周海波，申琪瑤，陳漢娜，王宗杰，李越中，張友明，卞小瑩

（山東大學(xué)，微生物技術(shù)國家重點實驗室，山東 青島 266237）

黏細菌屬于革蘭氏陰性細菌，是新穎活性天然產(chǎn)物的重要來源，具有巨大的藥用開發(fā)潛力。目前已從黏細菌中發(fā)現(xiàn)了大約100多種次級代謝產(chǎn)物的基本結(jié)構(gòu)和600多種結(jié)構(gòu)類似物。這些化合物不僅結(jié)構(gòu)類型豐富，包括聚酮類、非核糖體肽、萜類以及其他雜合的結(jié)構(gòu)類型，同時也顯示了廣泛的生物活性，如抗菌、抗腫瘤、抗病毒、免疫抑制、抗瘧等［1-6］。

隨著基因組測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的基因組信息分析表明黏細菌基因組所蘊藏的生物合成基因簇（biosynthetic gene cluster，BGC）合成新穎次級代謝產(chǎn)物的潛力遠遠超出了目前已分離獲得的化合物的數(shù)目。例如，抗腫瘤藥物埃博霉素（epothilone）的產(chǎn)生菌纖維堆囊菌So0157-2（Sorangium cellulosumSo0157-2）的基因組測序結(jié)果表明，該菌株擁有14.78 Mb 的環(huán)狀染色體，是目前已知基因組最大的原核生物［7-9］。除了已知的埃博霉素系列衍生物［10-15］之外仍未見其他化合物從該菌株中分離報道，這預(yù)示著該菌株仍具有較大的代謝潛能。對隱性基因簇進行有效的激活和改造，能夠為藥物先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)提供更多的化合物資源。由于纖維堆囊菌So0157-2 生長相對較慢、培養(yǎng)困難，本源菌也缺乏合適的遺傳操作體系，對其天然產(chǎn)物的開發(fā)存在著諸多挑戰(zhàn)。

近年來天然產(chǎn)物生物合成基因簇的異源表達策略受到了越來越廣泛的關(guān)注。異源表達是將完整的基因簇克隆到穿梭載體上然后轉(zhuǎn)移到合適的異源宿主中進行表達，是挖掘難培養(yǎng)或未培養(yǎng)微生物次級代謝產(chǎn)物的有效手段。相比于原始宿主，異源宿主在遺傳操作和生長速度上有較大優(yōu)勢。一方面，異源表達可以用于提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。另一方面，異源表達可以用于鑒定已知天然產(chǎn)物的生物合成途徑。此外，異源表達還可以用于鑒定隱性基因簇，發(fā)現(xiàn)新型天然產(chǎn)物，特別有利于難培養(yǎng)或未培養(yǎng)微生物次級代謝產(chǎn)物的挖掘［16-19］。

異源表達的難點之一在于大部分天然產(chǎn)物生物合成基因簇都相當(dāng)大（＞10 kb），PCR 擴增很難得到如此長的DNA 序列。通過構(gòu)建和篩選基因文庫雖然能夠獲得目的基因簇，但是工作量非常大，且不一定能獲得完整的基因簇。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展和進步，可以利用直接克隆技術(shù)（direct cloning）從基因組中克隆大型基因簇，比如LLHR（linear-linear homologous recombination）、 TAR（transformation-associated recombination）、CATCH（Cas9 assisted targeting of chromosome segments）等［20］。其中LLHR是由本團隊于2012年開發(fā)的基于Red/ET 重組工程技術(shù)（recombineering）的直接克隆技術(shù)［21］，并與異源表達相結(jié)合，廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物基因簇的挖掘。2018年將Red/ET重組工程技術(shù)與核酸外切酶體外處理技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)了ExoCET（exonuclease combined with RecET recombination）克隆技術(shù)，進一步提高了BGCs 直接克隆的效率［22］。此外，Red/ET 重組工程技術(shù)還可以用于基因簇的無痕定點突變，結(jié)構(gòu)域替換等等，極大促進了大型基因簇的遺傳操作［22-28］。

異源表達的另一個難點在于異源宿主的選擇。大腸桿菌和釀酒酵母都是表征良好、易于遺傳操作的模式菌株，為細菌和真菌中天然產(chǎn)物的表達提供了良好的異源宿主［29-31］。研究者也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)宿主菌與包含目標基因簇的菌株在進化上相近時，異源表達就更易成功。所以，很多鏈霉菌被開發(fā)為異源宿主菌，用于放線菌中基因簇的異源表達［32-33］?？捎糜陴ぜ毦愒幢磉_的異源宿主菌相對缺乏，目前常用的有黃色黏球菌（Myxococcus xanthus）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）以及Schlegelella brevitaleaDSM 7029（曾用名：BurkholderialesStrain DSM 7029，［Polyangium］brachysporumDSM 7029）等［16-18］。除了黃色黏球菌和S.brevitaleaDSM 7029之外，其他異源宿主產(chǎn)量普遍較低。黃色黏球菌也屬于黏細菌屬，自身生長周期慢、難于進行遺傳操作等劣勢也限制了其應(yīng)用。S.brevitaleaDSM 7029 是一株能夠產(chǎn)生多種非核糖體肽、聚酮-非核糖體肽雜合化合物的革蘭氏陰性細菌，相較于黃色黏球菌具有生長快、易操作、代謝背景清晰等諸多優(yōu)點，特別是在表達纖維堆囊菌來源埃博霉素中顯示了作為通用底盤菌的潛力［34-37］。因此，該菌株可作為本研究的異源宿主候選菌。

基于纖維堆囊菌So0157-2 基因組信息預(yù)測分析所顯示出的代謝潛能，本論文利用ExoCET 直接克隆技術(shù)從該菌基因組DNA 中克隆了1 個未知功能的NRPS-PKS 雜合的基因簇BGC18。通過啟動子插入，并以S.brevitaleaDSM 7029為異源宿主進行異源表達，經(jīng)過液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）分析，正相與反相色譜柱靶向分離純化，獲得了3個該基因簇對應(yīng)的表達產(chǎn)物。最后，通過核磁共振（NMR）結(jié)構(gòu)鑒定和Marfey 反應(yīng)確定了3 個化合物分別為新天然產(chǎn)物Cyclo（N-Me-L-Leu-L-Val）（1）和 Cyclo （N-Me-L-Leu-L-Leu）（2）， 新 化 合 物Cyclo（N-Me-L-Leu-L-Ⅰle）（3）。將化合物結(jié)構(gòu)與生物合成基因簇對比分析發(fā)現(xiàn)化合物結(jié)構(gòu)的多樣性來源于第1 個腺苷化結(jié)構(gòu)域（A domain）對底物識別的寬泛性。此外，推測由于缺少硫醇化結(jié)構(gòu)域（T domain）導(dǎo)致PKS 模塊被跳過，從而只獲得了兩個NRPS模塊指導(dǎo)合成的環(huán)二肽產(chǎn)物。該研究成功構(gòu)建了基于Red/ET 重組工程技術(shù)的纖維堆囊菌So0157-2 基因簇的直接克隆、遺傳修飾和異源表達體系，不僅豐富了纖維堆囊菌So0157-2 的代謝產(chǎn)物庫，也為挖掘該菌株中其他新穎的天然產(chǎn)物用于藥物篩選評價奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

本研究所用的菌株和質(zhì)粒見表1。寡核苷酸引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，本研究所用的寡核苷酸序列見表2。

表1 本研究所用的菌株和質(zhì)粒Tab.1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究所用的引物Tab.2 Primers used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：酵母粉0.5%，蛋白胨1%，NaCl0.1%，pH 7.0。

CYMG 培養(yǎng)基：胰蛋白胨0.8%，酵母粉0.4%，MgCl2·2H2O 0.4%，甘油5 mL/L。

M26 培養(yǎng)基：土豆淀粉0.8%，葡萄糖0.2%，蛋白胨0.2%，酵母提取物0.2%，CaCl2·2H2O 0.1%，微量元素液1 mL/L；pH 7.0。

VY/2 培 養(yǎng) 基 ： 鮮 酵 母 0.5%， MgSO4·7H2O 0.4%，維生素B120.005%，CaCl2·2H2O 0.1%。

以上固體培養(yǎng)基均添加1.5%的瓊脂。

1.1.3 主要試劑和儀器

限制性DNA 內(nèi)切酶、T4 DNA 聚合酶購自New England BioLabs 公司；PrimeSTAR Max DNA聚合酶、DNA Marker 購自Takara 公司；卡那霉素（kanamycin，km）、氯霉素（chloramphenicol，cm）購自上海生工生物工程有限公司；培養(yǎng)基組分購自北京索萊寶生物科技有限公司；分析純甲醇、無水乙醇、異丙醇購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；色譜級甲醇、乙腈購自Thermo Fisher 科技有限公司。

液質(zhì)聯(lián)用儀型號為Thermo Fisher UltiMate3000與Bruker Amazon SL聯(lián)用；高效液相色譜儀型號為Agilent 1260；電轉(zhuǎn)儀型號為Eppendorf AG 4309；核磁共振波普儀型號為Agilent 500 MHz DD2；HPLC 制備所用色譜柱型號為Agilent ZORBAX SB-C18，9.4 mm×250 mm，5 μm；液質(zhì)分析所用色譜柱為Thermo Scientific Acclaim RSLC 120 C18，2.1 mm×100 mm，2.2 μm。

1.2 BGC18 基因簇的直接克隆與異源表達

1.2.1S.cellulosumSo0157-2基因組提取

將-80 ℃保藏的S. cellulosumSo0157-2 接種到VY/2 平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)，待長出菌膜，轉(zhuǎn)接到表面濕潤的M26平板上。刮取M26平板培養(yǎng)5～7 d的菌落置于50 mL離心管中，水洗兩次，然后根據(jù)菌量加入適量的無菌水，渦旋混勻。吸取1.8 mL菌液分裝到2 mL EP 管中，12 000 r/min 離心1 min，棄上清。加入450 μL Tris-HCl（10 mmol/L，pH 8.0），吹打混勻。加入30 μL 20 mg/mL 蛋白酶K，顛倒混勻。加入40 μL 10%SDS（sodium laurylsulfonate）后，輕輕混勻。50 ℃水浴1～2 h，中間間斷顛倒直至溶液變澄清。加入500 μL 苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1），快速混勻，至溶液呈乳濁狀，13 800 r/min 離心15 min。用去尖的移液吸頭吸取300 μL 上清置于新的 2 mL EP 管中。加入 35 μL 3 mol/L NaAc（pH 7.5），混勻后，加入1.2 mL 無水乙醇，混勻。準備新的2 mL EP 管并加入1 mL 70%乙醇，用黃色吸頭將懸浮的DNA 挑至該EP管中。10 000 r/min 離心1 min。棄上清，倒置于吸水紙上并用吸水紙將管壁上的水吸掉。室溫干燥15～20 min。加入200 μL 雙蒸水（double-distilled H2O，ddH2O），放置4°C冰箱備用。

1.2.2S.cellulosumSo0157-2基因組酶切產(chǎn)物制備

將基因組DNA 利用限制性內(nèi)切酶DraⅠ和HindⅢ酶切，釋放目標基因簇片段。取上述制備的基因組 DNA 200 μL，加入 40 μL 10×Cutsmart buffer、 12 μL 限 制 性 內(nèi) 切 酶DraⅠ 和Hind Ⅲ 、1.5 μL RNase A，用ddH2O 補齊至 400 μL，37 ℃反應(yīng)3 h。取10 μL 酶切產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。檢測之后用等體積的苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1）抽提酶切產(chǎn)物除去蛋白，然后進行乙醇沉淀。

1.2.3 直接克隆載體的制備

以 BGC18-HAF 和 BGC18-HAR 為 PCR 引 物 ，以質(zhì)粒p15A-cm-tetR-tetO-hyg-ccdB 為PCR 模板，進行PCR 擴增。取2 μL PCR 產(chǎn)物進行電泳檢測，確認正確后將剩余PCR產(chǎn)物切膠回收目的片段。

1.2.4 目的基因簇BGC18的直接克隆

直接克隆載體和酶切基因組產(chǎn)物在體外用T4 DNA Polymerase 退火：取 200 ng 克隆載體、2 μL 10×NEB Buffer 2.1、0.13 μL T4 DNA Polymerase 混勻后，輕輕加入12 μL 基因組酶切產(chǎn)物，再用ddH2O將酶切體系補足到20 μL。PCR反應(yīng)程序為：25 ℃，60 min；75 ℃，20 min；50 ℃，30 min；4 ℃保溫。反應(yīng)完成之后將產(chǎn)物室溫除鹽40 min。將上述除鹽后的產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化到經(jīng)L-Ara 誘導(dǎo)的感受態(tài)細胞E.coliGB05-dir/pSC101-BAD-ETgA 中。從LB 轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落，小量提取質(zhì)粒，進行酶切分析。

1.2.5 目的基因簇BGC18的遺傳修飾

分別對質(zhì)粒p15A-cm-BGC18 進行轉(zhuǎn)座元件和啟動子的插入。利用帶有同源臂的引物對ⅠR-Pkm-C18-ⅠR-HAF1/HAR1對質(zhì)粒pR6K-oriT-TnpA-ⅠR-km進行擴增，得到oriT-ⅠR-PkmPCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物通過切膠回收純化；隨后將回收的產(chǎn)物與質(zhì)粒p15A-cm-BGC18 共同轉(zhuǎn)入E. coliGB05-red 感受態(tài)細胞中，使用合適的抗生素（km/cm）篩選重組子；重組質(zhì)粒通過限制性內(nèi)切酶ApaL Ⅰ進行酶切鑒定及測序鑒定。

1.2.6 目的基因簇BGC18異源表達

S.brevitaleaDSM 7029已作為異源宿主表達了多個黏細菌來源的基因簇，所以本研究中選擇野生型的S.brevitaleaDSM 7029 作為首選異源宿主。首 先 將 質(zhì) 粒 p15A-oriT-TnpA-ⅠR-Pkm-BGC18 （ 約1 μg）電轉(zhuǎn)入野生型S.brevitaleaDSM 7029 中［24］，通過含卡那霉素的CYMG 平板篩選重組子。分別利用detect-C18 in 7029-F1/R1，detect-C18 in 7029-F2/R2，detect-C18 in 7029-F3/R3，detect-C18 in 7029-F4/R4，detect-C18 in 7029-F5/R5五對引物對重組子進行菌落PCR鑒定。

1.2.7 菌株的發(fā)酵提取分離與LC-MS檢測

將正確的重組子接種于含有50 mL CYMG 培養(yǎng)基（km 3μg/mL）的300 mL 錐形瓶中，30 °C，180 r/min 培養(yǎng)過夜制備種子液。轉(zhuǎn)接50 μL 種子液于相同的培養(yǎng)基相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)2 d，然后每瓶加入1 mL經(jīng)前處理的XAD16大孔樹脂，繼續(xù)恒溫搖床培養(yǎng)2 d。

將菌體和大孔樹脂通過100目篩進行分離，并用雙蒸水將樹脂洗滌3 次（盡量去除菌體）。將樹脂倒入新的干燥的錐形瓶中，加入50 mL 的甲醇，30°C，180 r/min浸泡1 h。通過濾紙過濾將樹脂和甲醇分離，并將甲醇組分減壓濃縮蒸干得到粗提物。加入1 mL 色譜甲醇或乙腈溶解粗提物，然后12 000 r/min，離心 10 min，取上清過 0.22 μm 微孔濾膜并轉(zhuǎn)移至HPLC 進樣管中，待HPLC-MS 進行質(zhì)譜檢測。

液質(zhì)檢測條件如下：液質(zhì)分析色譜柱；流動相，A相為水+0.1%甲酸，B相為乙腈+0.1%甲酸；流速0.3 mL/min；進樣 3 μL；檢測波長 190～400 nm；洗脫程序0～3 min，5% B；3～18 min，5%～95%B；18～22 min，95% B；22～25 min，5% B。質(zhì)譜檢測條件：電噴霧離子源，正離子模式，二級質(zhì)譜AutoMS2，檢測范圍m/z70～2200。

1.2.8 氨基酸絕對構(gòu)型的確定

采用Marfey 法將化合物1～3 分別進行酸水解， 水解產(chǎn)物分別與 L-FDAA （1-fluoro-2-4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide） 或 D-FDAA 反應(yīng)［35］。采用同樣的方法制備標準品N-Me-L-Leu 與L/D-FDAA 的衍生產(chǎn)物，L/D-Val、L/D-Leu、L/D-Ⅰle、L/D-allo-Ⅰle 與 L-FDAA 的衍生物，隨后進行LC-MS 分析。N-Me-L-Leu、L/D-Val 與 L/D-FDAA的衍生產(chǎn)物的分析條件與1.2.7液質(zhì)檢測條件一致，檢測波長 330 nm。L/D-Leu、L/D-Ⅰle、L/D-allo-Ⅰle的衍生產(chǎn)物洗脫程序為0～45 min，5%～50% B。對應(yīng)衍生物的參照分子量為［M+H］+m/z398（N-Me-L-Leu）、370（L/D-Val）、384（L/D-Leu，L/D-Ⅰle，L/D-allo-Ⅰle）。

2 結(jié)果和分析

2.1 S.cellulosum So0157-2生物信息學(xué)分析

通過antiSMASH 分析，S.cellulosumSo0157-2基因組（NCBⅠ數(shù)據(jù)庫登錄號：CP003969.1）共包含35 個BGCs（表3），編碼聚酮（PKS）、非核糖體 肽 （NRPS）、 PKS-NRPS 雜 合 以 及 萜 類（terpene）等多種結(jié)構(gòu)類型化合物。除了已知的epothilone［8］及另外兩個萜類生物合成基因簇geosmin［40］和 eremophilene［41］之外，其余基因簇與目前已知的生物合成基因簇都存在著較大的不同，相似度較低，這預(yù)示著該菌株仍具有較大的代謝潛能。PKS-NRPS雜合的化合物通常具有新穎的結(jié)構(gòu)以及廣泛的生物活性［42］，因此優(yōu)先選取該類型基因簇進行激活。BGC18 預(yù)測為PKS-NRPS雜合基因簇，長度約為26.7 kb（圖1）。核心基因（SCE1572_24725）包含3 個模塊共有10 個結(jié)構(gòu)域（C1-A1-T1，C2-A2-MT-T2，KS-AT-TE）（圖 1）。其中A1（adenylation）被預(yù)測可能識別纈氨酸/丙氨酸/甘氨酸/亮氨酸/異亮氨酸（Val/Ala/Gly/Leu/Ⅰle），A2被預(yù)測可能識別亮氨酸，然后被N-甲基化形成N-甲基亮氨酸（N-Me-Leu），AT（acyltransferase）則可能識別丙二酰輔酶A（Malonyl-CoA），但是缺少PKS 所必需的硫醇化（thiolation，T）結(jié)構(gòu)域，這些底物能否通過NRPS和PKS的延伸單元被依次加載、縮合，形成的終產(chǎn)物最后被硫酯酶（TE）結(jié)構(gòu)域釋放是一個值得研究的問題。

圖1 BGC18基因簇結(jié)構(gòu)Fig.1 Organization of the biosynthetic gene cluster BGC18

表3 antiSMASH 預(yù)測So0157-2基因組編碼的生物合成基因簇Tab.3 Biosynthetic gene clusters in the genome of so0157-2 predicted by antiSMASH

2.2 BGC18 的直接克隆、改造、異源表達

利用DraⅠ和Hind Ⅲ酶切基因組，釋放出27 kb 的完整BGC18，將酶切后的基因組回收備用。然后PCR擴增1.79 kb的直接克隆載體p15A-cm，得到的片段兩端各帶有72 bp 的同源臂。參照ExoCET 的方法［22］，對基因簇進行克?。▓D 2）。復(fù)蘇后的菌體涂布含氯霉素的LB 篩選平板，過夜培養(yǎng)后挑取24 個轉(zhuǎn)化子，用MscⅠ酶切鑒定（圖3），將其中4 個所有酶切條帶均正確的質(zhì)粒，對它們的同源臂部分進行測序，測序正確的命名為p15A-cm-BGC18。為了讓質(zhì)粒p15A-cm-BGC18能在異源宿主中成功表達，需要插入轉(zhuǎn)座元件oriT-tnpA-ⅠR 將基因簇通過轉(zhuǎn)座的方式整合至異源宿主的基因組上。此外，來源于黏細菌的啟動子在DSM 7029中可能無法正常工作，所以將BGC18的結(jié)構(gòu)基因的啟動子替換成異源宿主中可以工作的組成型啟動子Tn5-kan（Pkm）。用帶有50 bp 同源臂的引物對pR6K-oriT-TnpA-ⅠR-km 進行擴增，得到oriT-TnpA-ⅠR-km 片段，將這個片段與p15A-cm-BGC18 發(fā)生線環(huán)重組（LCHR），挑選7 個轉(zhuǎn)化子進行酶切分析和同源臂部分測序，成功獲得重組質(zhì)粒p15A-oriT-ⅠR-Pkm-BGC18（圖3）。

圖2 基因簇BGC18的直接克隆與遺傳修飾Fig.2 Direct cloning and modification of BGC18

圖3 重組質(zhì)粒 p15A-cm-BGC18（a）和p15A-OriT-ⅠR-Pkm-BGC18（b）分別以MscⅠ和 ApaLⅠ酶切鑒定（紅色方框代表酶切條帶正確）Fig.3 a:Restriction analysis of the recombinant plasmids p15A-cm-BGC18 by MscⅠ(a)and p15A-OriT-ⅠR-Pkm-BGC18 by ApaLⅠ(b)(Red box indicates right recombinant plasmids)

將質(zhì)粒 p15A-oriT-ⅠR-Pkm-BGC18 電轉(zhuǎn)入野生型的S. brevitaleaDSM 7029 中，從含卡那霉素的CYMG 平板上挑取重組子進行菌落PCR 鑒定，挑選3 個正確的重組子（DSM7029：Pkm-BGC18）進行發(fā)酵檢測，并以野生型DSM 7029 作為陰性對照。利用HPLC-MS 對發(fā)酵結(jié)果進行分析。HPLCMS結(jié)果顯示，所有帶有BGC18的突變體均產(chǎn)生了兩個顯著的化合物峰m/z227［M+H］+、241［M+H］+，且這些峰在陰性對照中未發(fā)現(xiàn)，推測是BGC18 在DSM 7029中表達的產(chǎn)物（圖4）。

圖4 BGC18在S.brevitalea DSM 7029中的異源表達產(chǎn)物L(fēng)C-MS分析（BPC+：m/z 200～300）Fig.4 LC-MS analysis for the heterologous products of BGC18 expressed in S.brevitalea DSM 7029

2.3 產(chǎn)物的分離純化

將突變菌株DSM7029：Pkm-BGC18采用CYMG培養(yǎng)基批量發(fā)酵10 L，大孔樹脂XAD-16 吸附目標化合物，然后用甲醇提取發(fā)酵粗提物。發(fā)酵粗提物首先經(jīng)過正相硅膠柱色譜分離，干法上樣，以CH2Cl2-MeOH為流動相，梯度洗脫（100∶1、50∶1、30∶1、20∶1、10∶1），得到 5 個分組分 Fr1～Fr5。液質(zhì)檢測將含有目標化合物的組分Fr3 繼續(xù)通過反相中壓液相色譜制備，水和甲醇為流動相，梯度洗脫。最終通過HPLC 制備，30%乙腈水溶液恒梯度洗脫得到化合物1（33 mg），40%乙腈水溶液恒梯度洗脫得到化合物2（7 mg）和化合物3（4 mg）。

2.4 化合物1-3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 為白色固體，陽離子質(zhì)譜ESⅠMS 在m/z227.0 處給出［M+H］+分子離子峰，結(jié)合化合物的一維1H 譜、13C 譜（表4）可以得到化合物分子式為C12H12O2N2。分析13C NMR，DEPT 譜發(fā)現(xiàn)，化合物 1 具有 2 個酰胺羰基（δC167.6，165.1）；4個次甲基（δC60.1，59.2，32.6，25.1）；1個亞甲基 （δC42.7）；5 個甲基 （δC32.1，23.1，21.8，19.2，18.0）其中1 個與氮相連；進一步通過HMBC二維核磁數(shù)據(jù)確定化合物1的結(jié)構(gòu)與已知有機 合 成 中 間 體 Cyclo （N-Me-L-Leu-L-Val） 相同［43-44］（圖5），但是其核磁數(shù)據(jù)未見報道，因此對其核磁數(shù)據(jù)H和C譜進行了解析與指認（表4）。

化合物2 和3 均為白色固體，陽離子質(zhì)譜ESⅠMS 在m/z241.0 處給出［M+H］+分子離子峰，提示化合物分子式為C13H24O2N2比1 多一個CH2。與化合物1 的氫譜數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)（表4），化合物2中的兩個氨基酸均為亮氨酸（Leu）。進一步查閱文獻發(fā)現(xiàn)化合物2 為已知有機合成中間體Cyclo（N-Me-L-Leu-L-Leu）（圖 5）［45］?；衔?3 與化合物2 的氫譜數(shù)據(jù)非常類似，除了一個二重峰（d）的甲基變成了三重峰（t）的甲基（δH0.84）以及一個與氮相連的CH 信號由dt 峰變?yōu)閐d 峰（δH3.61），這就表明化合物3中的氨基酸為Ⅰle，為新化合物（圖5）。采用Marfey 法對氨基酸的絕對構(gòu)型進行了確定，4 種氨基酸（N-Me-Leu、Val、Leu、Ⅰle）均為L構(gòu)型（表5）。

表5 化合物1～3氨基酸與marfey試劑衍生產(chǎn)物的保留時間Tab.5 Retention time of amino acids derivatized with Marfey's reagent

圖5 化合物1～3的結(jié)構(gòu)式及化合物1的HMBC相關(guān)信號Fig.5 Structures of 1～3 and HMBC correlations of 1

表4 化合物1～3的NMR核磁數(shù)據(jù)Tab.4 1H(500 MHz)and13C(125 MHz)data of 1～3 in DMSO-d6

2.5 化合物1～3 的生物合成途徑分析

根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)及其生物合成基因簇的生信分析，對化合物1～3 的生物合成途徑進行了推測 （圖 6）。A1結(jié)構(gòu)域可識別 L 型的 Val/Leu/Ⅰle。A2結(jié)構(gòu)域可識別的L-Leu，然后經(jīng)過N-甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化修飾后形成N-Me-Leu。兩部分經(jīng)過縮合與TE 介導(dǎo)的環(huán)化，最終形成化合物1～3 的完整結(jié)構(gòu)。盡管該基因簇含有PKS 模塊，推測可能因為缺少PKS 所必需的T 結(jié)構(gòu)域?qū)е翽KS 模塊被跳過，從而只獲得了NRPS 指導(dǎo)合成的環(huán)二肽產(chǎn)物1～3。

圖6 化合物1～3生物合成途徑推測Fig.6 Proposed biosynthetic pathway of 1～3

2.6 化合物1～3 的抗菌活性測試

本研究采用96孔板二倍稀釋法［35］測定了化合物1～3 對下列指示菌株（E. coliATCC 35218、P.aeruginosaATCC 27853、Staphylococcus aureusATCC 29213、Bacillus subtilisATCC 6633、Helicobacter pyloriG27、H.pylori159、Enterococcus faecalisATCC 19434、Mycobacterium smegmatisATCC 607、Candida albicansSC5314）的抗菌活性，結(jié)果顯示化合物1～3 對所測菌株均無抑制作用（MⅠC＞32 μg/mL）。

3 結(jié) 論

基因組信息分析表明，纖維堆囊菌So0157-2基因組中含有豐富的未知功能的基因簇，特別是含有大量通常具有良好生物活性的PKS、NRPS 或兩者雜合的基因簇，預(yù)示著該菌株仍具有產(chǎn)生新穎天然產(chǎn)物的潛力。BGC18 即為該菌基因組中預(yù)測的一個NRPS-PKS 雜合的基因簇，大小約為26.7 kb。該基因簇中NRPS 模塊的核心基因預(yù)測含有兩個A 結(jié)構(gòu)域，其中A2結(jié)構(gòu)域被預(yù)測具有底物的專一性，而A1結(jié)構(gòu)域?qū)Φ孜锏淖R別具有寬泛性，因此該基因簇可能合成結(jié)構(gòu)多樣的二酮哌嗪類化合物。此外，該基因簇PKS模塊缺少T結(jié)構(gòu)域，這些底物能否通過NRPS和PKS的延伸單元被依次加載、縮合，形成的終產(chǎn)物最后被TE 結(jié)構(gòu)域釋放值得深入研究。然而，由于該菌株較難培養(yǎng)且自身未建立遺傳操作體系，因此將該生物合成基因簇轉(zhuǎn)移到合適的異源宿主中，利用異源表達策略是激活該生物合成基因簇挖掘其次級代謝產(chǎn)物的一個有效途徑。異源表達成功的關(guān)鍵主要涉及基因簇的克隆與遺傳修飾以及異源宿主的合理選擇。本課題組已經(jīng)建立了以Red/ET DNA 同源重組技術(shù)為核心的生物合成基因簇直接克隆與遺傳修飾技術(shù)平臺，為天然產(chǎn)物的挖掘提供了技術(shù)支撐［21-28］?；虼卦诋愒幢磉_時，存在著密碼子偏好性的影響。選擇異源宿主時，首先考慮與原始生產(chǎn)菌在進化地位上親緣關(guān)系相近的菌。本文中所選用的異源宿主S. brevitaleaDSM 7029 與纖維對囊菌So0157-2 均為變形菌門，GC 含量相似，分別為68%和72%［8，39］。前期，本課題組將纖維堆囊菌來源的埃博霉素成功地在該異源宿主S. brevitaleaDSM 7029 中進行了表達，說明兩株菌的密碼子有一定的兼容性［36］。此外，通過啟動子工程改造以及額外補充稀有密碼子的tRNA 或者進行密碼子優(yōu)化等也可以提高異源表達的概率［36-37］。

因此，本研究成功構(gòu)建了纖維堆囊菌So0157-2中基因簇的直接克隆與遺傳修飾體系，并將一個NRPS-PKS 雜合的基因簇BGC18 轉(zhuǎn)入異源宿主S.brevitaleaDSM 7029中實現(xiàn)了該基因簇的功能性表達，成功獲得了3個對應(yīng)的代謝產(chǎn)物。通過正相硅膠柱色譜和HPLC 分離純化，以及MS、NMR 解析了化合物的結(jié)構(gòu)。SciFinder 數(shù)據(jù)庫檢索證實化合物1 和2 僅作為有機合成中間體被報道，為新天然產(chǎn)物，而化合物3為新化合物。BGC18為NRPSPKS 雜合基因簇，從結(jié)構(gòu)上看，化合物1～3 為二酮哌嗪類化合物，其所含氨基酸與生物信息學(xué)預(yù)測一致，但是并未見PKS 單元。仔細分析PKS 相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)該基因簇缺少硫醇化結(jié)構(gòu)域，推測導(dǎo)致PKS不能有效組裝?；衔?～3結(jié)構(gòu)上差別主要為第1 個氨基酸的不同（1 Val， 2 Leu， 3 Ⅰle），這是由于第1 個腺苷化結(jié)構(gòu)域（A domain）對底物識別的非特異性所導(dǎo)致的。由A 結(jié)構(gòu)域?qū)Φ孜镒R別的寬泛性導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)多樣性也在我們前期分離獲得的多個脂肽類化合物得到證實［46-47］?；赗ed/ET 重組工程技術(shù)的纖維堆囊菌So0157-2 隱性基因簇的直接克隆、修飾和異源表達體系的建立，不僅有助于進一步了解該菌的生物合成潛力，而且能夠發(fā)現(xiàn)新穎的天然產(chǎn)物用于藥物篩選評價。

致謝：本工作得到國家重點研發(fā)計劃（2019YFA0905 700）；國家自然科學(xué)基金（32070060，31670098）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2020QH345，ZR2019JQ11）的支持。