祝霞，宋茹茹，宋欣芫，李潔春，楊學山*

1(甘肅農業(yè)大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070) 2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室，甘肅 蘭州，730070)

葡萄酒釀造是以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)主導的一系列復雜的微生物代謝和生物轉化過程，其細胞活力對發(fā)酵酒樣中代謝產物的形成具有重要影響[1]。S.cerevisiae生命周期較短，快速衰老會導致發(fā)酵不徹底，揮發(fā)性化合物的合成和分泌能力大大降低，從而嚴重影響葡萄酒的香氣與感官品質[2]。氧化應激是導致細胞損傷、衰老和死亡的主要原因之一[3]。S.cerevisiae具有一定的氧化應激反應能力，可以通過多種途徑保護自身免受各種脅迫，如通過抗氧化酶的水平，包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)等來體現(xiàn)其對氧化應激的適應性反應；也可以通過產生谷胱甘肽(glutathione，GSH)等非酶類自由基清除劑，保護細胞不被氧化[4-5]。甘露聚糖及其衍生物在體外可以高效清除多種自由基，其中清除超氧陰離子自由基的能力接近維生素C，具有良好的抗氧化活性[6]。RODRIGUEZ-NOGALES等[7]通過添加甘露聚糖和商業(yè)酵母制劑，增加了起泡葡萄酒的抗氧化性能。同時，外源性添加甘露聚糖對葡萄酒香氣復雜性和風格獨特性也具有積極影響。COMUZZO等[8]研究表明，添加低質量濃度的甘露聚糖可以增加葡萄酒中酯類物質含量，而較高質量濃度(500 mg/L)會增加羧酸含量，帶給葡萄酒不愉快的氣味。李惠琳等[9]比較了4種酵母多糖對霞多麗干白葡萄香氣的影響，結果顯示甘露聚糖可增加葡萄酒香氣的濃郁度和復雜性?？傮w而言，目前關于酵母甘露聚糖對葡萄酒香氣品質提升方面的研究較多，但關于甘露聚糖如何通過影響S.cerevisiae生長及抗氧化性，從而改變酒體香氣合成釋放的內在機制研究鮮有報道。

本研究以模擬葡萄汁為原料，考察外源性添加甘露聚糖對S.cerevisiae菌株生長及細胞完整性的影響，初步探討酒精發(fā)酵過程中S.cerevisiae菌株抗氧化活性的動態(tài)變化規(guī)律，以期為進一步研究甘露聚糖對葡萄酒發(fā)酵香氣的調控機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母Aroma White，意大利Enartis公司；甘露聚糖MP 60，安琪酵母股份有限公司。

ATP酶、SOD活性測定試劑盒、活性氧(reactive oxygen species, ROS)、GSH、丙二醛(malondialdehyde, MDA)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；纖維二糖、磷酸氫二銨、酒石酸氫鉀、檸檬酸、磷酸氫二鉀等試劑均為分析純，天津光復化工研究所。

1.2 儀器與設備

SCIENTZ-ⅡD超聲破碎機，寧波新芝生物科技有限公司；H2050R高速冷凍能夠離心機，湘儀離心機儀器有限公司；Genesis 10s紫外-可見分光光度計，美國Thermo Scientific公司；日立F-4700熒光分光光度計，日立高新技術公司；Bluepard生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；DK-S12電熱恒溫水浴鍋，上海森信試驗儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 模擬葡萄汁的配制

參考祝霞等[10]的方法。葡萄糖200 g/L、纖維二糖0.2 g/L、磷酸氫二銨1.5 g/L、酒石酸氫鉀2.5 g/L、L-蘋果酸3.0 g/L、檸檬酸0.2 g/L、磷酸氫二鉀1.14 g/L、 硫酸鎂1.23 g/L。

1.3.2 甘露聚糖對釀酒酵母菌株生物量和活力的影響

在2 L的模擬葡萄汁(2.5 L棕色罐)中，分別添加100、200、300、400、500 mg/L的甘露聚糖(編號分別為MP1～MP5)，以不添加酵母多糖為對照(CK)。按照推薦用量0.2 g/L接種Aroma White，25 ℃ 控溫發(fā)酵，每隔24 h測定模擬汁中酵母細胞的生物量(OD600)，繪制菌株生長曲線。每個樣品設置3組平行，結果取平均值。下同。

在模擬葡萄汁中分別添加100、200、300、400、500 mg/L(MP1～MP5)的甘露聚糖，以不添加酵母多糖為對照(CK)，25 ℃控溫發(fā)酵。根據(jù)前期預實驗結果，自接種開始2、4、7 d分別對應菌株生長的前、中、后期，參照文獻[11]酵母活力測定方法，檢測3個生長時期酵母菌株活力，分析甘露聚糖對S.cerevisiae細胞活力的影響。

1.3.3 酵母細胞抗氧化活性測定

1.3.3.1 酵母細胞中ATP酶活性測定

參照符安[12]的方法并做修改，收集酵母細胞，3 500 r/min 離心10 min，傾倒上清液，用5 mL生理鹽水(0.9%)洗滌3次后稱重，加入生理鹽水，冰水浴超聲破碎(4 ℃，40%功率，開啟5 s，停止7 s，共計1 min)， 制成0.063 g/mL的勻漿，按照試劑盒說明書進行測定。

1.3.3.2 酵母細胞中SOD活性測定

收集酵母細胞，用20倍體積的PBS，1 000 r/min離心10 min洗滌酵母細胞。重復2次后，再加入20倍 體積的生理鹽水以3 500 r/min離心10 min，冰水浴條件下超聲破碎，制成10%的細胞勻漿，再將勻漿稀釋5倍，按照試劑盒說明書進行測定。

1.3.3.3 酵母細胞中ROS含量測定

取模擬汁，離心10 min收集細胞，用PBS洗滌2次，再用PBS重懸，按照試劑盒說明書加入熒光探針(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)，在最佳波長500 nm，最佳發(fā)射波長525 nm處進行熒光檢測。

1.3.3.4 酵母細胞中MDA含量測定

參照1.3.3.2的方法制成10%的組織勻漿，再將勻漿稀釋5倍，按照試劑盒說明書進行測定。

1.3.3.5 酵母細胞及模擬汁中GSH含量測定

取模擬汁發(fā)酵液10 mL，3 500 r/min離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書測定GSH含量。按照1.3.3.2 的方法，制成10%的組織勻漿，進行酵母細胞中GSH含量測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2007對試驗所得數(shù)據(jù)進行整理，使用IBM SPSS Statistics 19.0進行多重比較(Duncan法，P<0.05)，用平均值±標準偏差來表示實驗結果。

2 結果與分析

2.1 甘露聚糖對釀酒酵母菌株生物量和活力的影響

由圖1可知，與對照相比，甘露聚糖有效延長了酒精發(fā)酵過程中S.cerevisiae菌株的對數(shù)生長期和穩(wěn)定期。隨著甘露聚糖濃度的增加，S.cerevisiae菌株生長越快，當質量濃度大于300 mg/L時，促進作用較MP3處理組降低。

圖1 甘露聚糖對釀酒酵母菌株生物量的影響

由圖2可知，MP3處理組比對照組顯著增加了酵母活力(P<0.05)，尤其使酒精發(fā)酵前期和中期的葡萄糖誘發(fā)質子流(glucose induced proton electric，GIPE)值增加了8.2%和10.1%；MP1和MP2處理組，對不同酒精發(fā)酵時期酵母菌株活力無顯著差異(P>0.05)；MP4和MP5處理組，在酒精發(fā)酵初期反而降低了酵母活力，故選擇200、300、400 mg/L的添加量測定S.cerevisiae細胞通透率及抗氧化指標。

圖2 甘露聚糖對釀酒酵母菌株活力的影響

2.2 甘露聚糖對釀酒酵母細胞中ATP酶活性的影響

ATP又稱能量貨幣，是細胞內能量的主要載體。而ATP酶是真核細胞在有氧條件下產生細胞ATP的重要酶，存在于組織細胞膜上，在物質運送、能量轉換及信息傳遞方面具有重要作用[13]。由圖3所示，隨著酒精發(fā)酵的進行，酵母細胞中ATP酶活性呈下降趨勢，是由于酒精發(fā)酵過程中產生酒精、有機酸等物質使酵母的生存環(huán)境逐漸惡劣，細胞活力逐漸下降。與對照相比，甘露聚糖的添加顯著增加了酒精發(fā)酵不同時期酵母細胞中ATP酶的活性。在酒精發(fā)酵第3天時ATP酶活性由高到低分別為MP3(21.35 U/mg)>MP2(18.81 U/mg)>MP4(17.07 U/mg)>CK(15.35 U/mg)，MP3處理組較對照組增加了39.1%(P<0.05)。綜上所述，在酒精發(fā)酵前添加甘露聚糖有利于提高酵母細胞中ATP酶的活性，尤其是在酒精發(fā)酵中期，增加了酵母細胞的抗逆性反應。

圖3 甘露聚糖對釀酒酵母細胞中ATP酶活性的影響

2.3 甘露聚糖對釀酒酵母細胞中SOD活性的影響

酵母可以通過多種途徑保護自身免受各種脅迫(包括氧化應激)，清除H2O2、超氧陰離子自由基等[3]，如通過抗氧化酶，包括SOD、CAT、GSH-Px等的水平來體現(xiàn)對氧化應激的適應性反應；也可以通過產生GSH清除溶液中的氧化劑，從而提高細胞的抗氧化水平。圖4為酒精發(fā)酵前添加不同濃度的甘露聚糖對酵母細胞中SOD活性的影響。由圖4可知，隨著酒精發(fā)酵的進行，酵母細胞中SOD活性呈下降趨勢。在酒精發(fā)酵不同時期對照組與處理組SOD的活性均無顯著性差異(P>0.05)，可見甘露聚糖的添加并未對S.cerevisiae細胞中SOD活性產生影響。

圖4 甘露聚糖對釀酒酵母細胞中SOD活力的影響

2.4 甘露聚糖對釀酒酵母細胞中活性氧的影響

少量ROS是酵母菌株正常生理代謝所必需的[14-16]。但酵母細胞內ROS過量積累會導致細胞損傷甚至死亡[17-19]。由圖5可知，在酒精發(fā)酵過程中，酵母細胞中的ROS先上升，隨著酒精發(fā)酵末期酵母的死亡而快速降低，在酒精發(fā)酵進行的第2、3、4天中處理組都顯著低于對照組。在酒精發(fā)酵第4天，MP3處理組中ROS含量較對照組顯著降低了27.5%； 酒精發(fā)酵末期處理組與對照組無顯著差異。綜上所述，甘露聚糖有利于降低酒精發(fā)酵前期和中期S.cerevisiae細胞中的ROS含量，且MP3處理組酵母細胞ROS含量最低，有利于降低酵母細胞結構的損傷，提高S.cerevisiae菌株抗逆性。

圖5 甘露聚糖對釀酒酵母細胞中ROS的影響

2.5 甘露聚糖對釀酒酵母細胞中丙二醛含量的影響

MDA是ROS作用于脂質發(fā)生過氧化反應的終產物之一，通常將其作為膜脂過氧化作用強弱的一個重要標志[20]。由圖6可知，在酒精發(fā)酵過程中，S.cerevisiae細胞中MDA逐漸積累，且在酒精發(fā)酵第4天后，MDA含量大幅增加。在酒精發(fā)酵前期處理組與對照組不存在顯著差異，是因為在對數(shù)增長期酵母發(fā)酵活力良好。酒精發(fā)酵第4天時，MDA含量為MP2(7.05 mg/g)

圖6 甘露聚糖對釀酒酵母細胞中MDA含量的影響

2.6 甘露聚糖對釀酒酵母細胞和模擬汁谷胱甘肽含量的影響

在生物體內起重要生理作用的是GSH，它與氧化型谷胱甘肽一起維持和調節(jié)細胞的氧化還原狀態(tài)[21-22]。它是一種內源性抗氧化物質，在葡萄酒酒精發(fā)酵期間，能夠有效防止葡萄酒中酚類物質的氧化，保護葡萄酒的芳香物質和色澤[23]。由圖7可知，酵母細胞中GSH含量在酒精發(fā)酵前期到中期呈上升趨勢，而在酒精發(fā)酵中期到后期呈下降趨勢，可能是由于酒精發(fā)酵初期酵母生存環(huán)境較好，未激發(fā)細胞的抗逆性反應。在酒精發(fā)酵初期，處理組酵母細胞中GSH含量與對照組不存在顯著性差異，而在酒精發(fā)酵的中期和后期GSH含量明顯增加。酒精發(fā)酵第3天時MP3處理組GSH含量最高，達到99.33 mg/g，較對照組增加了21.9%。第4天時細胞中GSH含量為MP3>MP2>MP4>CK，MP3處理組為62.26 mg/g，與對照組相比顯著增加了24.2%；酒精發(fā)酵末期，MP3、MP2和MP4處理組酵母細胞中GSH含量較對照組增加了70.1%、51.9%和31.9%。由圖8可知，與對照組相比，處理組模擬汁中GSH含量在酒精發(fā)酵的不同時期均高于對照組，但均未達到顯著性差異。綜上所述，在酒精發(fā)酵前添加甘露聚糖可顯著促進酵母細胞中GSH的合成，而對胞外GSH的分泌影響較小。因此，添加酵母多糖可增加酵母菌株的抗氧化能力，且添加質量濃度為300 mg/L時效果最佳。

圖7 甘露聚糖對釀酒酵母細胞中GSH含量的影響

圖8 甘露聚糖對模擬汁中GSH含量的影響

3 討論

盧新軍等[23]指出，在酒精發(fā)酵過程中添加酵母細胞壁提取物可促進S.cerevisiae的生長繁殖，減輕乙醇對酵母的抑制甚至毒害作用，促進酵母的生理活性及生長代謝。ALSTEENS等[24]研究表明酵母細胞壁提取物可以通過提供不飽和脂肪酸和甾醇等營養(yǎng)物質促進葡萄汁和麥芽汁的快速完全發(fā)酵。NGELES等[25]研究表明酵母提取物中的主要活性成分是甘露聚糖，它可通過清除有毒的發(fā)酵產物，如中鏈脂肪酸或赭曲霉毒素A等，減少這些物質對酵母菌株的抑制作用，增加酵母菌株活力。郭守東[26]也在相關的研究結果中得出類似的結論。LUBBERS等[27]指出中鏈脂肪酸可以穿過酵母細胞質膜，使細胞質中ROS積累，導致酵母細胞結構受損，發(fā)酵活力降低。本研究結果表明，甘露聚糖可縮短S.cerevisiae菌株生長的遲滯期，有利于酵母菌株的快速適應和生長繁殖，對細胞活力具有顯著的提升作用(P<0.05)。

S.cerevisiae菌株在酒精發(fā)酵過程中會產生的乙醇、毒素等物質能抑制酵母菌株的代謝，使酵母細胞中ROS積累，從而破壞S.cerevisiae細胞結構的完整性，導致其代謝活力下降[28]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)在酒精發(fā)酵前添加甘露聚糖，使酵母細胞中ATP酶活性顯著增加，ROS和MDA含量降低，GSH含量增加，且添加量為300 mg/L效果最好。SIES[29]指出，細胞自身防御氧化的途徑主要有2條，其中酶系防御體系主要通過抗氧化物酶清除自由基，如SOD、CAT等，而非酶系防御體系主要是通過產生GSH和金屬硫蛋白等還原性物質與自由基發(fā)生氧化還原反應來清除自由基，進而保護細胞不被氧化。結合本實驗中甘露聚糖能促進細胞中GSH的合成，表明甘露聚糖可能是通過非酶系防御體系途徑來提高S.cerevisiae細胞抗氧化性。有研究發(fā)現(xiàn)膠紅酵母粗多糖純化后各組分對羥自由基和超氧陰離子自由基具有很強的清除能力，且效果高于維生素C[30]。研究還發(fā)現(xiàn)甘露聚糖可以清除ABTS陽離子自由基、羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基和螯合Fe2+[8]。以上研究都是從清除自由基的基礎上研究多糖的抗氧化性，本實驗證實了甘露聚糖可通過增加ATP酶活性和GSH含量，并清除ROS和MDA含量來提高抗氧化性，提高S.cerevisiae的細胞活力。

4 結論

本實驗以模擬葡萄汁為原料，研究甘露聚糖對S.cerevisiae菌株生長及抗氧化活性的影響。結果表明，甘露聚糖在S.cerevisiae菌株酒精發(fā)酵的全過程中均對酵母細胞活力具有顯著的提升作用(P<0.05)； 外源添加300 mg/L甘露聚糖的處理組中酵母細胞的ATP酶顯著高于對照組(P<0.05)，而SOD活性不存在顯著差異(P>0.05)；在酵母菌株生長中后期，外源添加甘露聚糖的處理組中ROS、MDA含量顯著低于對照組(P<0.05)，并且酵母細胞內的GSH含量顯著高于對照組(P<0.05)，即添加甘露聚糖可通過促進酵母細胞中GSH的合成來清除細胞內過量的ROS、MDA，提高酵母細胞的抗氧化能力，并且質量濃度為300 mg/L時抗氧化能力最強。