周正富，龐雨，張維，王勁，燕永亮，鄭迎迎，陳敏，廖志華，林敏，

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081； 2 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300308； 3 國(guó)家合成生物技術(shù)創(chuàng)新中心，天津 300308； 4 西南大學(xué)，西南大學(xué)-西藏農(nóng)牧學(xué)院藥用植物聯(lián)合研發(fā)中心，重慶 400715）

目前，全球?qū)θ橹破返男枨罅坎粩嘣黾?。隨著全球人口和發(fā)展中國(guó)家經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)，全球奶類供需年均增長(zhǎng)率達(dá)2.3%。未來(lái)十年內(nèi)，中國(guó)將持續(xù)保持乳制品進(jìn)口勢(shì)頭，預(yù)計(jì)到2028 年鮮奶進(jìn)口量將達(dá)90 萬(wàn)噸［1］。天然動(dòng)物奶及其乳制品是最理想的蛋白營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，其營(yíng)養(yǎng)成分主要是乳蛋白，同時(shí)還含有生物活性肽、脂肪、乳糖、維生素和礦物質(zhì)等［2-3］。但另一方面，因含有各種致敏原，天然動(dòng)物奶是嬰幼兒群體中排在首位的致敏食物［4］。此外，牛奶含有4.6%左右的乳糖，導(dǎo)致乳糖不耐受人群食用后出現(xiàn)腹脹及腹瀉等不良癥狀。特別是近年來(lái)，動(dòng)物奶生產(chǎn)還普遍存在養(yǎng)殖成本高、飼料資源短缺、抗生素濫用、環(huán)境污染嚴(yán)重、疫病防控形勢(shì)嚴(yán)峻等問(wèn)題，亟待產(chǎn)業(yè)升級(jí)換代［5-6］。

面對(duì)乳制品生產(chǎn)的可持續(xù)性、公共衛(wèi)生以及動(dòng)物福利等問(wèn)題，植物源或動(dòng)物源的乳蛋白替代技術(shù)的研發(fā)逐步受到廣泛關(guān)注，并已取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，但在風(fēng)味、口感和功能特性等方面還存在許多亟待解決的問(wèn)題［7-8］。近年來(lái)，信息科學(xué)、生命科學(xué)和工程科學(xué)等學(xué)科交叉融合，驅(qū)動(dòng)基因編輯、合成生物學(xué)、全基因組選擇等前沿生物技術(shù)快速發(fā)展，為全球食品生產(chǎn)提供變革性的生產(chǎn)方式，培育孵化未來(lái)食品和細(xì)胞農(nóng)業(yè)等戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)。利用合成生物技術(shù)等顛覆性創(chuàng)新技術(shù)手段，構(gòu)建具有特定合成能力的細(xì)胞工廠，生產(chǎn)人類所需的淀粉、蛋白質(zhì)、油脂、糖、奶、肉等各類農(nóng)產(chǎn)品，近年來(lái)已取得重要進(jìn)展［9-10］。2014 年，美國(guó)一家基于“細(xì)胞農(nóng)業(yè)”（cellular agriculture）概念的生物科技初創(chuàng)公司完美日（Perfect Day）公司提出人造奶（animal-free milk）概念，設(shè)計(jì)改造酵母細(xì)胞工業(yè)化發(fā)酵牛乳蛋白（如乳清蛋白和酪蛋白）以及相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)成分，實(shí)現(xiàn)人造乳制品的精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)和綠色制造［11］。隨著越來(lái)越多的食品企業(yè)開始嘗試合成生物技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)室中制作的動(dòng)植物基人造肉、人造蛋和人造母乳等產(chǎn)品不斷涌現(xiàn)，美國(guó)Perfect Day 公司和以色列人造奶（Remilk）公司相繼在2019 年開發(fā)出牛乳蛋白微生物合成新工藝，引領(lǐng)人造合成食品領(lǐng)域成為新的投資風(fēng)口。

乳蛋白主要由酪蛋白和乳清蛋白組成，分別約占蛋白總量的80%和20%［12］。乳清中主要含有β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、脂肪球膜蛋白以及免疫球蛋白等［13-15］。乳蛋白表達(dá)是人造奶生物合成的核心，主要是指采用基因工程和細(xì)胞工廠等技術(shù)手段，高效表達(dá)動(dòng)物奶中的各種蛋白質(zhì)組分。當(dāng)前，人造奶研究正處于生產(chǎn)工藝突破和產(chǎn)品商業(yè)化的初創(chuàng)階段，在重要乳蛋白組分的高效合成以及人造奶制品生產(chǎn)工藝等方面存在亟待突破的技術(shù)瓶頸。智慧芽數(shù)據(jù)庫(kù)是一款全球?qū)＠麢z索數(shù)據(jù)庫(kù)，深度整合了從1790 年至今的全球116 個(gè)國(guó)家地區(qū)的1.5 億專利數(shù)據(jù)，提供精準(zhǔn)、及時(shí)的研發(fā)情報(bào)。本文通過(guò)對(duì)智慧芽數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行全面檢索（截止到2020 年12 月），共獲得362 條與乳蛋白重組表達(dá)和人造奶生物合成相關(guān)的專利文獻(xiàn)，經(jīng)過(guò)人工篩選降噪，最終明確175 項(xiàng)專利申請(qǐng)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)乳蛋白重組表達(dá)和人造奶生物合成相關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷程、研發(fā)現(xiàn)狀、未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)及生物安全和倫理問(wèn)題進(jìn)行了系統(tǒng)分析。

1 國(guó)內(nèi)外研發(fā)概況

1.1 發(fā)展歷程

乳蛋白表達(dá)研究始于20 世紀(jì)90 年代，隨后以乳腺生物反應(yīng)器為核心的生物技術(shù)公司相繼出現(xiàn)，包括美國(guó)基因藥物國(guó)際有限公司、美國(guó)威斯康星乳制品營(yíng)銷管理局、瑞典斯比克姆股份有限公司、美國(guó)雅培公司和蘇格蘭醫(yī)藥蛋白有限公司等，其核心技術(shù)是通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物家畜的乳汁來(lái)獲取乳蛋白。該過(guò)程獲得的乳蛋白經(jīng)修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性，可直接用于食品加工［16］。2000—2010 年的10 年間，利用植物組織細(xì)胞和葉綠體構(gòu)建植物表達(dá)系統(tǒng)，打造乳蛋白生產(chǎn)的植物生物反應(yīng)器，人造奶的研發(fā)迎來(lái)新一輪發(fā)展浪潮［17］（圖1）。近十年來(lái)，基于基因組和系統(tǒng)生物學(xué)的合成生物學(xué)掀起了第三次生物技術(shù)革命，人造奶研究也取得了突破性的進(jìn)展，如利用一系列模式微生物和植物作為底盤細(xì)胞工廠，高效表達(dá)乳蛋白［18］；采用精細(xì)化工技術(shù)，開展乳制品人工組合物、風(fēng)味物質(zhì)研究與應(yīng)用［19-20］。我國(guó)人造奶技術(shù)起步較晚，第一個(gè)發(fā)明專利由復(fù)旦大學(xué)于2003 年申請(qǐng)，涉及利用植物反應(yīng)器生產(chǎn)乳鐵蛋白技術(shù)（CN1544641A）［21］。

圖1 人造奶相關(guān)專利申請(qǐng)量年度變化Fig.1 Annual statistic for the number of patents related to animal-free milk

1.2 競(jìng)爭(zhēng)態(tài)勢(shì)

在全球范圍內(nèi)，水產(chǎn)動(dòng)物產(chǎn)品、谷類和牛奶是人類食用蛋白質(zhì)的三大來(lái)源，其中牛奶蛋白占全球食物蛋白供應(yīng)量的10%。根據(jù)2021 年波士頓咨詢公司（BCG）和Blue Horizon 聯(lián)合發(fā)布的研究報(bào)告（Food for thought：the protein transformation），由于動(dòng)物蛋白資源短缺和生物技術(shù)創(chuàng)新推動(dòng)，未來(lái)十五年內(nèi)動(dòng)植物或微生物基的替代蛋白產(chǎn)品將占據(jù)22%的全球食用蛋白市場(chǎng)份額，產(chǎn)業(yè)規(guī)模達(dá)到2900 億美元。預(yù)示著以人造奶為代表的未來(lái)食品將逐步占據(jù)傳統(tǒng)餐桌，在相關(guān)技術(shù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)上引發(fā)激烈的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)［22］。

為研究人造奶相關(guān)技術(shù)全球?qū)＠暾?qǐng)的主要來(lái)源地分布，本研究對(duì)每項(xiàng)專利申請(qǐng)的最先申請(qǐng)國(guó)等數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。由于專利申請(qǐng)人一般會(huì)優(yōu)先選擇自己所在國(guó)家申請(qǐng)專利，相關(guān)分析數(shù)據(jù)可以反映各個(gè)國(guó)家和地區(qū)在人造奶及相關(guān)乳蛋白重組表達(dá)領(lǐng)域的技術(shù)實(shí)力。從圖2可以看出，美國(guó)申請(qǐng)人提交的專利申請(qǐng)最多，共72 項(xiàng)，占比41%。其次是歐洲，申請(qǐng)專利為29 項(xiàng)，二者占全部專利申請(qǐng)的一半以上，表明歐美國(guó)家在人造奶研發(fā)領(lǐng)域占主導(dǎo)地位。中國(guó)的專利申請(qǐng)數(shù)量為16 項(xiàng)，位居第3 位，表明我國(guó)在相關(guān)領(lǐng)域已有一定研發(fā)基礎(chǔ)，但需要進(jìn)一步加強(qiáng)技術(shù)工藝創(chuàng)新。

圖2 人造奶相關(guān)全球?qū)＠暾?qǐng)人區(qū)域分布Fig.2 Geographic distribution of the applicants of patents related to animal-free milk

圖3顯示了人造奶相關(guān)全球?qū)＠暾?qǐng)的目的地分布。在人造奶相關(guān)全球?qū)＠暾?qǐng)中，歐洲是主要的申請(qǐng)地區(qū)，排名第1位。中國(guó)、日本、澳大利亞和美國(guó)位居2～5 位，表明這些國(guó)家將是未來(lái)人造奶產(chǎn)品生產(chǎn)、加工、銷售的主要目的國(guó)，需要特別關(guān)注其產(chǎn)業(yè)化的相關(guān)法規(guī)和監(jiān)管政策動(dòng)向。

圖3 人造奶相關(guān)全球?qū)＠暾?qǐng)的目的地分布Fig.3 Geographic distribution of patents related to animalfree milk

人造奶生產(chǎn)技術(shù)相關(guān)專利全球主要申請(qǐng)人排名顯示（圖4），全球排名前10 的專利申請(qǐng)人中，有9個(gè)是企業(yè)，在這一領(lǐng)域中申請(qǐng)量占比為95.9%，是人造奶領(lǐng)域技術(shù)研發(fā)的主力軍。排名第一的是美國(guó)Perfect Day公司，其申請(qǐng)的34項(xiàng)專利在全球11個(gè)國(guó)家或地區(qū)進(jìn)行了布局，是人造奶研發(fā)行業(yè)的技術(shù)領(lǐng)跑者。該公司通過(guò)酵母細(xì)胞表達(dá)重組乳蛋白，之后將分離純化得到的重組乳蛋白與其他成分混合制成人造奶。排名第二的是美國(guó)文特里亞生物科學(xué)公司，其專利申請(qǐng)主要涉及轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)人乳蛋白及相關(guān)食品和食品添加劑組合物，用于嬰兒配方食品的優(yōu)化改良。排名第三的是荷蘭帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司，其專利申請(qǐng)主要涉及改變?nèi)橹破凤L(fēng)味及重組表達(dá)生產(chǎn)乳糖酶等，其中乳糖酶制劑可用于食品和飼料產(chǎn)品中乳糖水解，且不產(chǎn)生異味化合物。瑞典斯比克姆股份有限公司排名第四，其專利申請(qǐng)主要涉及動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器表達(dá)重組酪蛋白，并用于嬰兒配方食品。

圖4 人造奶相關(guān)專利申請(qǐng)人排名Fig.4 Ranking of the applicants of patents related to animal-free milk

1.3 我國(guó)研發(fā)現(xiàn)狀

從1990 年到2020 年的30 年間，全球蛋白質(zhì)消費(fèi)量增長(zhǎng)96%。根據(jù)中國(guó)農(nóng)業(yè)展望報(bào)告（2021—2030），我國(guó)奶制品消費(fèi)持續(xù)增長(zhǎng)，2030 年奶制品消費(fèi)量將達(dá)6933 萬(wàn)噸；同時(shí)市場(chǎng)缺口巨大，預(yù)計(jì)2030 年奶制品進(jìn)口為 2563 萬(wàn)噸［23］。為滿足上述消費(fèi)需求和應(yīng)對(duì)國(guó)際蛋白替代市場(chǎng)的激烈競(jìng)爭(zhēng)，我國(guó)在乳蛋白重組表達(dá)與人造奶生物合成等技術(shù)領(lǐng)域已開始進(jìn)行研發(fā)布局，并取得重要進(jìn)展。

我國(guó)乳蛋白重組表達(dá)與人造奶相關(guān)專利共有16項(xiàng)，企業(yè)與科研院校的申請(qǐng)量占比相當(dāng)（圖5）?？蒲性盒０ㄖ袊?guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)、浙江工業(yè)大學(xué)、山東大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)、泉州師范學(xué)院等，申請(qǐng)量為9項(xiàng)，主要涉及乳鐵蛋白的重組表達(dá)，用于飼料的添加，作為養(yǎng)殖用抗生素替代品具有良好前景。企業(yè)申請(qǐng)相關(guān)專利共7 項(xiàng)，涉及乳鐵蛋白的專利2 項(xiàng)，利用真核表達(dá)系統(tǒng)的畢赤酵母菌株生產(chǎn)乳鐵蛋白，并應(yīng)用于飼料的輔助添加。乳球蛋白相關(guān)專利1項(xiàng)，通過(guò)家畜乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)乳球蛋白，用于抗菌、抗病毒、提高免疫力等功能性開發(fā)。其他的專利5 項(xiàng)，涉及相關(guān)酶的重組表達(dá)，其中中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所創(chuàng)建了一種將角蛋白（羽毛）高效轉(zhuǎn)化為人工血紅蛋白（肌漿蛋白）的生物合成體系（PCT/CN/2020/111685）［24］，中國(guó)科學(xué)院先進(jìn)技術(shù)研究院研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)大腸桿菌分別完成7種牛乳蛋白的異源表達(dá)［25］。常規(guī)異源表達(dá)中，靶標(biāo)蛋白表達(dá)量偏低甚至難以表達(dá)，已成為蛋白質(zhì)替代產(chǎn)品研發(fā)上的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所發(fā)現(xiàn)來(lái)自絲氨酸蛋白酶的一段分子伴侶多肽PEP，具有幫助乳蛋白的正確折疊和促進(jìn)重組蛋白體外高效表達(dá)的功能。為提高乳蛋白表達(dá)效率，通過(guò)基因重組將前肽PEP 與目標(biāo)蛋白融合，實(shí)現(xiàn)了多種難表達(dá)乳蛋白的高效合成，且為有活性的可溶蛋白［26］。

圖5 國(guó)內(nèi)人造奶相關(guān)專利類型分布Fig.5 Domestic patents for animal-free milk applied by universities/research institutes and companies

中國(guó)科技政策對(duì)于人造合成食品的研發(fā)持積極支持態(tài)度。2010—2019 年間，我國(guó)國(guó)家自然科學(xué)基金針對(duì)合成生物食品的應(yīng)用基礎(chǔ)研發(fā)方面給予一定的經(jīng)費(fèi)投入。根據(jù)國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“合成生物學(xué)”和“綠色生物智造”等重點(diǎn)專項(xiàng)2019—2020 年項(xiàng)目申報(bào)指南，我國(guó)擬投入國(guó)撥經(jīng)費(fèi)十幾億人民幣，支持合成生物學(xué)在食品、醫(yī)藥和能源等領(lǐng)域的研究創(chuàng)新。近年來(lái)，我國(guó)在深圳、天津等地建立國(guó)家合成生物學(xué)創(chuàng)新中心，并通過(guò)國(guó)家、地方政府和企業(yè)投資，培育具有國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力的合成生物科技初創(chuàng)企業(yè)。同時(shí)，人造合成食品領(lǐng)域也為我國(guó)資本市場(chǎng)提供了巨大商機(jī)。我國(guó)第1家食品科技風(fēng)投集團(tuán)——食芯資本公司專注于投資農(nóng)業(yè)食品科技領(lǐng)域擁有顛覆性技術(shù)的初創(chuàng)企業(yè)，如中國(guó)合成生物科技初創(chuàng)企業(yè)摩珈生物、以色列細(xì)胞培養(yǎng)肉公司Future Meat Technologies 和英國(guó)生物科技公司Tropic Biosciences 等的創(chuàng)新項(xiàng)目。但相比人造肉等未來(lái)食品研發(fā)，目前我國(guó)乳蛋白重組表達(dá)與人造奶生物合成技術(shù)研發(fā)力量相對(duì)薄弱，國(guó)家層面的科技項(xiàng)目立項(xiàng)和企業(yè)層面的風(fēng)險(xiǎn)資金投入不足，相關(guān)知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)乏力。因此，為應(yīng)對(duì)日趨激烈的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)，在“十四五”期間應(yīng)盡快設(shè)立國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目，加大研發(fā)投入，著力突破乳蛋白組合表達(dá)關(guān)鍵技術(shù)瓶頸和人造奶生產(chǎn)新工藝，同時(shí)食品安全監(jiān)管方面應(yīng)加快制定人造奶等未來(lái)食品管理法規(guī)和產(chǎn)業(yè)化政策。

2 技術(shù)研發(fā)進(jìn)展

2.1 乳蛋白重組表達(dá)

采用基因工程和細(xì)胞工廠等技術(shù)手段，高效表達(dá)動(dòng)物奶中的各種蛋白質(zhì)組分，是人造奶生物合成的核心技術(shù)環(huán)節(jié)。人造奶研發(fā)技術(shù)相關(guān)專利文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)，重組表達(dá)乳鐵蛋白的專利申請(qǐng)量最高，有41 項(xiàng)。組合表達(dá)多種乳蛋白位居第二，有36 項(xiàng)；表達(dá)乳白蛋白和酪蛋白分別有21 和20項(xiàng)；表達(dá)乳球蛋白的最少，僅有2項(xiàng)。其他的申請(qǐng)涉及牛奶中酶蛋白，改變?nèi)橹破凤L(fēng)味以及干酪、酸奶生產(chǎn)等技術(shù)內(nèi)容。乳蛋白表達(dá)類型申請(qǐng)量對(duì)比分析表明（圖6），組合表達(dá)乳蛋白是獲取人造奶的主要技術(shù)。其中，美國(guó)基因藥物國(guó)際有限公司通過(guò)轉(zhuǎn)基因牛乳腺重組表達(dá)多種乳蛋白，生產(chǎn)含有多種重組肽的食物配方（AU1991069608A1）。美國(guó)文特里亞生物科學(xué)公司通過(guò)在轉(zhuǎn)基因植物種子表達(dá)多種人乳蛋白，生產(chǎn)的乳蛋白食品以及食品添加劑組合物來(lái)改進(jìn)嬰兒食品配方（AU2007216827A1）。美國(guó)Perfect Day公司利用微生物細(xì)胞工廠重組表達(dá)乳蛋白，生成具有哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的牛乳類似風(fēng)味、外觀、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、香氣和類似口感的組合物（US20170273328A1）。其他專利涉及乳鐵蛋白表達(dá)，用于飼料中抗生素的添加；或通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物家畜乳腺生物反應(yīng)器表達(dá)酪蛋白和乳白蛋白，用于嬰兒食品配方成分。

圖6 重組表達(dá)乳蛋白類型專利申請(qǐng)量比對(duì)Fig.6 Patents applied for different recombinant milk proteins

2.2 人造奶生物合成

目前，美國(guó)Perfect Day 公司和以色列Remilk公司均已開發(fā)出人造奶生物合成新工藝。特別是Perfect Day 公司研發(fā)技術(shù)雄厚，2019 年12 月實(shí)現(xiàn)融資2億美元，成為乳制品替代新興行業(yè)中產(chǎn)業(yè)化發(fā)展勢(shì)頭最強(qiáng)勁的高科技初創(chuàng)企業(yè)。

美國(guó)Perfect Day 公司原名“Muufri”，創(chuàng)立于2014 年，總部位于美國(guó)伯克利市，是一家基于“細(xì)胞農(nóng)業(yè)”概念的生物科技初創(chuàng)公司。該公司利用微生物的發(fā)酵作用來(lái)制造乳制品蛋白，并首創(chuàng)了人造奶（cow free milk）概念。該公司通過(guò)人工合成牛奶乳蛋白DNA 序列，轉(zhuǎn)化到食品級(jí)酵母中表達(dá)酪蛋白和乳清蛋白，并與植物性成分混合生產(chǎn)出純素食、無(wú)乳糖、無(wú)膽固醇的人造奶，可用于制作冰淇淋、奶酪、酸奶和其他一系列乳制品，已取得的重要進(jìn)展包括：①酪蛋白的組合物及其生產(chǎn)方法（US10595545），其主要發(fā)明點(diǎn)在于提供了不包括動(dòng)物來(lái)源組分的組合物，其含有κ-酪蛋白、β-酪蛋白、脂質(zhì)、風(fēng)味化合物、甜味劑和灰分［27］；②乳蛋白和非動(dòng)物蛋白的食物產(chǎn)品及其生產(chǎn)方法（US20190216106A1），提供了椰子油、β-乳球蛋白和豌豆蛋白等混合的人造奶，以及該人造奶發(fā)酵制備得到的酸奶［28］；③用于生產(chǎn)包含重組成分和組合物食品的方法（WO2020081789A9），提供了在通過(guò)基于電荷來(lái)分離重組β-乳球蛋白的方法，從而用于生產(chǎn)具有特殊風(fēng)味乳制品［29］。目前，這類人造奶乳制品已通過(guò)美國(guó)食品和藥物管理局的GRAS（Generally Recognized as Safe）審查。同時(shí)，該公司與美國(guó)阿徹丹尼爾斯米德蘭公司等農(nóng)業(yè)巨頭合作，計(jì)劃到2022 年將人造蛋白產(chǎn)量從目前的數(shù)十噸增加到數(shù)千噸。

Perfect Day公司專利布局隨研發(fā)過(guò)程同步展開（圖7）。2015年首先在美國(guó)、加拿大、澳大利亞和歐洲等國(guó)家和地區(qū)針對(duì)酪蛋白組合物及其制作方法申請(qǐng)了8件發(fā)明專利，進(jìn)行布局。2017年為拓展亞洲和南美洲市場(chǎng)，先后在印度尼西亞、中國(guó)、巴西和墨西哥等國(guó)家和地區(qū)，針對(duì)酪蛋白組合物及其制作方法優(yōu)化改良與非動(dòng)物源蛋白食品及其生產(chǎn)方法，申請(qǐng)專利14 件。隨著技術(shù)逐漸成熟，2019 年，其專利申請(qǐng)內(nèi)容涉及包括非動(dòng)物源蛋白食品和生產(chǎn)方法、重組牛奶蛋白聚合物、產(chǎn)生同核的絲狀真菌細(xì)胞的方法、用于生產(chǎn)包含重組成分和組合物食品的方法以及酪蛋白組合物和制造方法。2015 年至今，Perfect Day 公司先后申請(qǐng)同族專利34 件，布局11 個(gè)發(fā)達(dá)和發(fā)展中國(guó)家和地區(qū)，力圖通過(guò)迅速擴(kuò)張，搶占未來(lái)人造奶產(chǎn)品國(guó)際市場(chǎng)。

圖7 Perfect Day公司人造奶相關(guān)專利申請(qǐng)及全球布局Fig.7 Perfect Day's patent applications for animal-free milk

下面重點(diǎn)介紹Perfect Day 公司于2015 年獲得的美國(guó)發(fā)明專利US10595545。該專利涉及人造奶生物合成的關(guān)鍵核心技術(shù)，包括：①人工合成牛乳蛋白編碼基因的DNA 序列，包括牛αs1-酪蛋白、牛αs2-酪蛋白、牛β-酪蛋白、牛κ-酪蛋白、牛α-乳白蛋白和牛β-乳球蛋白［16，30］；②構(gòu)建重組質(zhì)粒，在釀酒酵母和畢赤酵母中分別表達(dá)上述6種牛乳蛋白，利用不同蛋白的親疏水性、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)將其分離純化；③通過(guò)酯交換將短鏈脂肪酸甘油三酯與高油酸葵花籽油結(jié)合，制備乳脂肪酸甘油三酯；④人造奶的配方組分為酪蛋白、乳清蛋白、甘油三酯、糖類、微量元素、維生素等，配方比例為每1 L 人造奶中含26 g酪蛋白、3.5 g乳清蛋白、24 g 半乳糖和5 g 灰分組合；⑤添加多種脂肪和風(fēng)味化合物，包括向日葵油、椰子油、三丁酸甘油酯、甘油一酯和甘油二酯、游離脂肪酸和磷脂、δ-癸內(nèi)酯、丁酸乙酯、2-呋喃基甲基酮、2，3-戊二酮、γ-十一內(nèi)酯和δ-十一內(nèi)酯等，用以模仿動(dòng)物源奶類的口感和風(fēng)味。

3 展望

3.1 乳蛋白組合表達(dá)細(xì)胞工廠創(chuàng)建

通過(guò)對(duì)人造奶相關(guān)專利文獻(xiàn)的分析發(fā)現(xiàn)，早期的專利技術(shù)是利用動(dòng)植物生物反應(yīng)器來(lái)表達(dá)乳蛋白及其組合物，這樣可以直接獲得可食用的乳蛋白，但是對(duì)于乳蛋白的提取、分離純化較困難，且生產(chǎn)成本較高。利用合成生物學(xué)等前沿技術(shù)改造天然乳蛋白及其微生物表達(dá)底盤，組合表達(dá)乳蛋白是當(dāng)前一個(gè)重要技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)。目前，實(shí)現(xiàn)乳蛋白的生物制造替代，亟待突破的瓶頸問(wèn)題是創(chuàng)建乳蛋白高效表達(dá)與正確組裝的微生物底盤細(xì)胞［31］。

酵母菌是應(yīng)用最廣泛的重組蛋白高效表達(dá)平臺(tái)，也是合成生物學(xué)和現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)中最常用的真核底盤細(xì)胞，在工農(nóng)業(yè)及醫(yī)藥等行業(yè)均有廣泛應(yīng)用。目前，工程酵母菌底盤改造已逐漸由基因水平的酶蛋白高表達(dá)1.0 版、組學(xué)水平的代謝通路調(diào)控2.0 版，進(jìn)入智能化人工設(shè)計(jì)3.0 版的新階段。通過(guò)開發(fā)表達(dá)系統(tǒng)的模塊、基因元件重構(gòu)、基因的大規(guī)模重組和重排等關(guān)鍵技術(shù)，突破蛋白高效合成與表達(dá)路徑各環(huán)節(jié)的技術(shù)與理論瓶頸，來(lái)實(shí)現(xiàn)蛋白合成路徑和代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的優(yōu)化與全新合成、底盤細(xì)胞全局性改造，創(chuàng)建低能耗、高產(chǎn)出、易加工、抗逆性強(qiáng)蛋白高效表達(dá)體系生產(chǎn)重組牛乳蛋白。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所通過(guò)人工設(shè)計(jì)組裝多基因串聯(lián)表達(dá)模塊，構(gòu)建αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白4種酪蛋白的共表達(dá)-共純化體系，實(shí)現(xiàn)了酪蛋白的高效表達(dá)與組合合成，同時(shí)正在開展人、山羊、駱駝、青藏高原牦牛等不同物種乳蛋白的資源挖掘與人工優(yōu)化，篩選獲得優(yōu)質(zhì)的乳蛋白組合。2020 年Nature Communications雜志發(fā)表了題為“Synthetic biology 2020—2030： six commercially-available products that are changing our world”的文章，列舉了6個(gè)在2000—2020 年間已商業(yè)化面向市場(chǎng)并正在改變世界的6個(gè)生物合成產(chǎn)品，其中包括利用重組畢赤酵表達(dá)大豆血紅蛋白，作為未來(lái)人造食品配料并改善其口感和風(fēng)味［32］。

絲狀真菌是一類更適合于生產(chǎn)重組哺乳動(dòng)物蛋白的底盤微生物。相比酵母菌，絲狀真菌具有更強(qiáng)的工業(yè)化生產(chǎn)重組蛋白表達(dá)能力，同時(shí)其產(chǎn)生的含哺乳動(dòng)物信號(hào)序列的重組蛋白在分泌特性及其糖基化等翻譯后修飾方面與哺乳動(dòng)物細(xì)胞合成的蛋白更相似［33］。我國(guó)在絲狀真菌蛋白分泌表達(dá)系統(tǒng)及其遺傳操作系統(tǒng)方面開展了系統(tǒng)研究，如中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所通過(guò)改造獲得絲狀真菌如黑曲霉和米曲霉等高效蛋白表達(dá)宿主，挖掘表達(dá)元件如強(qiáng)啟動(dòng)子、信號(hào)肽、終止子、錨定蛋白以及蛋白分泌調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，構(gòu)建了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的絲狀真菌蛋白分泌表達(dá)系統(tǒng)及重組外源蛋白工業(yè)化規(guī)模高效表達(dá)的核心平臺(tái)，獲得核心技術(shù)專利如一種調(diào)控sgRNA 轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、表達(dá)載體及其基因組編輯系統(tǒng)和應(yīng)用（CN110331146B）和一種改善絲狀真菌蛋白分泌能力的方法（CN106119137B）等。此外，華南理工大學(xué)申報(bào)發(fā)明專利“絲狀真菌蛋白分泌壓力反饋調(diào)控元件與抗反饋抑制的啟動(dòng)子、質(zhì)粒及制備方法和轉(zhuǎn)化細(xì)胞”（CN103275981A）和“一種提取絲狀真菌基因組DNA 的方法及試劑盒和遺傳轉(zhuǎn)化子的快速篩選方法”（CN103361339A）也獲得授權(quán)。2020 年，Perfect Day 公司優(yōu)化了絲狀真菌大量培養(yǎng)與篩選的實(shí)用方案，將應(yīng)用于未來(lái)高效的絲狀真菌底盤細(xì)胞工廠的創(chuàng)建中（WO202006 1503A1）。

3.2 新一代人造奶生物智造

2014 年，美國(guó)Perfect Day 公司提出人造牛奶概念，設(shè)計(jì)改造酵母細(xì)胞工業(yè)化分別發(fā)酵牛乳蛋白（乳清蛋白和酪蛋白）以及相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)成分，模仿動(dòng)物源奶類的成分、功能、質(zhì)地和風(fēng)味，經(jīng)過(guò)精細(xì)化加工，實(shí)現(xiàn)人造乳制品的精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)和綠色制造。經(jīng)過(guò)生產(chǎn)工藝優(yōu)化，該公司的人造牛奶蛋白初創(chuàng)產(chǎn)品含6種牛奶蛋白、8種脂肪酸、礦物質(zhì)、維生素和糖類，具有與牛奶相似的營(yíng)養(yǎng)成分和風(fēng)味，同時(shí)還突破產(chǎn)業(yè)化的成本障礙，其生產(chǎn)成本較普通牛奶蛋白低40%左右。2019 年，該公司以每品脫（1品脫≈473毫升）20美元的價(jià)格限量銷售1000 品脫含香草鹽軟糖、牛奶巧克力、香草黑莓太妃糖3種口味的人造奶冰淇淋，其售價(jià)與目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)同規(guī)格哈根達(dá)斯冰淇淋的價(jià)格相當(dāng)。與傳統(tǒng)的牛奶生產(chǎn)方式相比，人造奶的生物合成工藝還具備顯著的環(huán)保優(yōu)勢(shì)，將減少98%的用水量，91%的土地需求，84%溫室氣體排放，并節(jié)約65%的能源［8］，將顛覆傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式，有助于世界農(nóng)業(yè)碳達(dá)峰和碳中和目標(biāo)實(shí)現(xiàn)。

與天然動(dòng)物奶比較，人造奶制品還有一個(gè)顯著優(yōu)勢(shì)就是不含乳糖、膽固醇和致敏原等不良因子。牛奶及其乳制品是FAO和WHO認(rèn)定的導(dǎo)致人類食物過(guò)敏的八大類食品之一，牛乳蛋白過(guò)敏是嬰幼兒最普遍的一類食物過(guò)敏［4，34］，因此，美國(guó)及歐盟新食品標(biāo)簽法規(guī)定牛奶必須標(biāo)示的致敏原成分。目前，牛奶中已知的主要致敏原包括αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-蛋酪蛋白、κ-蛋酪蛋白、β-蛋乳球蛋白和α-球乳白蛋白等。通過(guò)致敏原數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，可以針對(duì)不同來(lái)源的乳蛋白序列進(jìn)行人工設(shè)計(jì)，提高其生物活性同時(shí)刪除其致敏原，可望獲得更加營(yíng)養(yǎng)和健康的人造奶制品［35-36］。

但是，從口感、風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)而言，目前人造奶產(chǎn)品還無(wú)法與動(dòng)物天然乳制品抗衡。在天然牛奶中，蛋白質(zhì)的含量?jī)H為3%左右，主要由酪蛋白和乳清蛋白兩大部分組成，但其風(fēng)味和活性成分非常復(fù)雜。牛奶特有的風(fēng)味物質(zhì)包括游離脂肪酸、醇、酯、內(nèi)酯、醛、酮、酚、醚、含硫化合物及萜類等多種有機(jī)物，主要是由牛奶中蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖三大類物質(zhì)降解或各類衍生物之間反應(yīng)生成。其中，脂肪作為一種重要食物成分對(duì)未來(lái)人造乳制品的風(fēng)味、口感和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)等改良至關(guān)重要［30］。此外，天然牛奶還含有各種生物活性物質(zhì)，現(xiàn)已檢測(cè)到50 多種，包括免疫球蛋白、乳過(guò)氧化物酶、溶菌酶、酪蛋白源和乳清蛋白源的生物活性肽、不飽和脂肪酸、激素（如褪黑素）及細(xì)胞因子（如白細(xì)胞介素）等，其來(lái)源包括從血液轉(zhuǎn)入奶中，或經(jīng)蛋白質(zhì)水解作用形成以及乳腺本身合成等，具有多種生理功能和免疫保護(hù)作用［37］。因此，利用合成生物學(xué)技術(shù)改造微生物底盤，組合合成多種脂肪類風(fēng)味物質(zhì)以及多肽類生物活性物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)新一代人造奶的生物智造（圖8），應(yīng)用前景更加廣闊［38-39］。

圖8 乳蛋白組合表達(dá)細(xì)胞工廠創(chuàng)建與人造奶生物合成的技術(shù)流程Fig.8 Process diagram for the combinatorial expression of milk proteins to produce synthetic milk

3.3 生物安全與生物倫理思考

由于合成生物學(xué)具有顛覆性、交叉性和不確定性等技術(shù)特征，其相關(guān)產(chǎn)品如人造食品的商業(yè)化在生物安全和生物倫理方面存在較大爭(zhēng)議。如何運(yùn)用法律來(lái)平衡此類人造食品商業(yè)化帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)與收益，是當(dāng)前國(guó)際社會(huì)普遍關(guān)注的問(wèn)題。2018 年召開的聯(lián)合國(guó)生物多樣性會(huì)議暨《生物多樣性公約》第十四次締約方大會(huì)提出，需要注重合成生物學(xué)領(lǐng)域的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模式、國(guó)際合作和法律考量，以應(yīng)對(duì)合成生物產(chǎn)品商業(yè)化可能帶來(lái)的安全風(fēng)險(xiǎn)。

合成生物學(xué)及其產(chǎn)品的安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)涉及以下內(nèi)容：①新遺傳信息意外暴露于人類和環(huán)境；②新遺傳物質(zhì)在批準(zhǔn)使用范圍以外的環(huán)境中擴(kuò)散；③在人工遺傳物質(zhì)可能改變或影響人類、動(dòng)物或環(huán)境的遺傳信息的情況下，發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移的可能性；④食品營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)改變、產(chǎn)生潛在過(guò)敏原和未知成分。此外，具有顛覆性特征的合成生物技術(shù)能設(shè)計(jì)全新的人工元器件，創(chuàng)制全新的人工基因線路（如高效固氮基因回路、表觀遺傳回路等）、人工生物細(xì)胞（如最小基因組、細(xì)胞工廠等）、人工生物裝置（如人造葉片，生物納米機(jī)器等）、非天然化合物（如非天然氨基酸、非天然藥物等）以及人造食品（如人造肉、人造奶等），在食用安全或環(huán)境安全方面可能產(chǎn)生新的潛在風(fēng)險(xiǎn)。目前，世界各國(guó)在針對(duì)合成生物食品商業(yè)化問(wèn)題上并未建立專門且具體的法律規(guī)范和管理措施，但普遍采用現(xiàn)有的法律框架進(jìn)行生物安全評(píng)價(jià)和監(jiān)管（表1）［40-42］。美國(guó)《聯(lián)邦法典》中關(guān)于食品與藥品的規(guī)定（Code of Federal Regulations，Title 21 Food and Drug）要求新型生物產(chǎn)品的研發(fā)和投入市場(chǎng)需要向生物產(chǎn)品評(píng)價(jià)與研究中心（Center for Biologics Evaluation and Research）進(jìn)行申報(bào)，以保證生物產(chǎn)品的安全性和有效性。歐盟科學(xué)委員會(huì)在其發(fā)布的《適用于合成生物學(xué)的評(píng)價(jià)方法是否存在風(fēng)險(xiǎn)》（Synthetic Biology ⅡRisk Assessment Methodologies and Safety Aspects）草案意見(jiàn)書中明確表示，目前用于生物和遺傳修飾物質(zhì)的已有法規(guī)可以應(yīng)用于合成生物產(chǎn)品。2020年，歐洲食品安全局發(fā)布關(guān)于現(xiàn)有指南對(duì)合成微生物進(jìn)行微生物表征和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估適用性的評(píng)估報(bào)告，明確指出現(xiàn)有的歐洲食品安全局指南可作為對(duì)當(dāng)前和未來(lái)十年內(nèi)合成微生物特性描述和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的基礎(chǔ)，待評(píng)估產(chǎn)品的用途范圍應(yīng)涵蓋所有農(nóng)業(yè)食品用途，并考慮到所有類型的微生物及其相關(guān)接觸途徑和環(huán)境［43］。以人造肉產(chǎn)品為例，美國(guó)農(nóng)業(yè)部和食品藥物管理局等在現(xiàn)有法規(guī)框架下，正著手制定相關(guān)的安全標(biāo)準(zhǔn)和監(jiān)管框架。人造肉產(chǎn)品能否可以貼上“肉”的標(biāo)簽已引發(fā)爭(zhēng)議，密西西比等13 個(gè)州出臺(tái)了植物蛋白肉、培養(yǎng)肉等不能再用“肉”字宣傳的立法提案。目前，我國(guó)人造肉和人造奶等合成食品研究還處于實(shí)驗(yàn)室階段，尚未有商業(yè)化產(chǎn)品進(jìn)入市場(chǎng)。對(duì)于這一新型科技食品，我國(guó)還沒(méi)有制定專門的立法來(lái)規(guī)范其入市前審批和入市后監(jiān)管事項(xiàng)，因此需要加快其立法研究，確保我國(guó)合成生物學(xué)及其相關(guān)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化在法定框架下健康發(fā)展［41，44］。

表1 美國(guó)、歐盟和新加坡合成生物技術(shù)監(jiān)管相關(guān)法規(guī)［40］Tab.1 Synthetic biology regulation and governance in United States,European Union and Singapore

任何一項(xiàng)新興生物科技的興起與應(yīng)用均存在生物安全風(fēng)險(xiǎn)和生命倫理爭(zhēng)議，也伴生了一系列新興生物科技倫理學(xué)的出現(xiàn)，如gen-ethics（遺傳倫理學(xué)或基因倫理學(xué)）、synbio-ethics（合成生物倫理學(xué)）、nano-ethics（納米技術(shù)倫理學(xué)）以及ⅠT-ethics（信息技術(shù)倫理學(xué)）等。合成生物學(xué)在21世紀(jì)初興起并迅猛發(fā)展，其研究目標(biāo)是創(chuàng)造或設(shè)計(jì)非天然的全新生命形式，由此引發(fā)了對(duì)生命概念及生命尊嚴(yán)的挑戰(zhàn)和倫理爭(zhēng)議［45-46］。合成生物食品的商業(yè)化也存在倫理風(fēng)險(xiǎn)，譬如合成生物食品的法律定義以及對(duì)自然環(huán)境和人類社會(huì)的倫理影響［47-48］。

2005 年，聯(lián)合國(guó)教科文組織發(fā)布《世界生物倫理和人權(quán)宣言》，重申設(shè)立倫理委員會(huì)以評(píng)估涉及生物的研究是否違背倫理的必要性，強(qiáng)調(diào)生物科學(xué)研究必須符合倫理道德的基本準(zhǔn)則。2017 年，美國(guó)農(nóng)業(yè)部和食品藥品監(jiān)督管理局正式就細(xì)胞培育肉類產(chǎn)品的商業(yè)化制定了規(guī)則框架，為人造食品行業(yè)的健康發(fā)展提供法律指導(dǎo)。歐盟各國(guó)對(duì)于合成生物食品的商業(yè)化發(fā)展普遍持謹(jǐn)慎態(tài)度，其新食品法規(guī)明確規(guī)定，由細(xì)胞培養(yǎng)物或源自動(dòng)物的組織培養(yǎng)物產(chǎn)生的食物都將被視作一種新型食品，因此需要建立與之相適應(yīng)的法律監(jiān)管體系和生物倫理規(guī)范。我國(guó)已審議通過(guò)的《生物安全法》規(guī)定，包括基因編輯、合成生物等前沿生物技術(shù)相關(guān)的研究、開發(fā)與應(yīng)用活動(dòng)必須在符合倫理原則的框架下進(jìn)行。

進(jìn)入新世紀(jì)以來(lái)，合成生物學(xué)、生物信息學(xué)、仿生學(xué)以及人工智能等新興科學(xué)迅猛發(fā)展，正推動(dòng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式從傳統(tǒng)的馴化蓄養(yǎng)農(nóng)業(yè)、工業(yè)化農(nóng)業(yè)向細(xì)胞農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)變［49-51］。細(xì)胞農(nóng)業(yè)是以基因工程和細(xì)胞工程為技術(shù)核心，將革命性改變農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)與供應(yīng)鏈，為不斷增長(zhǎng)的人口提供可持續(xù)和更健康的食品［52-54］，為世界農(nóng)業(yè)碳達(dá)峰和碳中和目標(biāo)實(shí)現(xiàn)提供不可替代的科技支撐。此外，細(xì)胞農(nóng)業(yè)可以根據(jù)要求對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行個(gè)性化的設(shè)計(jì)和調(diào)整，這將是綠色安全高品質(zhì)食品的未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)［38，55-56］。毫無(wú)疑問(wèn)，人造奶的營(yíng)養(yǎng)與風(fēng)味與天然牛奶相當(dāng)，但不含乳糖、膽固醇、抗生素和致敏原等不良因子，其生產(chǎn)過(guò)程無(wú)需養(yǎng)殖動(dòng)物，可以有效節(jié)約資源與能源，是一種顛覆傳統(tǒng)養(yǎng)殖業(yè)的未來(lái)乳制品生產(chǎn)新模式，將引領(lǐng)未來(lái)食品產(chǎn)業(yè)和細(xì)胞農(nóng)業(yè)發(fā)展方向［57］。