宋美潔，吳翠玲，趙柳微，吳黎明，盧煥仙，薛曉鋒*

1(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京，100093) 2(安捷倫科技(中國(guó))有限公司，北京，100102)3(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南 紅河哈尼族彝族自治州，661100)

紅霉素(erythromycin A，EA)是由鏈霉素所產(chǎn)生的一種堿性大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，在酸性條件下易降解產(chǎn)生多種副產(chǎn)物，如脫水紅霉素、紅霉素A烯醇醚和偽紅霉素A烯醇醚等[1]。在蜂業(yè)生產(chǎn)中，紅霉素被用于防治意蜂的美洲幼蟲腐臭病，特別是對(duì)土霉素有抗性的美洲幼蟲腐臭病[2]。紅霉素的不合理使用導(dǎo)致紅霉素及其降解物在蜂產(chǎn)品中殘留，對(duì)蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全和人體健康帶來(lái)潛在風(fēng)險(xiǎn)。

紅霉素的降解產(chǎn)物不具有抗微生物特性，且脫水紅霉素和紅霉素A烯醇醚被認(rèn)為是人類在紅霉素治療中產(chǎn)生胃腸不適的原因[3]。蜂蜜的pH為3.3～6.5[4]，蜂王漿的pH為4.0～4.5[5]，兩者均為酸性介質(zhì)，紅霉素極易在其中降解殘留，引發(fā)人體過(guò)敏反應(yīng)等不良副作用[6]。但目前尚未有紅霉素降解物殘留測(cè)定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)參考，因此，建立蜂蜜和蜂王漿中紅霉素及其降解物殘留的分析方法對(duì)于監(jiān)測(cè)蜂產(chǎn)品中紅霉素殘留情況以及保障蜂產(chǎn)品的消費(fèi)安全具有實(shí)際意義。

目前，關(guān)于對(duì)蜂蜜和蜂王漿中紅霉素及其降解物的定量檢測(cè)方法報(bào)道較少，在我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)中關(guān)于紅霉素的測(cè)定方法主要是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，前處理技術(shù)主要采用固相萃取法[6-10]，但操作步驟繁瑣、試劑消耗量大，不適于批量樣品檢測(cè)。QuEChERS(quick, easy, cheap, effective, rugged, safe)法是集萃取和凈化為一體的前處理技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便快速、環(huán)境友好、檢測(cè)高效等優(yōu)點(diǎn)，常用于提取食品中的農(nóng)藥和獸藥殘留等化學(xué)污染物[11-12]。但尚無(wú)使用QuEChERS法同時(shí)提取蜂產(chǎn)品中紅霉素及其降解物的研究，故本研究采用QuEChERS法，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，建立了蜂蜜和蜂王漿中紅霉素及其降解物的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290超高效液相色譜儀、6495三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；萬(wàn)分之一天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；CR22G 高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司；G560E渦旋混勻器，美國(guó)Scientific Industries 公司。

甲醇和乙腈(色譜純)，德國(guó)Merck公司；甲酸(色譜純)，美國(guó)Fluka公司；紅霉素、脫水紅霉素、偽紅霉素A烯醇醚和紅霉素A烯醇醚標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)，加拿大 TRC公司。

稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，在避光條件下，分別用甲醇配制成1 000 mg/L的儲(chǔ)備液并儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱中(現(xiàn)配現(xiàn)用)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用乙腈稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 樣品前處理

分別稱取5.00 g(精確到0.01 g)蜂蜜樣品或2.00 g (精確到0.01 g)蜂王漿樣品于50 mL離心管中，加入5 mL水使樣品完全溶解，加入10 mL乙腈經(jīng)渦旋1 min，超聲提取10 min后，加入脫水試劑 (4 g無(wú)水硫酸鈉和1 g氯化鈉)，渦旋振蕩1 min，以8 000 r/min離心10 min，取5.0 mL上清液于分散固相萃取管 [400 mg N-丙基乙二胺(primary secondary amine, PSA)+1 200 mg 無(wú)水硫酸鎂]，渦旋混勻1 min后于8 000 r/min速率下離心10 min，所得上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.3 測(cè)定條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×100 mm×2.7 μm)；流動(dòng)相 A：含0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸的水溶液；流動(dòng)相 B：甲醇；梯度程序：0～1 min： 55%～60% B，1～4 min：60%～75% B，4～5 min： 75%～98% B，5～7 min：98% B；進(jìn)樣量：2 μL； 柱溫：30 ℃；運(yùn)行時(shí)間：7 min；流速：0.3 mL/min；后運(yùn)行時(shí)間：2 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧正離子模式(ESI+)；多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)；離子源溫度：250 ℃；干燥氣流速：15 L/min；干燥氣壓力：45 psi；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：12 L/min；離子源電壓：3 500 V；紅霉素及其降解物的定性，定量離子對(duì)等質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將配制的紅霉素及其降解物的標(biāo)準(zhǔn)貯備液稀釋成質(zhì)量濃度為 500 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用ESI+對(duì)其進(jìn)行全掃描。進(jìn)入一級(jí)質(zhì)譜后，得到穩(wěn)定的紅霉素及其降解物4種物質(zhì)的[M+H]+離子峰，進(jìn)一步對(duì)子離子、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。獲得紅霉素、脫水紅霉素、偽紅霉素A烯醇醚和紅霉素A烯醇醚的二級(jí)質(zhì)譜全掃描圖后，選擇離子豐度最高、基質(zhì)干擾最小的2個(gè)離子對(duì)作為特征離子對(duì)，將信號(hào)響應(yīng)最高的離子對(duì)作定量離子，響應(yīng)次高的作定性離子。設(shè)定合適的峰駐留時(shí)間確保色譜峰的采樣點(diǎn)數(shù)在15～20點(diǎn)，從而得到較好的定量重復(fù)性，進(jìn)行樣品分析時(shí)結(jié)合化合物的保留時(shí)間。得到的離子對(duì)及其對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 紅霉素及其降解物的保留時(shí)間及質(zhì)譜分析參數(shù)

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)選擇了甲醇-0.1%甲酸水溶液，0.1%甲酸水-乙腈組成的流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)0.1%的甲酸水和甲醇為流動(dòng)相時(shí)，4種物質(zhì)的離子化效率最佳。為了降低基質(zhì)干擾，增強(qiáng)分離度以及延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，在優(yōu)化梯度洗脫程序后，實(shí)現(xiàn)了紅霉素及其降解物的良好分離。得到的TIC圖譜如圖1所示。

a-紅霉素A；b-脫水紅霉素；c-偽紅霉素A烯醇醚；d-紅霉素A烯醇醚A-蜂蜜空白；B-蜂王漿空白；C-蜂蜜樣品；D-蜂王漿樣品

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

蜂蜜的主要成分為糖類物質(zhì)，此外還含有少量的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、有機(jī)酸、類胡蘿卜素、酶和芳香物質(zhì)等[13]。蜂王漿中含有多種生物活性物質(zhì)，如游離氨基酸、蛋白質(zhì)、糖、脂肪酸、礦物質(zhì)和維生素等，其中蛋白質(zhì)占新鮮蜂王漿的12%～15%[14]?；|(zhì)較為復(fù)雜，為了提高蜂蜜和蜂王漿中紅霉素及其降解物的提取效率，降低基質(zhì)干擾，應(yīng)盡可能地除去糖類、蛋白和脂類干擾物，建立穩(wěn)定、可靠、回收率高的樣品前處理方法。

2.2.1 提取溶劑的選擇

乙腈和弱酸性緩沖溶液在QuEChERS方法中常被用作提取溶劑，但紅霉素易溶于極性有機(jī)溶劑且在酸性條件下不穩(wěn)定。試驗(yàn)分別選擇甲醇、乙腈和乙酸乙酯作為提取試劑進(jìn)行考察。結(jié)果表明，相對(duì)于甲醇提取液來(lái)說(shuō)，乙腈提取液較易分層，水分較少。原因在于乙腈對(duì)糖的溶解性較小，在水中的溶解度低于甲醇，且具有沉淀蛋白的作用。而將乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)，產(chǎn)生嚴(yán)重乳化現(xiàn)象，回收率低，重復(fù)性差。因此，最終選擇乙腈作為本研究的提取劑。此外，根據(jù)相關(guān)研究[15]，鹽析劑選用了4 g 硫酸鈉和1 g 氯化鈉，在去除水分的同時(shí)，可促進(jìn)提取液乙腈層和水層的分離。

2.2.2 凈化條件的優(yōu)化

萃取溶液中干擾物的存在可能會(huì)影響色譜分離，并增強(qiáng)或降低目標(biāo)分析物的離子信號(hào)，也會(huì)導(dǎo)致離子源的污染。為了解決這個(gè)問(wèn)題，研究選擇了不同的吸附劑進(jìn)行組合凈化。無(wú)水MgSO4、PSA、C18和石墨化炭黑(graphitized carbon black,GCB)是常用的吸附劑材料。PSA 在硅膠上鍵合了乙二胺-N-丙基官能團(tuán)，主要作用是去除蜂蜜、蜂王漿提取物中的極性色素、脂肪酸、有機(jī)酸和糖類物質(zhì)[16]。MgSO4作為一種干燥劑，可用于去除有機(jī)溶劑中的痕量水[17]，樣品含水量越少PSA凈化效果越好，結(jié)合合適的無(wú)水MgSO4用量能發(fā)揮更好的凈化作用。C18產(chǎn)生強(qiáng)非極性相互作用，可以吸附蜂蜜和蜂王漿中的一些脂質(zhì)等非極性、弱極性的化合物[18]。GCB具有特殊的層狀結(jié)構(gòu)，對(duì)去除色素以及固醇類雜質(zhì)有很好的效果[19]。

試驗(yàn)比較了MgSO4+PSA、MgSO4+PSA+C18和MgSO4+PSA+C18+GCB的凈化效果。稱取一定量的蜂蜜、蜂王漿樣品并加標(biāo)，考察在相同量下，使用不同混合比例的分散劑對(duì)加標(biāo)回收率的影響，結(jié)果見圖2。 在有GCB和C18吸附劑存在的條件下，紅霉素在蜂蜜和蜂王漿基質(zhì)中的回收率較低，且明顯低于脫水紅霉素、偽紅霉素A烯醇醚和紅霉素A烯醇醚3種降解物，說(shuō)明對(duì)紅霉素具有吸附作用。在對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行凈化時(shí)，考慮到蜂蜜中的脂質(zhì)較少，首先采用150 mg PSA+900 mg MgSO4的吸附劑，發(fā)現(xiàn)4種目標(biāo)物質(zhì)在蜂蜜樣品中的回收率均低于70%，顯然凈化效果不夠，而后選擇了400 mg PSA+1 200 mg MgSO4比例的吸附劑，發(fā)現(xiàn)回收率顯著高于前者。在對(duì)蜂王漿樣品進(jìn)行凈化時(shí)，首先采用400 mg PSA+1 200 mg MgSO4+400 mg C18EC的吸附劑，發(fā)現(xiàn)紅霉素和偽紅霉素A烯醇醚的回收較低，說(shuō)明C18對(duì)兩者具有吸附作用。之后采用400 mg PSA+1 200 mg MgSO4的吸附劑，紅霉素回收率顯著提高。因此，綜合蜂蜜和蜂王漿樣品中紅霉素及其降解物脫水紅霉素、偽紅霉素A烯醇醚和紅霉素A烯醇醚的回收率情況，最終選擇了400 mg PSA+1 200 mg MgSO4的吸附劑。

A-蜂蜜；B-蜂王漿

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍、檢出限和定量限

基質(zhì)效應(yīng)是基質(zhì)共提物干擾目標(biāo)化合物的離子化，使得目標(biāo)化合物在儀器上的響應(yīng)發(fā)生了增強(qiáng)或者抑制的現(xiàn)象，從而影響目標(biāo)物的定量測(cè)定。本研究采用提取后加入法和絕對(duì)基質(zhì)相應(yīng)法來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect,ME)計(jì)算如公式(1)所示[20]：

(1)

以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線和溶劑校準(zhǔn)曲線，計(jì)算并評(píng)價(jià)了紅霉素及(其降解物在蜂蜜和蜂王漿中的基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)ME<-20%時(shí)，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)；-20%≤ME≤20% 時(shí)，表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)；ME>20% 時(shí)，表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。

按照建立的樣品前處理方法處理空白樣品，用得到的空白基質(zhì)提取液將標(biāo)準(zhǔn)工作液逐級(jí)稀釋至0.2、2.0、5.0、10.0、50.0和100.0 ng/mL，獲得基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液；同時(shí)用乙腈稀釋標(biāo)準(zhǔn)工作液至0.2、2.0、5.0、10.0、50.0和100.0 ng/mL，獲得溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。如表2所示，在0.2～100 ng/mL線性范圍內(nèi)蜂王漿基質(zhì)標(biāo)線性關(guān)系良好，在0.2～50 ng/mL線性范圍內(nèi)蜂蜜基質(zhì)標(biāo)線性關(guān)系良好。ME值為-51%～2%， 表明存在基質(zhì)效應(yīng)。因此，選用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)蜂蜜和蜂王漿中的紅霉素及其降解物進(jìn)行定量。用MassHunter定量軟件計(jì)算得到各目標(biāo)化合物線性回歸方程及其相關(guān)系數(shù)。如表2所示，各化合物的線性關(guān)系良好，均大于0.99。相關(guān)研究報(bào)道方法中，蜂蜜中紅霉素A、紅霉素 A 烯醇醚和脫水紅霉素 A 的檢出限、定量限分別為0.5和2.0 μg/kg[7]；蜂王漿中紅霉素 A、紅霉素 A 烯醇醚、脫水紅霉素A的檢出限和定量限分別為0.5和5.0 μg/kg[6]，而本研究建立了同時(shí)測(cè)定蜂蜜和蜂王漿中紅霉素 A、紅霉素 A 烯醇醚、脫水紅霉素 A和偽紅霉素A烯醇醚4種化合物的檢測(cè)方法，檢出限[信噪比(S/N≥3)]為0.2～0.63 μg/kg，定量限(S/N≥10)為0.5～1.9 μg/kg，與先前研究相比，本方法具有更低的檢出限和定量限。

表2 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較

2.3.2 準(zhǔn)確度和精密度

由于蜂王漿和蜂蜜成分復(fù)雜，且組分存在差異，故對(duì)樣品的稱樣量進(jìn)行了優(yōu)化，分別稱取5 g蜂蜜和2 g蜂王漿進(jìn)行后續(xù)前處理操作，在蜂蜜和蜂王漿樣品中分別添加5.0、10.0、25.0 μg/L的紅霉素及其降解物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)濃度設(shè)定6個(gè)平行，并做空白實(shí)驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用空白基質(zhì)樣品前處理后添加標(biāo)準(zhǔn)品并制備成系列工作溶液的方法進(jìn)行測(cè)定和繪制，考察了紅霉素及其代謝物的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)。研究發(fā)現(xiàn)不同添加濃度的分析物平均回收率范圍為70%～93%，RSD≤4.0%。方法具有良好的回收率和重現(xiàn)性，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)蜂蜜和蜂王漿基質(zhì)中紅霉素及其降解物的準(zhǔn)確分析測(cè)定。

表3 紅霉素及其降解物蜂蜜、蜂王漿基質(zhì)中的添加回收率

2.4 實(shí)際樣本的測(cè)定

從市場(chǎng)分別抽檢30個(gè)蜂蜜和蜂王漿樣品，應(yīng)用本方法進(jìn)行檢測(cè)，以保留時(shí)間和碎片離子定性，外標(biāo)法定量，結(jié)果表明，紅霉素及其降解物均未檢出。

3 結(jié)論

本文通過(guò)優(yōu)化色譜條件、質(zhì)譜條件、QuEChERS方法的提取溶劑和凈化吸附材料，實(shí)現(xiàn)了基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)蜂蜜和蜂王漿中紅霉素及其降解物殘留的定性定量。本法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單，方法檢出限為0.2～0.63 μg/kg，定量限為0.5～1.9 μg/kg，回收率為70%～93%，RSD為0.4%～4.0%。方法已經(jīng)應(yīng)用于實(shí)際樣品測(cè)定，抽檢的樣品中未檢測(cè)到紅霉素及其代謝物。建立的方法可以形成標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法用于蜂蜜和蜂王漿中紅霉素及其降解產(chǎn)物的日常檢測(cè)。