孫文濤，張昕哲，萬盛通，王茹雯，李春，

（1 清華大學化工系，北京 100084；2 北京理工大學化學與化工學院，北京 100101）

細胞色素P450 酶（P450）可催化碳氫鍵氧化、脫甲基、脫飽和等二十余類反應，在植物次級代謝產(chǎn)物的生物合成中扮演著重要的角色，是萜烯化合物、生物堿及黃酮等多種天然產(chǎn)物合成中的關鍵修飾酶［1-2］，在高價值天然產(chǎn)物的異源合成中被廣泛研究和應用［3-7］，比如重要保肝護肝藥物甘草次酸的合成過程中，CYP88D6 與CYP72A154 對骨架分子β-香樹脂醇C-11 與C-30 進行連續(xù)氧化最終將其轉(zhuǎn)化成甘草次酸［8-9］。

P450 是一種含血紅素蛋白，利用分子氧及NAD（P）H 對底物進行加氧反應，根據(jù)P450 酶從NAD（P）H 獲取電子的方式不同可將其分為4 種類型：Ⅰ型P450酶的氧化還原伴侶需要一個包含F(xiàn)AD的還原酶以及一個鐵氧還蛋白構成；Ⅱ型P450酶的氧化還原伴侶為一個同時包含F(xiàn)MN和FAD結(jié)構域的單一蛋白又稱P450還原酶（CPR）；Ⅲ型P450酶為自給自足的蛋白，其實質(zhì)為P450酶與氧化還原伴侶形成的多結(jié)構域蛋白；Ⅳ型P450 酶可以直接從NAD（P）H中獲取電子，不需要額外的氧化還原伴侶蛋白或結(jié)構域。其中細菌等原核生物來源的P450酶多為Ⅰ型和Ⅲ型，且通常為游離蛋白，動物、植物等來源的P450酶多為Ⅱ型，且通常為膜蛋白，具有N端跨膜結(jié)構域，比如甘草來源的CYP88D6 與CYP72A154［10］。

由于Ⅱ型P450 酶難以純化，因此目前對于其反應特性調(diào)控的研究較少。基于同源建模等方法，張學禮課題組通過對來自于犁頭霉菌的CYP5311B2底物通道進行改造提高其催化活性，使工程菌的氫化可的松產(chǎn)量提高了3倍［11］。Schele等通過同源建模和定點突變對鐵銹醇合酶CYP76AH1 以及11-羥基鐵銹醇合酶 CYP76AH4、 CYP76AH22、CYP76AH23、 CYP76AH24 進 行 改 造 發(fā) 現(xiàn) 301、303以及478的氨基酸是決定11-羥基鐵銹醇合酶選擇性氧化鐵銹醇的關鍵氨基酸位點［12］。當前對于P450 催化特性調(diào)控的相關研究主要集中于可溶性的P450酶，如來自巨大芽孢桿菌的P450BM3［13-15］。研究人員通過對其活性口袋進行重塑實現(xiàn)了其區(qū)域和立體選擇性的調(diào)控，可控合成了對苯二酚、2β-羥基睪丸酮等化合物，并進一步拓寬了P450 酶催化反應的范疇，成功實現(xiàn)了S—N 鍵、C—Si鍵、C—B 鍵的形成以及芳基烯烴的氮雜環(huán)丙烷化、卡賓向炔烴的轉(zhuǎn)移反應等一系列新型反應［16-19］。

為實現(xiàn)Ⅱ型P450 酶催化特性的調(diào)控，解決甘草次酸合成關鍵酶，來源于蒺藜狀苜蓿的CYP72A63（AB558146.1）催化的底物選擇性、區(qū)域選擇性以及氧化進程不可控的問題，提高甘草次酸合成特異性與合成效率。課題組前期通過計算機輔助的理性設計與釀酒酵母驗證平臺，重塑了CYP72A63 的催化口袋，獲得高活性突變體CYP72A63（T338S）可對 11-氧-β-香樹脂醇 C-30 特異性的連續(xù)氧化，實現(xiàn)甘草次酸的可控合成。然而仍然無法解決其底物選擇性差的問題，CYP72A 63（T338S）可同時對β-香樹脂醇以及 11-氧-β-香樹脂醇的C-30 進行氧化，導致副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸的合成。在酶改造過程中我們發(fā)現(xiàn)，除了活性口袋重塑外，Ⅱ型P450 酶與其氧化還原伴侶CPR之間的相互作用可改變其催化活性以及選擇性，影響工程菌甘草次酸產(chǎn)量及產(chǎn)物譜［20］。這種現(xiàn)象同樣出現(xiàn)在Ⅰ型P450 酶中，李盛英等通過重構P450酶MycG與氧化還原伴侶的組合，重建了其催化功能，實現(xiàn)了4種新產(chǎn)物的合成［19］，這說明P450酶催化系統(tǒng)組成成分之間的相互作用會對P450的催化特性產(chǎn)生顯著影響。由于Ⅱ型P450酶多定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，除CPR外，P450、CPR與膜之間的相互作用都可能對P450 酶催化特性產(chǎn)生影響［21］。為實現(xiàn)CYP72A63（T338S）底物選擇性的調(diào)控，本文對于跨膜域、膜組分代謝等因素對P450酶催化特性調(diào)控的影響進行了研究，以期獲得能夠調(diào)控其底物選擇性的新方法，以CYP72A63（T338S）為對象，開發(fā)Ⅱ型細胞色素P450酶催化選擇性調(diào)控的新策略。

1 材料與方法

1.1 菌株與Ⅱ型P450酶突變體

1.2 基因克隆與表達質(zhì)粒的構建

本研究中利用諾唯贊Phanta HS Super-Fidelity DNA Polymerase 進 行 PCR 擴 增 ， PCR 產(chǎn) 物 用Thermo Scientific GeneJET 膠回收試劑盒進行純化。通過吉布森組裝將啟動子、基因、終止子、同源臂等按照需求進行多片段組裝（成分如表1所示），構建含有目標表達盒的質(zhì)粒，隨后利用化學轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α 感受態(tài)并涂布到含有100 mg/L 氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，置于37 ℃靜置培養(yǎng)過夜。通過PCR驗證，獲得條帶正確的質(zhì)粒由擎科生物技術有限公司進行測序驗證后備用。

表1 本研究所涉及的菌種信息Tab.1 Strains used in this study

（1）5×ⅠSO緩沖液配制（表2）

表2 5×ⅠSO緩沖液組分Tab.2 Components of the 5×ⅠSO buffer

（2）Gibson反應液配制（表3）

表3 Gibson反應液組分Tab.3 Components of Gibson reaction solution

1.3 蛋白跨膜域預測

使用跨膜域預測軟件TMHMM對蛋白質(zhì)跨膜域進行預測（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）［22］。

1.4 酵母轉(zhuǎn)化與培養(yǎng)

酵母轉(zhuǎn)化采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，將新鮮酵母宿主細胞接入2 mL YPD 培養(yǎng)基中，在30 ℃下200 r/min 過夜培養(yǎng)后，以10%的接種量接入新鮮YPD 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)4～5 h，至細胞濃度大約為2×107cells/mL。吸取適量菌液到無菌的1.5 mL離心管中，5000 r/min 離心2 min 后水洗一次并收集細胞。用1 mL 濃度100 mmol/L 的醋酸鋰溶液將細胞重懸并靜置5 min，隨后4000 r/min 離心3 min棄上清。依次在菌體中加入適量DNA 片段、10 μL ssDNA、240 μL 500 g/L PEG3350、36 μL 1 mol/L 醋酸鋰，加水至總體積360 μL。渦旋振蕩充分混勻，依次30 ℃保溫30 min、42 ℃水浴20～30 min，4000 r/min 離心3 min 收集沉淀隨后用1 mL 無菌水清洗菌體。取適量菌液涂平板，30 ℃培養(yǎng)2～4天，PCR驗證正確后進行發(fā)酵驗證［23］。

挑取少量PCR 驗證正確的菌體接入適量新鮮YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～24 h制備種子液，以10%接種量接入新鮮YPD 培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min，培養(yǎng)5天后提取發(fā)酵產(chǎn)物。

1.5 基因表達水平檢測

將工程釀酒酵母接在YPD 培養(yǎng)基中培養(yǎng)后提取總RNA 并反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板利用FastStart Essential DNA Green Master 試劑盒（Roche）通過實時熒光定量PCR 對基因轉(zhuǎn)錄進行相對定量。管家基因ACT1為內(nèi)參基因。

1.6 酵母RNA-Seq

工程酵母接在YPD 培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)30 h后，5000 r/min 離心2 min 收集菌體，并用無菌水洗滌菌體3 次后轉(zhuǎn)入-80 ℃短暫保存，隨后由北京博云華康基因科技有限公司完成RNA-seq。

1.7 工程酵母代謝產(chǎn)物的樣品處理

酵母發(fā)酵結(jié)束后，取60 mL 菌液用6 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)pH 至3 以下，對其進行超高壓破碎。取2 mL 超高壓破碎的勻漿，加入等體積乙酸乙酯，渦旋振蕩10 min。將勻漿12 000 r/min離心10 min，吸取上清并轉(zhuǎn)移至液相小瓶。在真空干燥儀中60 ℃干燥至乙酸乙酯完全揮發(fā)。加入100μL吡啶與100μLN，O-雙（三甲基硅基）三氟代乙酰胺，混勻后80 ℃反應30 min。冷卻至室溫后，將反應液轉(zhuǎn)入200μL套管后置于液相小瓶中，準備上機檢測。

1.8 GC-MS產(chǎn)物鑒定

使用島津GCMS-QP2010 Ultra，配備低流失色譜柱SH-Rxi-5Sil MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm，島津，日本）。進樣口溫度250 ℃，分流比5∶1，進樣1 μL，載氣氦氣的流速為1.2 mL/min。升溫程序：80 ℃保持 1 min，以 20 ℃/min 升至 290 ℃，保持38 min；色譜質(zhì)譜接口溫度為290 ℃。質(zhì)譜掃描范圍為m/z50～700。使用外標法對其進行定性定量［24-25］。

2 結(jié)果與討論

2.1 跨膜域?qū)YP72A63（T338S）催化特性的影響

Ⅱ型細胞色素P450 酶的跨膜結(jié)構對于酶的催化活性具有重要影響［26-27］。在大腸桿菌中表達時，增溶修飾（N 端融合增溶序列，截除跨膜域等）可以提高Ⅱ型P450 酶的溶解性，但是酶與膜相互作用的破壞會對其活性產(chǎn)生顯著的抑制作用，CYP11B1 的N 端突變甚至會對其選擇性產(chǎn)生影響［26-27］。為進一步探究在酵母體內(nèi)表達時跨膜域?qū)YP72A63（T338S）催化特性的影響，本研究將酵母內(nèi)源細胞色素P450 酶ERG11（YHR007C）、ERG5（YMR015C）與其他內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位蛋白ERG1（YGR175C）、ERG2（YMR202W）、NTE1（YML059C）的 N 端跨膜域，以及 GPⅠ8（YDR331W）、KAR1（YNL188W）的C 端跨膜域，直接融合在突變體CYP72A63（T338S）的 N 端以對其 跨 膜域進行改造。

利用TMHMM 對改造后的嵌合蛋白跨膜域結(jié)構進行預測，結(jié)果如圖1 所示。其中紅色柱狀區(qū)域出現(xiàn)的次數(shù)代表跨膜螺旋的數(shù)量，橫坐標代表氨基酸位點，融合ERG5N（ERG5 的N 端跨膜域）、GPⅠ8C（GPⅠ8 的 C 端跨膜域）后仍為單跨膜域蛋白，跨膜域由29 個氨基酸分別延長為69 個和43 個氨基 酸 ；融 合 ERG2N（ERG2 的 N 端 跨 膜 域 ）、KAR1C（KAR1 的C 端跨膜域）后，由單跨膜域改變?yōu)殡p跨膜域蛋白；融合ERG11N（ERG11 的N 端跨膜域）與NTE1N（NTE1 的N 端跨膜域）后則變?yōu)槿缒び虻鞍?，這說明內(nèi)源內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白跨膜域的融合顯著改變了CYP72A63（T338S）的跨膜結(jié)構（圖1）。

圖1 跨膜域改造后CYP72A63（T338S）的TMHMM預測結(jié)果Fig.1 TMHMM prediction for the transmembrane-domain-modified CYP72A63(T338S)

為確定跨膜域改造對CYP72A63（T338S）催化特性的影響，所獲得的嵌合蛋白突變體均在釀酒酵母底盤GA0-1 體內(nèi)進行功能驗證。結(jié)果表明，跨膜域的改造對CYP72A63（T338S）的催化特 性 影 響 顯 著（ 圖 2）。 ERG5N、 KAR1C、ERG2N 對其活性有顯著的抑制作用，KAR1C、ERG2N 直接導致其失活，這也說明這些雙跨膜域的結(jié)構對該酶活性有顯著的抑制作用，其可能原因為改造后的跨膜域無法在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上正確定位與折疊從而導致了該酶的失活，在改造過程中應避免這種結(jié)構的形成。但是融合NTE1N 后降低了CYP72A63（T338S）對底物β-香樹脂醇選擇性，顯著抑制了其氧化β-香樹脂醇的能力，降低甘草次酸合成過程中副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸的合成。而 GPⅠ8C 進一步提高了 CYP72A63（T338S）對底物β-香樹脂醇的選擇性，促進了甘草次酸合成過程中副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸的合成（圖2）。這一結(jié)果說明，跨膜域的改造對于細胞色素P450酶的催化特性具有顯著的影響，通過對跨膜區(qū)域進行改造是一種調(diào)控Ⅱ型P450 酶底物選擇性的有效策略。

圖2 不同跨膜結(jié)構對CYP72A63（T338S）底物選擇性的影響Fig.2 Ⅰnfluence of the transmembrane structures on the substrate selectivity of CYP72A63(T338S)

2.2 細胞膜組分對CYP72A63（T338S）底物選擇性的影響

脂質(zhì)是生物膜的主要組成成分，細胞中脂質(zhì)組分的調(diào)整對于維持膜的結(jié)構穩(wěn)定性具有重要作用［28］，膜結(jié)構為膜蛋白發(fā)揮功能的支架，也會對膜結(jié)合的P450 酶與CPR 之間的相互作用產(chǎn)生影響，從而影響P450 的催化活性［29］。研究表明，在蛋白與蛋白以及蛋白與脂質(zhì)之間的相互作用下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上能夠形成富含甾醇以及鞘脂的脂質(zhì)微結(jié)構域，這些微結(jié)構域是P450 以及CPR 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上定位的重要場所，鞘脂分子結(jié)構以及種類的改變可能會重塑這些微結(jié)構域，影響定位其中的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，以及蛋白質(zhì)與脂質(zhì)之間的相互作用，進而影響P450 酶的催化特性［30-31］。

在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，相同的P450 酶在不同的宿主中表達時，其活性差異較大。以Sgib［32］以及與SynV［33］為宿主，利用 CYP72A63（T338S）在胞內(nèi)重構甘草次酸的合成途徑時，在相同條件下，底物11-氧-β-香樹脂醇有大量剩余時，其甘草次酸產(chǎn)量差異顯著，分別為8 mg/L 與30 mg/L，這說明兩種宿主中P450的活性存在差異。

本研究對兩種工程菌進行轉(zhuǎn)錄組分析時發(fā)現(xiàn)，參與鞘脂合成的FAA1以及SUR2在Sgib 中顯著高表達（表4），為驗證這些差異對CYP72A63（T338S）催化特性的影響，本研究在GA160 中對其進行了敲除，結(jié)果表明SUR2的敲除顯著改變了CYP72A63（T338S）的催化底物選擇性。該基因敲除雖然降低了甘草次酸的合成能力，但是顯著提高了 CYP72A63（T338S）對底物 11-氧-β-香樹脂醇的選擇性，抑制了甘草次酸合成過程中β-香樹脂醇氧化導致的副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸的合成，使甘草次酸所占比例由82.9%提高至97.6%（圖3）。SUR2敲除抑制了神經(jīng)酰胺向植物神經(jīng)酰胺的轉(zhuǎn)化過程，造成神經(jīng)酰胺的積累，從而改變了膜結(jié)構中鞘脂的組成成分，這說明膜結(jié)構中鞘脂結(jié)構的改變對膜結(jié)合的Ⅱ型細胞色素P450 酶的催化特性具有顯著的影響。

圖3 敲除FAA1及SUR2的工程菌株產(chǎn)物分布Fig.3 Product profile of the strains with FAA1or SUR2 knock out

表4 不同宿主中脂質(zhì)代謝相關基因的轉(zhuǎn)錄豐度Tab.4 Transcription levels of genes associated to lipid metabolism in different strains

2.3 調(diào)節(jié)鞘脂合成途徑調(diào)控CYP72A63（T338S）底物選擇性

SUR2的敲除對CYP72A63（T338S）的底物選擇性產(chǎn)生了顯著的影響，這表明脂質(zhì)成分的改變，尤其鞘脂的成分和結(jié)構的改變對于P450 酶的催化特性影響顯著。鞘脂由神經(jīng)酰胺骨架、極性頭和超長鏈脂肪酸（C18～C26）構成，鞘脂分子中超長鏈脂肪酸的長度的改變會對生物膜的結(jié)構產(chǎn)生影響，同時游離超長鏈脂肪酸的含量的改變對細胞膜結(jié)構也有一定的影響［34-35］。

在釀酒酵母中，脂肪酸碳鏈的延長由elo1p、elo2p、elo3p 三種酶催化，其中C18CoA 主要由elo1p 與 elo2p 合成，C26CoA 主要由 elo2p、elo3p 合成。因此，本研究對工程菌中編碼這三種蛋白的基因ELO1、ELO2、ELO3基因進行了過表達，促進超長鏈脂肪酸合成。結(jié)果表明，三個基因的過表達對于CYP72A63（T338S）的底物選擇性沒有顯著影響，11-脫氧甘草次酸和甘草次酸的產(chǎn)量沒有產(chǎn)生顯著變化，但是這些基因的過表達顯著促進了其前體物質(zhì)β-香樹脂醇的積累，其可能原因為鞘脂結(jié)構的改變提高了膜結(jié)構對于無羧基三萜產(chǎn)物的容納能力（圖4）。

圖4 過表達ELO1、ELO2、ELO3工程菌中三萜化合物的產(chǎn)量Fig.4 Production of triterpenoids in the engineered strains overexpressing ELO1,ELO2 and ELO3

植物來源的酶在酵母中進行異源表達時，活性低、特異性差是一種常見現(xiàn)象。由于細胞色素P450 酶為膜蛋白，影響其活性的原因之一可能為植物與酵母細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜脂質(zhì)成分的不同。

葡萄糖神經(jīng)酰胺是植物鞘脂的主要成分之一，由鞘氨醇和脂酰-CoA經(jīng)葡萄糖神經(jīng)酰胺合酶催化合成［36］，通過對釀酒酵母基因組進行檢索發(fā)現(xiàn)，其基因組中不存在葡萄糖神經(jīng)酰胺合酶及其同工酶，對釀酒酵母代謝組進行檢索也未發(fā)現(xiàn)葡萄糖神經(jīng)酰胺［37］，該差異可能為導致植物來源的酶在釀酒酵母中催化特性差的原因。為驗證葡萄糖神經(jīng)酰胺對三萜合成的影響，本研究在釀酒酵母工程菌GA160的YPRCtau3位點中引入的來源于苜蓿（Mt）、畢赤酵母（Pa）以及解脂酵母（Ya）的葡萄糖神經(jīng)酰胺合酶（GCS）。結(jié)果表明，來自于畢赤酵母的葡萄糖神經(jīng)酰胺合酶PaGCS2提高了CYP72A63（T338S）對底物β-香樹脂醇選擇性，顯著促進了11-脫氧甘草次酸的合成（圖5）。綜合以上結(jié)果，調(diào)節(jié)酵母鞘脂代謝，改變其組成對P450酶的催化特性具有顯著的影響，通過控制鞘脂合成可實現(xiàn)對Ⅱ型P450酶底物選擇性的調(diào)控。

圖5 過表達外源葡萄糖神經(jīng)酰胺合酶工程菌的三萜產(chǎn)量Fig.5 Production of triterpenoids in the engineered strains overexpressing heterogenous GCSs

2.4 調(diào)控雙步氧化比例提高CYP72A63（T338S）反應特異性

甘草次酸合成過程中，中間產(chǎn)物11-氧-β-香樹脂醇以及副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸的合成前體均為β-香樹脂醇，因此催化11-氧-β-香樹脂醇合成的Uni25647 以及催化副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸合成的CYP72A63（T338S）之間存在底物競爭關系，通過提高Uni25647的活性，增強其競爭底物β-香樹脂醇的能力，有望削弱CYP72A63（T338S）氧化β-香樹脂醇合成11-脫氧甘草次酸的能力。強化酶的表達是提高酶催化能力的一種直接有效的方式，因此本研究在GA160基礎上，將Uni25647基因的啟動子更換成表達強度更高的Gal7啟動子，構成菌株GA180-1。結(jié)果表明，更換強度更高的Gal啟動子后對甘草次酸的合成無顯著的促進作用，但顯著促進了CYP72A63（T338S）對底物 11-氧-β-香樹脂醇的特異性氧化，完全抑制了甘草次酸合成過程中副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸的合成，甘草次酸產(chǎn)量為（31.6 ±2.2）mg/L相比于對照（30.3±1.7）mg/L沒有顯著變化（圖 6）。通 qPCR 對菌株 GA160 與 GA180-1 中Uni25647及CYP72A63（T338S）基因轉(zhuǎn)錄水平進行測定發(fā)現(xiàn)，在GA180-1中Uni25647基因轉(zhuǎn)錄水平提高了18.8倍，Uni25647與CYP72A63（T338S）轉(zhuǎn)錄豐度的比例由1∶24.5提高至1∶1.5。Uni25647表達水平的提高，強化了其對于β-香樹脂醇的競爭力，導致β-香樹脂醇代謝流均流向Uni25647 催化的11-oxo-βamyrin合成反應從而抑制了11-脫氧甘草次酸的合成，使工程菌11-氧-β-香樹脂醇產(chǎn)量由（51.0±2.4）mg/L提高至（67.9±7.4）mg/L，由于CYP72A63（T338S）催化活性沒有得到顯著的促進，因此甘草次酸的產(chǎn)量并未獲得顯著的提高。這一結(jié)果說明通過調(diào)節(jié)具有底物競爭關系的催化酶比例的策略可實現(xiàn)對其反應、特異性的控制（圖6）。

圖6 Uni25647表達強化后工程菌的產(chǎn)物的分布（a）及P450酶的相對轉(zhuǎn)錄豐度（b）Fig.6 Product profile(a)and the relative transcription abundance of P450 enzymes after up-regulating Uni25647 expression(b)

3 討論

相比于化學催化，P450 酶是一種高選擇性的催化劑，具有更強的區(qū)域和立體選擇性，但是許多P450 酶催化仍然具有一定的雜泛性，比如CYP72A63 可以氧化β-香樹脂醇的 C-30 與 11-氧-β-香樹脂醇的C-29和C-30兩個位點，合成11-脫氧甘草次酸、甘草次醇、甘草次醛、29-羥-11-氧-β-香樹脂、甘草次酸五種產(chǎn)物，其突變體CYP72A63（T338S）雖然可以實現(xiàn)良好的C-30區(qū)域選擇性，但是可以同時氧化β-香樹脂醇和11-氧-β-香樹脂醇導致合成甘草次酸過程中同時合成副產(chǎn)物11-脫氧甘草次酸，即導致底物的消耗也增加了目標產(chǎn)物分離純化的難度［18］。

要實現(xiàn)目標產(chǎn)物的高效選擇性合成，需要進一步增強P450 酶的催化選擇性。酶催化口袋的幾何結(jié)構、化學環(huán)境等因素是決定其催化特性的關鍵，通過對P450 酶活性口袋進行重塑，獲得了多種具有良好區(qū)域選擇性、立體選擇性等催化特性的突變體［14，34］。同時，研究發(fā)現(xiàn)與P450 酶存在蛋白與蛋白之間相互作用的氧化還原伴侶也會對P450 的催化特性產(chǎn)生顯著影響。在Ⅱ型P450 酶中，除了CPR 與P450 酶的相互外，還存在膜、P450 酶和CPR 三者之間的相互作用。這些相互作用同樣對P450 的催化特性具有顯著影響，研究表明，膜組分磷脂酰膽堿是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中促進CPR 與P450 相互作用的主要成分，除此之外，另外一種組分磷脂酰乙醇胺能夠促進CPR 與CYP2B4 之間的電子傳遞效率從而提高其催化活性［31］。為進一步探索膜對P450 酶的影響，本研究中對連接膜與蛋白的跨膜域以及膜組分鞘脂合成的關鍵途徑進行了改造，發(fā)現(xiàn)跨膜域?qū)YP72A63（T338S）催化的底物選擇性具有顯著的影響，本研究中利用該特性開發(fā)了一種通過改造CYP72A63（T338S）跨膜域控制其底物選擇性的策略。通過對鞘脂合成途徑的調(diào)控發(fā)現(xiàn)，改變鞘脂成分也是一種實現(xiàn)對P450 催化底物選擇性的調(diào)控的有效方法，然而鞘脂成分改變以及跨膜域改造對酶活性的調(diào)控機制并不清晰，在后期的研究中，通過蛋白質(zhì)晶體結(jié)構解析、分子動力學模擬等方法，闡明膜結(jié)構以及P450 跨膜域結(jié)構變化對其催化結(jié)構域構象的影響將會促進鞘脂成分改變以及跨膜域改造對P450酶活性調(diào)控機制的解析。

除了改變催化劑本身的催化特性外，從化合物合成過程的角度出發(fā)，也可以為我們提供反應調(diào)控的新思路。在天然產(chǎn)物的生物合成過程中，由于酶的雜泛性，導致下游反應的酶可以催化上游酶的底物，在兩種酶之間形成底物競爭關系，從而導致副產(chǎn)物的合成。這種情況下提高上游酶的催化活性，強化其底物競爭能力會顯著降低甚至消除下游酶對上游底物的消耗，起到抑制副產(chǎn)物合成的作用。在本研究中，通過強化甘草次酸合成過程中的上游P450 酶Uni25647 的催化活性，增強其競爭底物β-香樹脂醇的能力，完全消除了下游酶CYP72A63（T338S）對于β-香樹脂醇的氧化，這也進一步說明，調(diào)控合成途徑中具有底物競爭關系的酶的表達比例，也是一種改變酶催化的底物選擇性、消除副產(chǎn)物產(chǎn)生的有效策略。

不同于傳統(tǒng)的P450 酶催化結(jié)構域改造以及還原伴侶工程來調(diào)控P450 酶的催化特性，本研究通過改造P450 酶的跨膜結(jié)構域以及調(diào)控膜組分的代謝實現(xiàn)了Ⅱ型P450 酶催化的底物選擇性的調(diào)控，改變了CYP72A63（T338S）對于兩種底物β-香樹脂醇以及11-氧-β-香樹脂醇的氧化選擇性；同時本研究發(fā)現(xiàn)，通過改變具有底物競爭關系的酶的表達比例，是一種消除級聯(lián)反應過程中由于上下游酶均可氧化同一種底物而導致的副產(chǎn)物的有效方法，為Ⅱ型P450 酶催化特異性的調(diào)控提供了更加豐富的策略，然而跨膜域結(jié)構以及膜組分代謝對于P450催化特性影響的機制仍需更加深入的研究。