張萍，魏文平，周英，葉邦策，

（1 華東理工大學微分析與生物系統(tǒng)工程實驗室，生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237；2 浙江工業(yè)大學工程生物學與健康研究中心，長三角綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心，藥學院，浙江 杭州 310014）

人工構建的調(diào)控元件是改造細胞可控地生產(chǎn)目標產(chǎn)物的重要改造工具［1-2］，光誘導型傳感器作為一類重要的控制元件，在底盤細胞的工程化改造過程中展現(xiàn)出很好的應用潛力［3-4］。之前傳統(tǒng)的基因誘導表達系統(tǒng)雖然可高效快速地得到目標產(chǎn)物，但由于一些化學型誘導劑價格昂貴、易產(chǎn)生細胞毒性、難清除等缺陷，限制其在工業(yè)化生產(chǎn)中的應用；光作為一種誘導因子具有快速無毒，可將誘導信號迅速地傳遞至細胞內(nèi)的優(yōu)勢，在不改變宿主代謝條件的前提下，可實現(xiàn)靶標基因時間空間上的精確表達，具有較好的應用潛力。在實際操作中可根據(jù)光照強度和時間，調(diào)節(jié)靶標基因的表達水平［5］，或者通過切換光照和黑暗條件，使光效應蛋白發(fā)生光依賴型的構象變化，從而達到可逆轉(zhuǎn)誘導效果。 Zhao 等在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中引入光誘導表達系統(tǒng)，將異丁醇的產(chǎn)量提高到（8.49±0.31）g/L［6］；之后為了克服持續(xù)性產(chǎn)物代謝途徑激活產(chǎn)生的不良后果，如與初級代謝的能量競爭及有毒中間代謝產(chǎn)物積累等造成細胞生物量下降等負面影響，他們以脫氧核糖乙酸合成途徑為模型，利用光遺傳控制對酵母細胞代謝進行區(qū)域化動態(tài)調(diào)控，通過降低中間代謝產(chǎn)物濃度和減少競爭途徑能量流消耗，最終使產(chǎn)物合成產(chǎn)量提高了6 倍［7］。此外，Tandar 等［8］通過對葡萄糖-6-磷酸異構酶的光控表達，調(diào)節(jié)EMP/PPP 流量比，優(yōu)化前體和還原力供給，并最終在光控傳感器的作用下提高了甲羥戊酸等產(chǎn)物的產(chǎn)量。但如何選擇具有應用優(yōu)勢且適配性好的底盤細胞仍是限制光控傳感器開發(fā)的首要 問 題 之 一［9-10］。 解 脂 耶 氏 酵 母（Yarrowia lipolytica）是非常規(guī)酵母中最具代表性的一種，是近年應用較為廣泛的一種底盤細胞［11-14］，具有利用底物譜廣，安全性高，耐酸及有機溶劑，在代謝過程中可大量產(chǎn)生合成聚酮類、黃酮類和萜類化合物所必需的前體物acetyl-CoA 和malonyl-CoA 等眾多優(yōu)勢［11，15-25］，已被廣泛應用于多種食品及藥品的發(fā)酵生產(chǎn)領域。目前，在Y. lipolytica中已經(jīng)成功地開發(fā)了脂肪酸誘導型啟動子［26］、銅離子響應傳感器［27］和木糖誘導型傳感器［28］等調(diào)控元件，但還未見時空動態(tài)調(diào)控元件的報道，光誘導型傳感器在一定程度上可以彌補這一缺陷。本研究中利用的光敏調(diào)控系統(tǒng)來自于革蘭氏陰性細菌（如Myxococcus xanthus、Thermus thermophilus），是一套細菌自發(fā)的防御機制，目的是保護自身免受光的氧化。在這些生物體中，CarH 是一種光響應轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，調(diào)控胡蘿卜素基因簇的表達，而它的活性和光敏性依賴于腺苷鈷胺素（AdoB12）。Chatelle 等［4］利用T.thermophilus來源的 CarH 及其同源DNA操縱序列CarO在哺乳動物細胞中構建了一套光控轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)；經(jīng)過誘導型啟動子中CarO的數(shù)量等參數(shù)優(yōu)化，可以實現(xiàn)350倍的誘導倍數(shù)；此研究展現(xiàn)出這一系統(tǒng)在真核系統(tǒng)中的應用前景。

對香豆酸和柚皮素主要來源于植物，具有多種保健功效，而從植物中提取受季節(jié)和產(chǎn)地等多種因素影響較大，利用微生物法合成具有顯著優(yōu)勢，如生產(chǎn)強度高、反應條件溫和、成本低廉等。對香豆酰-CoA 是白藜蘆醇、柚皮素、芹菜素、野黃芩素等黃酮類化合物以及生物堿等天然產(chǎn)物的合成前體，而對香豆酸是合成對香豆酰-CoA 的必要前體物質(zhì)，對高效生物合成眾多天然活性產(chǎn)物具有重要的意義［18-19，29-32］。對香豆酸又名對羥基肉桂酸（CAS號：501-98-4），是植物苯丙烷途徑的上游代謝物，具有強大的抗氧化、抗菌和抗炎特性，也是多種功能活性成分的前體物質(zhì)［29-30］。柚皮素就是其中的一種重要衍生物，屬于天然黃酮類的化合物，具有抗炎、抗氧化、抗病毒等多種重要的藥理活性，具有重要的應用價值［18］。由于兩者都來源于植物，來源受限，有必要利用合成生物學方法，通過代謝工程手段，實現(xiàn)植物來源天然產(chǎn)物在微生物中的異源高效合成；然而，微生物底盤細胞的改造過程受制于高效調(diào)控元件的限制，發(fā)掘性能優(yōu)良、適配性好的多樣化調(diào)控元件，有助于實現(xiàn)不同來源天然產(chǎn)物在微生物細胞中的生產(chǎn)。

本研究利用細菌來源的CarH 作為綠光誘導因子［4］，以 VPRH 結(jié)構域［28］為轉(zhuǎn)錄激活因子，在真核細胞Y. lipolytica中構建基于復合因子CarHVPRH 為綠光響應元件的光控表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以在綠光和黑暗條件下對報告基因mcherry進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并且具有及時響應的動態(tài)調(diào)控優(yōu)勢；在此基礎上，將其應用于Y. lipolytica中構建對香豆酸及柚皮素的光誘導型合成途徑。實現(xiàn)在綠光及黑暗條件下對合成途徑的干預性調(diào)控，有利于動態(tài)調(diào)節(jié)前體及產(chǎn)物合成，平衡細胞生長與產(chǎn)物積累之間的關系，為Y. lipolytica的光誘導型元件的開發(fā)提供了可精準動態(tài)調(diào)控的傳感器工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與引物

本研究使用的菌株和質(zhì)粒見表1。本研究合成的引物序列見表2。

表1 本研究所用的質(zhì)粒和菌株Tab.1 Plasmids and strains used in this study

表2 本研究中使用的引物Tab.2 Primers used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

YNB-Leu 固體培養(yǎng)基（100 mL）：酵母基礎氮源（yeast nitrogen base W/O）0.67 g，葡萄糖1 g，L-亮氨酸0.05 g，瓊脂2 g。

YNB 固體培養(yǎng)基（100 mL）：酵母基礎氮源0.67 g，葡萄糖1 g，瓊脂2 g。

YPD 液體培養(yǎng)基（100 mL）：蛋白胨2 g，葡萄糖2 g，酵母提取物1 g。

1.1.3 主要試劑和儀器

試劑：限制性核酸內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；高保真聚合酶（Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase）購自南京諾唯贊公司；LB 培養(yǎng)基、瓊脂及葡萄糖購自上海捷瑞生物工程有限公司；蛋白胨及酵母提取物購自OXOⅠD 公司；酵母基礎氮源及L-亮氨酸購自Solarbio 公司；腺苷鈷胺素（coenzyme B12）購自阿拉丁公司；酵母轉(zhuǎn)化試劑盒Frozen-EZ yeast transformation Ⅱ 購 自 ZYMO RESEARCH 公司；PCR 純化試劑盒及同源重組試劑盒購自全式金（北京）生物技術有限公司。

儀器：上海精宏電熱恒溫培養(yǎng)箱；上海精宏恒溫搖床；Biotek Synergy2 多功能酶標儀；島津Prominence-ⅠLC-2030 系列高液相色譜儀；艾瑞嘉LED綠光燈10 W（520～530 nm）；尼康激光共聚焦顯微鏡。

1.2 質(zhì)粒設計與構建

1.2.1 信號輸出模塊構建

以pSET152-Pj23119-2CarO-GFP 質(zhì)粒為模板，使 用 引 物 SalⅠ-Pj23119F 和 CarO-TEF-R 擴 增 得 到2CarO；以p13-Tm 質(zhì)粒為模板，使用引物CarOTEF-F 和 StuⅠ-XPR2-277R 擴 增 得 到 TEF-mCherry-XPR2； 以 2CarO 和 TEF-mCherry-XPR2 為 模 板 ，使用引物 SalⅠ-Pj23119F 和 StuⅠ-XPR2-277R 進行融合PCR，得到2CarO-TEF-mCherry-XPR2。此片段即為含有CarO 位點、TEF 核心啟動子序列和報告基因mCherry的信號輸出模塊。

1.2.2 激活因子復合體CarH-VPRH 的表達模塊構建

以pUC57-CarH 質(zhì)粒為模板， 使用引物1312CarH-F 和 CarH-VPRH-R 擴增得到 CarH（GeneⅠD：3169555）；以 pUC57-VPRH 質(zhì)粒為模板，使用引物 CarH-VPRH-F 和 KpnⅠHSF1-R，擴增得到VPRH［28］； 以 CarH 和 VPRH 為 模板 ，使 用 引 物1312CarH-F 和 KpnⅠHSF1-R 進行融合 PCR，得到CarH-VPRH。用限制性核酸內(nèi)切酶PmlⅠ和KpnⅠ酶切pⅠNA1312 質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物使用PCR 純化試劑盒純化。將CarH-VPRH 插入到上述酶切pⅠNA1312質(zhì)粒中以構建質(zhì)粒p13-CV。

1.2.3 綠光響應質(zhì)粒p13-CV-2CarO-Tm構建

用限制性核酸內(nèi)切酶SalⅠ和StuⅠ酶切p13-CV 質(zhì)粒，并將片段2CarO-TEF-mCherry-XPR2 通過同源重組的方式插入到上述位點中（SalⅠ和StuⅠ）以構建質(zhì)粒p13-CV-2CarO-Tm。

1.2.4 對香豆酸合成質(zhì)粒p13-CV-2CarO-TAL構建

以p13PxoTAL 質(zhì)粒為模板，使用引物TEFTAL-F 和 StuⅠ-XPR2-277R 擴增得到 TAL；使用引物 SalⅠ-Pj23119F 和 StuⅠ-XPR2-277R，將誘導型啟動子2CarO-TEF 與 TAL 進行融合 PCR，得到2CarO-TEF-TAL，并通過同源重組的方式組裝到SalⅠ和StuⅠ雙酶切的p13-CV 質(zhì)粒中以構建質(zhì)粒p13-CV-2CarO-TAL。

1.2.5 柚皮素合成質(zhì)粒p12-4CC構建

以p12-4CL 質(zhì)粒為模板，使用引物1269-SpeⅠ-XPR2-F 和 FBAin-CYCt-R 擴 增 得 到 FBAin-4CL；以pCas-AXPCHSCHⅠ質(zhì)粒為模板，使用引物FBAin-CYCt-F 和 1269-SpeⅠ-XPR2-R 擴 增 得 到CHS-Pexp1-FBAin-CHⅠ。用限制性核酸內(nèi)切酶SpeⅠ酶切pⅠNA1269 質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物使用PCR 純化試劑盒純化。將FBAin-4CL 和CHS-Pexp1-FBAin-CHⅠ通過多片段同源重組的方式組裝到SpeⅠ酶切的pⅠNA1269質(zhì)粒中以構建質(zhì)粒p12-4CC。

1.3 酵母重組菌構建

本研究使用的骨架質(zhì)粒pⅠNA1312和pⅠNA1269需要酶切線性化處理后轉(zhuǎn)入Po1f 菌株。酶切線性化體系（200 μL）：超純水洗脫的質(zhì)粒溶液140 μL，緩 沖 液 0.1% BSA、 10×H Buffer、 0.1% Triton各 20 μL，內(nèi)切酶NotⅠ 3 μL。反應條件 37 ℃水浴4 h。酶切反應結(jié)束后，使用PCR 純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物，最后用50～80 μL 超純水洗脫酶切線性質(zhì)粒并用于酵母轉(zhuǎn)化。酵母轉(zhuǎn)化步驟參考轉(zhuǎn)化試劑盒Frozen-EZ yeast transformation Ⅱ的試劑比例和操作步驟。待轉(zhuǎn)化步驟結(jié)束后，將酵母菌液涂布在YNB-Leu 或YNB 固體平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h。

1.4 菌株的篩選和培養(yǎng)

轉(zhuǎn)化篩選和純化培養(yǎng)含有pⅠNA1312 衍生質(zhì)粒的菌株的培養(yǎng)基為YNB-Leu固體培養(yǎng)基，在此基礎上進一步轉(zhuǎn)化質(zhì)粒p12-4CC的菌株的培養(yǎng)基為YNB固體培養(yǎng)基。菌株種子液的培養(yǎng)以及光誘導培養(yǎng)基為YPD 液體培養(yǎng)基。挑選能夠在YNB-Leu 或YNB固體平板上生長的酵母單菌落于裝有1.2 mL YPD液體培養(yǎng)基（含20 μmol/L 腺苷鈷胺素）的24 孔的深孔板（有不透光的蓋子覆蓋，可視為黑暗條件），并于30 ℃、220 r/min恒溫搖床培養(yǎng)48 h。48 h后各孔吸取700 μL 菌液測定熒光值（RFU）和600 nm 處的光密度（OD600），以此熒光強度較高的菌株作為能夠發(fā)揮CarH-VPRH激活作用的菌株。

1.5 光誘導實驗

轉(zhuǎn)接含有光控傳感器質(zhì)粒的Y. lipolytica進行綠光響應性能測試。以不包裹錫箔紙的透明的錐形瓶作為誘導實驗組，以包裹錫箔紙的錐形瓶作為黑暗條件實驗組。培養(yǎng)基為YPD（含20 μmol/L腺苷鈷胺素），裝液量為5/25（25 mL 錐形瓶中裝有5 mL 的 YPD 培養(yǎng)基）。在裝有綠光燈（520～530 nm）的恒溫搖床（30 ℃，220 r/min）中培養(yǎng)，錐形瓶和綠光燈的距離為12 cm，培養(yǎng)72 h，取樣測定RFU 與OD600值，評價誘導效果。培養(yǎng)測試時按照種子液OD600=5，接種量1%的條件接種培養(yǎng)。種子液培養(yǎng)條件為：30 ℃，220 r/min，YPD 培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。

1.6 腺苷鈷胺素濃度優(yōu)化

對CarH-VPRH 發(fā)揮激活作用所必需的腺苷鈷胺素的濃度進行優(yōu)化。以Yl-CVH 為測試菌株，其培養(yǎng)條件同光誘導實驗，并設置腺苷鈷胺素濃度梯度為：0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L，每個濃度梯度分別設置光照組和黑暗組。培養(yǎng)48 h，取樣700 μL菌液測定RFU與OD600值。

1.7 綠光響應傳感器的動態(tài)響應實驗

接種綠光響應菌株Yl-CVH 進行綠光響應傳感器動態(tài)響應光照條件變化的性能測試。對Yl-CVH設置3 組不同光照條件：①0～24 h 綠光照射，24～36 h 黑暗，36～48 h 綠光照射，48～60 h 黑暗，60～72 h 綠光照射，72～84 h 黑暗，84～96 h綠光照射，96～108 h 黑暗，108～120 h 綠光照射；②始終綠光照射；③始終黑暗，同時進行光誘導培養(yǎng)（方法參照1.5），并均在0 h、24 h、48 h、72 h 和 96 h 補 加 15 μmol/L 腺 苷 鈷 胺 素 。 培 養(yǎng)120 h，每隔12 h取樣測定RFU與OD600值。

1.8 對香豆酸合成菌株構建與產(chǎn)量測定

本研究選擇來自黏紅酵母（Rhodotorula glutinis）的酪氨酸解氨酶（tyrosine ammonia lyase，TAL）編碼基因tal（GenBank：KF765779.1）［33］，將其置于光誘導型啟動子下游并構建工程菌株，以工程菌株的對香豆酸合成產(chǎn)量為考察指標，測試綠光響應系統(tǒng)在天然產(chǎn)物合成方面的潛力。菌株Po1f 中轉(zhuǎn)入經(jīng)過線性化處理的p13-CV-2CarO-TAL 質(zhì)粒（步驟如1.3 和1.4），以得到對香豆酸合成菌株Yl-CA。對Yl-CA 設置3 組不同的光照條件：①始終綠光照射；②始終黑暗；③0～48 h 黑暗，48 h 后綠光照射，同時進行光誘導培養(yǎng)（方法參照1.5），培養(yǎng)96 h并取樣利用HPLC檢測對香豆酸產(chǎn)量。具體檢測方法可參照Wei等［34］建立的檢測方法。

1.9 柚皮素合成菌株構建與產(chǎn)量測定

在對香豆酸合成菌株中進一步引入來自擬南芥（Arabidopsis thaliana）的4-香豆酸輔酶A 連接酶（4-coumaroyl-CoA ligase，4CL）編碼基因4c（lGeneⅠD：841593）、 查 爾 酮 合 酶（chalcone synthase，CHS）編碼基因ch（sGene ⅠD：831241）、查爾酮異構酶（chalcone isomerase，CHⅠ）編碼基因ch（iGeneⅠD：830409）［33-35］，以實現(xiàn)柚皮素的從頭合成。菌株Yl-CA 中轉(zhuǎn)入經(jīng)過線性化處理的p12-4CC 質(zhì)粒（步驟如1.3 和1.4），得到柚皮素合成菌株Yl-NA。對Yl-NA 設置4 組不同的光照條件：①0～24 h 綠光照射，24 h 后黑暗；②0～48 h 綠光照射，48 h后黑暗；③始終綠光照射；④始終黑暗，同時進行光誘導培養(yǎng)（方法參照1.5），4 組均在0 h 添加15 μmol/L 腺苷鈷胺素；其中①和②組分別在24 h和 48 h 再添加 15 μmol/L 腺苷鈷胺素，培養(yǎng) 96 h 并取樣利用HPLC檢測對香豆酸和柚皮素產(chǎn)量。具體檢測過程可參照Wei等［34］建立的檢測方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠光響應傳感器的構建

2.1.1 綠光響應傳感器設計

本研究中應用的光響應元件CarH 是一種綠光響應的轉(zhuǎn)錄因子［36］。CarH 的 DNA 結(jié)合活性和光敏性依賴于輔酶脫氧腺苷鈷胺素（AdoB12）。在無光條件下，AdoB12連接的CarH四聚體與啟動子序列的CarO 位點結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達。Chatelle 等［4］利用真核細胞通用型的激活結(jié)構域的激活性能，設計了CarHVP64 復合體，將其原本對下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達的抑制作用改造為轉(zhuǎn)錄激活作用。同理，鑒于底盤細胞Y. lipolytica的真核特性，也可以基于真核細胞通用的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構域來構建具有轉(zhuǎn)錄激活功能的轉(zhuǎn)錄響應元件。為此，選用已在Y.lipolytica中驗證激活功能的VPRH復合激活結(jié)構域作為轉(zhuǎn)錄激活組件［28］，構建復合型CarH-VPRH 轉(zhuǎn)錄因子。利用組成型表達（hp4d 啟動子）CarH-VPRH 因子的模塊和報告基因輸出模塊，設計構建綠光響應傳感器質(zhì)粒［圖1（a）］。在綠光照射條件下，AdoB12的Co-C 鍵被破壞，CarH-VPRH 四聚體解離，因此無法再結(jié)合誘導型啟動子2CarO-TEF，進而使綠光響應系統(tǒng)處于“Off”狀態(tài)［圖1（b）］；當傳感菌株處在黑暗條件下，CarH-VPRH 四聚體會靶向結(jié)合到2CarO-TEF啟動子，進而借助VPRH的轉(zhuǎn)錄激活功能強化下游基因的表達，使綠光響應系統(tǒng)處于活躍的“On”狀態(tài)［圖1（c）］。

hp4d啟動子屬于人工合成的復合型啟動子［37］，含有Leu核心啟動子序列以及來源于XPR2啟動子的UAS 序列［38］，能夠有效地驅(qū)動下游 CarH-VPRH 的表達，進而為胞內(nèi)誘導型啟動子控制基因的激活表達提供足夠的CarH-VPRH因子。驅(qū)動報告基因表達的誘導型啟動子由TEF啟動子序列中的TATA box上游的CarO 位點和核心啟動子Ptef 組成。在TATA box上游插入CarO位點的設計避免了對TATA box等核心元件區(qū)域的破壞，減小外源插入序列對啟動子活性的影響?；谏鲜鲈嫿ǖ木G光響應質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Y.lipolyticaPo1f菌株后，分別測試菌株在綠光照射與黑暗條件下的紅色熒光信號，考察傳感菌株對于綠光誘導的敏感性。結(jié)果如［圖2（a）］所示，在綠光照射的條件下，菌株在608 nm處沒有對應的特異熒光發(fā)射譜；而在無光條件下存在明顯的熒光發(fā)射譜。結(jié)果表明復合因子CarH-VPRH在無光條件下能夠靶向結(jié)合到誘導型啟動子上并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用［圖1（c）］，且熒光信號輸出強度顯著高于綠光（P＜0.01）［圖2（b）］，差異高達43倍。此結(jié)果表明本研究構建的綠光響應傳感器具有良好的綠光響應性能。

圖1 綠光響應傳感器的設計Fig.1 Design of the green light response sensor

圖2 綠光響應傳感器的性能表征Fig.2 Performance of the green light response sensor

鑒于本研究選用的綠光感應蛋白CarH 的DNA結(jié)合能力受到腺苷鈷胺素（cobamide vitamin B12）濃度的影響，進一步考察了腺苷鈷胺素濃度與熒光信號輸出強度之間的關系。如［圖2（c）］所示，Y1-CVH菌株發(fā)酵培養(yǎng)48 h后，當腺苷鈷胺素的濃度在5～20 μmol/L時，綠光照射和黑暗實驗組間的信號輸出具有顯著的差異。當濃度為15 μmol/L 時，輸出信號達到最大值?；谙佘这挵匪貪舛鹊挠绊懞凸饪匦?，本研究構建的光控系統(tǒng)具有開發(fā)為響應二元因素的邏輯門傳感器的潛力，即可以通過同時控制腺苷鈷胺素的濃度和光照條件來實現(xiàn)不同的調(diào)控效果。同時，鑒于腺苷鈷胺素的成本問題以及腺苷鈷胺素添加對于產(chǎn)物后續(xù)純化等步驟的影響，基于CarH因子的傳感系統(tǒng)，將來有必要通過CarH蛋白結(jié)構的定向進化改善CarH 與腺苷鈷胺素的親和力、最低飽和濃度等參數(shù)，以減少腺苷鈷胺素的添加濃度，對推廣CarH系統(tǒng)的應用具有重要意義。

2.1.2 綠光響應傳感器對光照條件的動態(tài)響應

為考察綠光響應傳感器對光照條件變化動態(tài)響應的靈敏度，在菌株Y1-CVH表達熒光蛋白的階段（24～120 h），每隔12 h對光照條件進行了切換，同時考慮到光照對腺苷鈷胺素的降解作用，在將光照條件由綠光照射切換為黑暗時，再補加15 μmol/L腺苷鈷胺素以確保黑暗條件下CarH-VPRH 的激活作用。通過菌體生長量和熒光蛋白表達量的測定，得到綠光響應傳感器的動態(tài)響應曲線（圖3）。結(jié)果如圖3（a）所示，光照條件動態(tài)切換組與始終綠光照射組和始終黑暗組的菌株生長量隨時間變化趨勢基本一致。紅色熒光蛋白動態(tài)響應光照條件變化的信號輸出如圖3（b）所示，對數(shù)期（0～24 h）的熒光蛋白表達量均較低，可能是由于處于生長前期的細胞胞內(nèi)還沒有足量的CarH-VPRH 表達積累，從而使依賴于VPRH 轉(zhuǎn)錄激活性能的熒光蛋白表達強度較低。始終黑暗組的熒光蛋白表達量在24～60 h內(nèi)迅速增加，并在生長后期60～120 h 內(nèi)呈現(xiàn)持續(xù)快速增長的趨勢，表明此階段胞內(nèi)積累的CarH-VPRH已足夠激活熒光蛋白的高表達，在120 h 時，單位細胞熒光強度可達到4809.40。始終綠光照射組的熒光蛋白表達量則一直維持在較低水平，熒光信號強度在0～35 之間。光照條件動態(tài)切換組在24 h 由綠光照射改為黑暗時，熒光蛋白表達量迅速增加，和始終黑暗組具有相同的速率，36 h再次切換為綠光照射時，熒光蛋白表達量基本保持不變，且在之后的6次光照條件切換中均保持同樣快速且靈敏的響應，即黑暗條件下熒光蛋白持續(xù)穩(wěn)定地表達，綠光照射則能及時抑制熒光蛋白的表達，體現(xiàn)了綠光響應傳感器對光照條件變化動態(tài)響應的高度靈敏性。該系統(tǒng)對綠光的快速響應在時空上精確控制基因表達水平具有一定的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

圖3 綠光響應傳感器對光照條件的動態(tài)響應Fig.3 Dynamic response of the green light response sensor to light conditions

2.1.3 綠光響應傳感菌株的細胞成像

為更加直觀地分析綠光照射和黑暗條件對工程菌株的激活表達差異性，本實驗采用尼康激光共聚焦顯微鏡對菌體進行顯微成像（圖4）。根據(jù)2.2 的實驗結(jié)果，收集經(jīng)過72 h 分別在光照和黑暗條件培養(yǎng)的工程菌株Y1-CVH，使胞內(nèi)的mcherry基因高效表達。如圖4所示，黑暗組對應的菌株可明顯檢測到胞內(nèi)mCherry的信號，而綠光照射組幾乎沒有顯示出熒光，綠光響應系統(tǒng)具有應用于Y.lipolytica菌株目標基因調(diào)控表達的能力。

圖4 綠光調(diào)控細胞成像Fig.4 Cell imagines regulated by green light irradiation

2.2 綠光響應傳感器在對香豆酸及柚皮素合成中的應用

2.2.1 綠光響應傳感器在對香豆酸合成中的應用

對香豆酸合成的其中一種方式是通過酪氨酸的解氨作用脫去氨基形成對香豆酸，酪氨酸解氨酶（TAL）是催化酪氨酸轉(zhuǎn)化為對香豆酸的關鍵限速酶。本研究利用綠光誘導型傳感器調(diào)控tal基因表達［圖5（a）］，構建獲得一株對光誘導有顯著響應的工程菌Yl-CA。通過HPLC 對發(fā)酵產(chǎn)物進行分析后發(fā)現(xiàn)［圖5（b）］，綠光照射可明顯影響工程菌Yl-CA 的對香豆酸產(chǎn)量，在與對香豆酸標準品出峰時間一致的13.7 min處，光照條件下產(chǎn)物峰面積明顯小于黑暗組。之后設置了3組不同的光照條件，考察了對香豆酸在96 h 發(fā)酵周期中的產(chǎn)量變化。從不同發(fā)酵時間點的產(chǎn)量對比可知，隨著菌株培養(yǎng)時間的增加，對香豆酸產(chǎn)量增加，且Yl-CA 在3組不同光照條件下的對香豆酸產(chǎn)量具有明顯差異性。如圖5（c）所示，第1組始終保持黑暗條件的菌株在96 h對香豆酸產(chǎn)量為99.1 mg/L；第2組始終綠光照射的菌株在96 h 產(chǎn)量僅為49.6 mg/L；第3 組0～48 h 黑暗，48 h 后保持綠光照射的菌株在96 h 對香豆酸產(chǎn)量為82.0 mg/L。黑暗條件與始終綠光誘導相比，對香豆酸產(chǎn)量有2倍的增加；當48 h時將光照條件由黑暗轉(zhuǎn)變綠光照射時，對香豆酸的合成速率減緩，其終產(chǎn)量僅達到始終黑暗條件下的82.7%，表明后期綠光照射對對香豆酸合成能達到一定的抑制效果。此策略可應用于與目標產(chǎn)物競爭相同前體的細胞內(nèi)必需營養(yǎng)物質(zhì)的合成調(diào)控中，以達到平衡細胞生長和產(chǎn)物合成的目的。由于本研究中菌株的莽草酸途徑等前體合成通路未經(jīng)過全面系統(tǒng)改造，所以對香豆酸產(chǎn)量較低，但光誘導菌株產(chǎn)對香豆酸仍具有較大的提升空間。

圖5 綠光調(diào)控對香豆酸合成Fig.5 p-Coumaric acid synthesis regulated by green light irradiation

2.2.2 綠光響應傳感器在柚皮素合成中的應用

在前期對香豆酸合成可顯著響應光照的基礎上，繼續(xù)探究光控對其衍生產(chǎn)物——柚皮素合成效果的影響［圖6（a）］。工程菌株Yl-NA 分別在光照和黑暗條件下，發(fā)酵96 h 后收集發(fā)酵液樣本進行產(chǎn)物測定，可測得中間產(chǎn)物對香豆酸和終產(chǎn)物柚皮素的特異的色譜峰［圖6（b）］。之后設置四組不同光照條件，考察不同條件對細胞生長量、對香豆酸和柚皮素產(chǎn)量的影響［圖6（c）～（e）］。結(jié)果顯示，發(fā)酵菌株Yl-NA 的生物量在光照組和黑暗組之間具有一定的差異［圖6（c）］。在產(chǎn)物合成方面，始終保持黑暗條件的菌株合成對香豆酸和柚皮素的能力強于始終綠光照射組［圖6（d）、（e）］，在96 h 時兩者的產(chǎn)量分別達到4.7 倍和2.6 倍的差異，其中終產(chǎn)物柚皮素在黑暗組條件下的產(chǎn)量最高可達到117.1 mg/L。為了進一步考察不同光照時間的動態(tài)變化，設置前期分別綠光照射24 h 和48 h，之后在黑暗條件下繼續(xù)發(fā)酵的兩個實驗組。結(jié)果顯示，與始終光照處理的實驗組相比，階段性切換光照條件的實驗組中對香豆酸和柚皮素的合成產(chǎn)量明顯增加；特別在24 h 將綠光照射轉(zhuǎn)變?yōu)楹诎颠@一組，Yl-NA合成對香豆酸和柚皮素的能力明顯增強，且其對香豆酸合成能力略高于始終黑暗組，在96 h 時對香豆酸產(chǎn)量可達161.4 mg/L，比始終黑暗組高出1.2 倍，說明該光控系統(tǒng)具有較好且靈敏的切換響應。在柚皮素合成途徑中，對香豆酸濃度是柚皮素合成效率的第一個限速步驟，黑暗組和先光照24 h 再黑暗組中，對香豆酸產(chǎn)量明顯高于其他兩組［圖6（d）］，相對應柚皮素的產(chǎn)量也較高［圖6（e）］，但由于CHS活性高低是限制柚皮素合成的第二個限速步驟［圖6（a）］［39］，所以對香豆酸高產(chǎn)的兩組在柚皮素產(chǎn)量上并沒有顯著區(qū)別，后續(xù)可將高活性的CHS 進行光控元件構建，達到解除兩個限速步驟的目的，使柚皮素的產(chǎn)量在光控條件下進一步提升。此外，菌株Yl-NA 在綠光照射下的生長量略高于黑暗組，且在綠光照射24 h 后切換至黑暗條件的處理組中，對香豆酸產(chǎn)量高于其他組，可能是前期短時間照射可以讓細胞更好地生長，從而有利于后期產(chǎn)物的合成。這種結(jié)合培養(yǎng)條件或者生理代謝特征的可控表達策略，有利于提升工程菌株的合成性能。Lü 等［40］利用脂肪酸誘導型和柚皮素誘導型系統(tǒng)協(xié)調(diào)菌株生長、脂肪酸基礎代謝與產(chǎn)物合成途徑共用malonyl-CoA 前體帶來的供需矛盾，促進malonyl-CoA 衍生產(chǎn)物柚皮素的有效合成；Zhou等［41］在大腸桿菌（Escherichia coli）中利用對香豆酸傳感器和柚皮素傳感器協(xié)調(diào)產(chǎn)物合成與細胞生長的關系，最終將柚皮素產(chǎn)量提高到原始菌株的8.7 倍。后期研究中如果將環(huán)境因子（如光照）響應系統(tǒng)和上述的中間產(chǎn)物及終產(chǎn)物傳感器綜合使用，可進一步提升工程菌株的合成潛力。綜合分析誘導型工具的應用效果以及本研究的實驗結(jié)果可知，光誘導合成通路的設計，在多步酶催化的天然產(chǎn)物合成方面具有較好的效果，并且在平衡細胞的生長和產(chǎn)物的合成方面具有一定的潛力。同時，因為柚皮素合成基因（4cl，chs及chi）表達強度等參數(shù)未系統(tǒng)性優(yōu)化，導致部分對香豆酸積累及其下游產(chǎn)物轉(zhuǎn)化效率較低；為此在后續(xù)研究中一方面需探索光控表達模式在前體高效轉(zhuǎn)化利用方面的應用策略，另一方面需系統(tǒng)優(yōu)化底盤細胞的合成途徑，以實現(xiàn)柚皮素等天然產(chǎn)物在Y. lipolytica底盤細胞中的高效生產(chǎn)。

圖6 綠光調(diào)控柚皮素合成Fig.6 Naringenin synthesis regulated by green light irradiation

3 結(jié)論

隨著合成生物學的迅猛發(fā)展，如何構建多樣化的生物傳感器來調(diào)控和檢測細胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物，定向改造代謝途徑提高產(chǎn)量及品質(zhì)越來越受到關注。在近幾十年中，多種化學誘導系統(tǒng)已在酵母細胞的基因表達調(diào)控中發(fā)揮作用，并得到較好的效果，但由于化學誘導劑在培養(yǎng)過程中擴散、無法去除且成本較高等缺陷，不能滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需求。而光與化學物質(zhì)相比，是一種理想的基因誘導劑，可以在特定的時間和空間進行精確調(diào)控，并已得到了一定的開發(fā)和應用［42-43］。本研究所使用的一種響應綠光誘導抑制下游基因轉(zhuǎn)錄表達的光控元件CarH-VPRH，可以在真核細胞——解脂耶氏酵母中發(fā)揮功能，并且在還未充分優(yōu)化的條件下，黑暗和光照組的熒光信號在120 h時相差143 倍［圖3（b）］。通過每12 h 切換光照和黑暗處理，熒光信號可即時響應光照且抑制和激活熒光蛋白的表達，實現(xiàn)了動態(tài)精確調(diào)控的目標［圖3（b）］。

本研究中還發(fā)現(xiàn)，光控系統(tǒng)與細胞生長量存在一定的相關性。在柚皮素和對香豆酸合成過程中，生長量有較為明顯的差異［圖6（c）］，說明代謝產(chǎn)物的積累會對細胞生長產(chǎn)生抑制作用，為了解除抑制效應，可在產(chǎn)物生產(chǎn)到一定階段，加入光照進行干預調(diào)控，停止產(chǎn)物轉(zhuǎn)化和積累，從而轉(zhuǎn)向細胞初級代謝，達到積累細胞生長量的目的。Binder 等［44］在谷氨酸棒狀桿菌中利用光控生產(chǎn)朱欒倍半萜，獲得高產(chǎn)，由于朱欒倍半萜對菌體生長有嚴重影響，通過光控在生長期抑制朱欒倍半萜的合成，當菌體達到一定密度后，用光誘導半萜合酶基因表達，從而在不影響菌體生長情況下，獲得高產(chǎn)量的朱欒倍半萜。同樣，在我們生物合成某些生物質(zhì)產(chǎn)品過程中，通過精確調(diào)控光照時間和強度，可以尋找到代謝產(chǎn)物積累與細胞生長之間的動態(tài)平衡，開發(fā)動態(tài)光照及無光的發(fā)酵調(diào)控策略，達到細胞生長和產(chǎn)物產(chǎn)量的最大化。

綜上，本研究首次設計應用于Y. lipolytica的光控誘導表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠顯著地響應綠光，有效調(diào)控靶標基因的轉(zhuǎn)錄。在天然產(chǎn)物合成中，實現(xiàn)了動態(tài)實時調(diào)控細胞響應綠光進行對香豆酸及柚皮素產(chǎn)物合成的目標，雖然目前搖瓶發(fā)酵水平與其他研究中的產(chǎn)量具有一定差距，但后續(xù)可以從光照強度、時間及代謝合成的區(qū)室化策略等方面進一步優(yōu)化以提升目標產(chǎn)物的產(chǎn)量。綠光誘導傳感器又一次重現(xiàn)了Y. lipolytica中原核轉(zhuǎn)錄因子與通用型激活結(jié)構域協(xié)同設計并開發(fā)外源轉(zhuǎn)錄因子衍生傳感器的方法的有效性［27］。后續(xù)對于傳感器的信號輸出規(guī)律、信號強度提升策略等還有待進一步研究，促進光誘導傳感器在Y. lipolytica的應用。本研究初步建立了在Y. lipolytica中綠光調(diào)控抑制某一特定基因的轉(zhuǎn)錄的體系，后續(xù)可將這一策略推廣應用于抑制與目標產(chǎn)物合成競爭性途徑的調(diào)控，實現(xiàn)產(chǎn)物的規(guī)?；a(chǎn)。

致謝：本研究得到國家重點研發(fā)計劃“合成生物學”重點專項（2018YFA0900404；2020YFA0908800）和國家自然科學基金（31730004）的支持。