一種含有酒精的飲品。生產(chǎn)果酒不僅能解決水果生產(chǎn)過剩、銷售難的困境，還能提高原料的附加值，增加果農(nóng)的經(jīng)濟收益。目前果酒市場種類繁多，常見的除葡萄為原料外，還有蘋果、棗、柑橘等[1-3]。隨著生活水平的提高，人們對果酒的質(zhì)量提出了更高要求，兼?zhèn)涓郀I養(yǎng)價值和美好風味的果酒日益受到廣大消費者的青睞。通過使用木瓜，香蕉和西瓜生產(chǎn)混合果酒，改善了果酒的理化和感官特性[4]；TSEGAY等[5]通過添加馬纓丹果汁使果酒中總酚含量和感官值顯著提高。

果酒成分中的揮發(fā)性化合物在決定感官質(zhì)量方面起著關(guān)鍵作用，當然也會影響消費者的偏好[6]。果酒的香氣受多種因素控制，如水果類型、品種、氣候、酵母菌株和釀酒程序[7]。揮發(fā)性化合物的最終組合將定義果酒的特征香氣，并且將在根據(jù)其質(zhì)量區(qū)分果酒方面發(fā)揮重要作用。事實上，一些特定的揮發(fā)性化合物可能與不同品種果酒的獨特特征有關(guān)，例如，辛酸、大馬士革烯酮和乙酸異戊酯構(gòu)成了櫻桃酒的獨特品質(zhì)[8]。

許多方法能檢測分析果酒復雜的風味物質(zhì)，如同時蒸餾萃取法、頂空固相微萃取法(headspace solid-phase micro extraction, HS-SPME)、攪拌棒吸附萃取法、吹掃捕集法等[9]。HS-SPME是一種快速、靈敏、無溶劑的方法，廣泛應(yīng)用于提取蔬菜和水果的香氣[10]，和其他樣品處理方法相比,具有操作簡便、測試迅速, 不需有機溶劑，集樣品萃取、濃縮為一體等優(yōu)點,其常與GC-MS一起使用測定果酒中的揮發(fā)性成分。

偏最小二乘法(partial least squares regression, PLSR)基于高維投影思想，通過提取主成分的方法對系統(tǒng)中的數(shù)據(jù)信息進行分解和篩選，實現(xiàn)對系統(tǒng)解釋性最強的綜合變量的有效抽??；PLSR可進行樣本量小、變量間存在多重相關(guān)性的數(shù)據(jù)處理[11]，常用于感官屬性與揮發(fā)性化合物關(guān)系的模型建立。陳義等[12]采用PLSR對信陽毛尖中的香氣成分與感官之間的關(guān)系進行了研究，有效確定了信陽毛尖香氣的等級劃分。牛云蔚等[13]通過PLSR對不同產(chǎn)地櫻桃酒中特征呈味物質(zhì)與感官屬性之間的相關(guān)性進行研究，結(jié)果表明感官屬性與部分特征呈味物質(zhì)顯著相關(guān)。

雖然人們對果酒中揮發(fā)性物質(zhì)的提取和鑒定進行了大量的研究，但對儀器分析與感官評定之間的關(guān)系以及復合果酒與單一果酒的比較研究較少。本研究旨在探索和表征單一果酒和復合果酒的化學成分和感官特性。文章研究了風味成分與感官特性之間的關(guān)系，并對感官特性的影響因素進行了探討。將為復合果酒風味特征研究及產(chǎn)品的開發(fā)和推廣提供有價值的參考信息。

1 材料與方法

1.1 果酒樣品

從市場購買了4種含有相同原料葡萄的果酒樣品，包括W1、W2、W3三種復合果酒和W4 單一型果酒。通過添加額外水果探究對其果酒風味成分和感官的影響。果酒的描述和編號如表1所示。

表1 研究中使用的果酒說明

1.2 儀器與設(shè)備

ICS-3000離子色譜系統(tǒng)，美國Dionex公司；MPS-2自動進樣器，德國Gerstel公司；聚四氟乙烯硅隔板，英國Chromacol公司；IKA RCT堿性磁力攪拌器，德國Werke GmbH公司；島津GC-2010氣相色譜儀、MS-QP 2010 Plus質(zhì)譜儀，日本島津公司。

1.3 果酒質(zhì)量參數(shù)分析

每個樣品的pH值由pH計測量?？傻味ㄋ岫?titratable acid，TA)測定為0.1 mol/L NaOH滴定至pH=8.2為其終點，并以酒石酸(g/L)表示。有機酸的鑒定/分析采用ICS-3000離子色譜系統(tǒng)。采用Ionpac AS11-HC型分離柱(250 mm×4 mm) 和Ionpac AG11-HC型保護柱(50 mm×4 mm)， 樣品體積為25 μL，通過與已知純化合物的保留時間和標準曲線(R2>0.99)進行鑒別和定量。所有樣品分析一式三份。

1.4 HS-SPME

使用MPS-2自動進樣器提取揮發(fā)性芳香化合物。在250 ℃的氣相色譜進樣口對SPME纖維進行1 h的預(yù)處理。在對纖維涂層、提取時間、提取溫度和樣品體積/頂空體積比進行深入優(yōu)化后，將4 mL樣品轉(zhuǎn)移到15 mL的SPME玻璃小瓶中。隨后添加2-辛醇內(nèi)標溶液(5 μL，104.46 mg/L)和NaCl(1.0 g)，用聚四氟乙烯硅隔板蓋住小瓶，用IKA RCT堿性磁力攪拌器在40 ℃下以120 r/min 攪拌樣品20 min，平衡揮發(fā)性化合物，然后在相同溫度和攪拌下提取30 min。將纖維立即插入氣相色譜進樣口，在250 ℃下解吸揮發(fā)物8 min。

1.5 GC-MS

解吸后的揮發(fā)性化合物在氣相色譜儀中分離，該儀器配備有DB-5毛細管柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)和MS-QP 2010 Plus質(zhì)譜儀。載氣為氦氣，流速為1 mL/min， 裂解比為1∶2。氣相色譜烘箱溫度條件為：40 ℃烘3 min，3 ℃/min升至165 ℃，保持1 min，10 ℃/min升至220 ℃，保持5 min。

MS系統(tǒng)中傳輸線、四極和電離源的溫度分別為280、150、230 ℃；在70 eV電離電壓下記錄電子碰撞質(zhì)譜。采集以全掃描模式(30～350 amu)進行。

1.6 感官分析

感官評價在中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院感官實驗室進行，采用定量描述感官評價法對果酒樣品進行感官評價，評價小組由10名專業(yè)品評成員(均有1年以上酒類品評經(jīng)驗)組成，4 名男性和6名女性，年齡在28～45歲。評價人員根據(jù)ISO4121標準進行了培訓，分別對4款果酒的 8種感官屬性進行評價，包括花香、果香、麥芽香、辛辣味、乳酸味、乙酸味、甜味和苦味(表2)；呈味強度采用5分制打分(0分表示沒有味道，5分表示味道最強)，記錄各評價人員的評價打分結(jié)果。每個樣品在不同日期重復評價3次。

表2 感官屬性及相應(yīng)參考標準一覽表

1.7 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均表示為3次平行的平均值。數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2019和SPSS 23.0。經(jīng)方差分析，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.05)。使用The Unscrambler X 10.4進行PLSR分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 果酒質(zhì)量參數(shù)分析

4種果酒樣品的有機酸成分如表3所示，酒精含量如表1所示。對影響果酒質(zhì)量的TA、pH和有機酸進行了分析。所有變量在樣本間均有顯著性差異(P<0.05)。 果酒的乙醇體積分數(shù)為11%～12%，pH值為3.26～3.52。酒精含量和pH值的差異已被證明會影響人們對果酒中某些香氣的感知。TA為4.90～ 7.91 g/L，W2最高，W4最低，但是整體之間差距并不大，本研究中選用相近基本理化指標的樣品可降低其他因素對最終香氣的影響。

表3 四種果酒中的有機酸成分

酸度被認為是果酒的基本要素，應(yīng)該足以給最終產(chǎn)品帶來干凈、清爽的印象[14]。在4種果酒中檸檬酸和蘋果酸含量最高，乙酸含量也較高，W3的乙酸含量明顯高于其他樣品，達到了2.96 g/L。蘋果酸在蘋果酸乳酸發(fā)酵過程中會轉(zhuǎn)化為乳酸，通過將蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸，減少生果酒的酸澀和粗糙感，使得果酒的口感更加柔和、圓潤。乳酸和蘋果酸的含量可以用來指示葡萄酒中蘋果酸乳酸發(fā)酵的程度[15]。W3中乳酸含量較高，說明其蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程較好。檸檬酸可以用來調(diào)節(jié)酒類產(chǎn)品的酸度，其中以W2的含量最高。W2變酸可能是檸檬酸所致。

2.2 不同果酒中揮發(fā)性風味物質(zhì)成分的鑒定與表征

果酒樣品中檢測到的揮發(fā)性風味物質(zhì)成分如表4所示。所有這些化合物均根據(jù)其質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行了表征。經(jīng)初步鑒定，共有15種化合物為風味物質(zhì)成分，包括8種醇、4種醛、縮醛、酮和3種酯。W3(826.68 mg/L)和W1(548.6 mg/L)的總風味物質(zhì)成分含量分別最高和最低。

表4 四種果酒風味物質(zhì)成分及含量 單位：mg/L

2.2.1 醇分析

酵母發(fā)酵導致形成許多醇，也稱為雜醇，主要由C3～C5直鏈醇，支鏈醇和苯基醇組成，它們產(chǎn)生于氨基酸的脫羧和脫氨基以及糖的分解代謝[16]。據(jù)報道，氨基酸的組成取決于釀酒原料。因此，這些揮發(fā)性化合物與所用原料有關(guān)[17]。這些果酒中醇的含量從 410.4 mg/L(W1)～557.05 mg/L(W3)。對于單個醇，甲醇和異戊醇是所有果酒樣品中發(fā)現(xiàn)的最多的，尤其是在W4和W3中。其次是異丁醇和正丙醇。

2.2.2 醛、縮醛和酮分析

醛類、縮醛和酮類的含量相對較低，例如，這些化合物的含量在不同果酒中分別為28.4～106.34 mg/L。盡管它們的含量很低，但這些化合物與其他化合物結(jié)合，可能會產(chǎn)生奇妙的芳香，有助于增強整體芳香的復雜性和平衡性[18]。主要醛類為乙醛，特別是在W2(72.5 mg/L)中?？啡﹥H在W2中被檢測出來。

2.2.3 酯分析

在本研究中，不同果酒中酯的總含量差別較大，為70.2 mg/L(W2)～230.2 mg/L(W4)。對于單個酯，在總酯中W4乳酸乙酯含量最高，為174.4 mg/L。在這些果酒中同時還檢測到了丁二酸二乙酯、乙酸乙酯，據(jù)報道，這些酯屬于發(fā)酵性化合物[19]，尤其是乙酸乙酯，它似乎是許多品種的重要香氣成分。由發(fā)酵過程中酵母產(chǎn)生的?；o酶A形成的乙酸酯和乙酯，為果酒提供了獨特的水果和植物香味[20]。

2.3 不同果酒中的活性氣味劑

果酒中存在大量的芳香揮發(fā)性化合物，其風味強度取決于濃度和閾值[21-22]。盡管不同香氣成分之間可能發(fā)生相互作用，但只有有限數(shù)量的氣味活性值(odor activity values，OAV)>1的揮發(fā)物可以被視為香氣貢獻者以及活性氣味劑[23-25]。如表5所示，計算了14種揮發(fā)性化合物的OAV，根據(jù)從參考文獻中獲得的每種香氣的氣味閾值，在所調(diào)查的14種揮發(fā)性化合物中，有11種化合物OAV>1。

表5 根據(jù)氣味閾值測定果酒中揮發(fā)性香氣化合物的OAV

醇類和醛酮類化合物是果酒活性香氣的主要來源。與其他果酒相比，在W4(8 295.7 mg/L)中獲得的醇值最高，其次是W1和W2(5 137.3～5 343.9 mg/L)。β-苯乙醇和甲醇是活性最強的醇。其中，β-苯 乙醇在所有觀察到的果酒中值都較高，特別是在W4(6 292.5 mg/L)中。此外，果酒的香氣也主要來自醛酮類，尤其是乙醛(800.0～2 900.0 mg/L)。相比之下，高濃度和高閾值的酯對果酒香氣的貢獻較小(OAV<2)。

2.4 感官分析

對果酒感官評價數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果表明，不同果酒樣品的8種感官指標均存在顯著差異(P<0.05)。圖1為不同果酒感官特性分析雷達圖，總體來看，復合型果酒(W1，W2，W3)比單一型果酒(W4)的香氣更為豐富、濃郁。4款果酒在花香、甜味、乙酸味和乳酸味差異較大；而在果香、辛辣味和麥芽香幾個感官特性上差異較小?；ㄏ恪⒐愫吞鹞对赪1和W2中更突出，而W3中的乳酸味、乙酸味和苦味較為突出。

2.5 感官屬性與化學成分的相關(guān)性

PLSR分析研究了感官屬性(Y矩陣)和揮發(fā)性化合物(X矩陣)之間的關(guān)系[26-27]。在本研究中，87%的X方差(揮發(fā)性化合物)和82%的Y方差(感官屬性和樣品)可以在PLSR模型中得到解釋(圖2)。圖2-b展示了相關(guān)載荷圖，其中內(nèi)橢圓表示50%的解釋方差，而外橢圓表示100%的解釋方差。大多數(shù)感官描述和揮發(fā)性化合物位于2個橢圓形之間的圖形中，根據(jù)之前的一項研究，內(nèi)橢圓形內(nèi)的化合物建模不佳，無法解釋感官數(shù)據(jù)的變化[28]。位于2個橢圓形之間的感官描述符和揮發(fā)性化合物表明，可以用PLSR模型很好地解釋兩者之間的相關(guān)性。

a-果酒PLSR評分曲線；b-香氣成分和感官屬性的相關(guān)載荷圖

W3位于PC1正值和PC2正值處，它的特征是具有乳酸味、乙酸味、苦味和麥芽香的感官特性，與圖1中得分最高的感官評價結(jié)果一致，這4種氣味描述并與乙醛、正丁醇、正丙醇和異戊醇等揮發(fā)性化合物有關(guān)。W2位于PC1正值和PC2負值處，它的特征是具有花香、果香和甜味的感官特性，并與糠醛、異丁醇等揮發(fā)性化合物有關(guān)，這一結(jié)果與和先前的研究結(jié)果一致[29]。然而，W1的感官描述與揮發(fā)性成分之間的相關(guān)性較弱，可能是受復雜成分的影響，有待進一步研究。

圖1 果酒感官屬性強度的雷達圖

3 總結(jié)

本研究采用HS-SPME和GC-MS分析，對含有相同原料的3種復合果酒和一種單一果酒的香氣成分進行了表征。共鑒定出15種揮發(fā)性化合物，其中大部分高濃度的化合物來源于不同的發(fā)酵過程，如醇類、乙酯類。此外，還計算了14種量化揮發(fā)性化合物的OAV，并測定了11種可能造成影響的氣味劑(OAV>1)。感官屬性的強度由專業(yè)評估人員完成，與單一果酒W4相比，復合果酒W1、W2、W3的香氣更濃郁、更豐富。在PLSR模型中，對W2和W3的香氣特征進行了識別和呈現(xiàn)。相比之下，W4沒有發(fā)現(xiàn)明顯的特征。這些結(jié)果表明，復合果酒比單一果酒具有更豐富的香氣特征。本研究對復合果酒中的關(guān)鍵香氣成分進行了深入的探討。PLSR可以用來描述果酒的香氣成分與感官特性之間的關(guān)系。