王鳳姣，徐海洋，閆建斌，李偉

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所，深圳市農(nóng)業(yè)合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518120；2 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430071；3 重慶大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400044）

農(nóng)藥對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)至關(guān)重要，全球農(nóng)藥市場(chǎng)總體趨勢(shì)呈現(xiàn)增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，自2018 年開始全球殺蟲劑市場(chǎng)以5.2%的年復(fù)合增長(zhǎng)率持續(xù)增長(zhǎng)，預(yù)計(jì)2025 年全球殺蟲劑市場(chǎng)銷售額將達(dá)到276.1 億美元（https：//www.alliedmarketresearch.com/insecticidesmarket）。目前使用最多的三類殺蟲劑分別為有機(jī)磷類、新煙堿類與擬除蟲菊酯類等，其中擬除蟲菊酯是天然除蟲菊酯的化學(xué)合成類似物，占全球殺蟲劑市場(chǎng)的12.8%（https：//www.imarcgroup.com/pyrethroids-market），但是隨著煙堿類農(nóng)藥造成的大量蜜蜂集體死亡和有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)人體的毒性而逐漸淘汰，菊酯類農(nóng)藥將成為唯一的可以安全使用的農(nóng)藥產(chǎn)品。

目前化學(xué)合成殺蟲劑雖然已得到了廣泛的應(yīng)用，但其對(duì)人類健康和環(huán)境生態(tài)產(chǎn)生了諸多負(fù)面影響。合成的化學(xué)殺蟲劑通常在環(huán)境中停留時(shí)間長(zhǎng)，傳播距離遠(yuǎn)，通過食物鏈在食品和人體內(nèi)富集，引起包括皮膚、胃腸道、神經(jīng)、呼吸、生殖和內(nèi)分泌等多種不良健康反應(yīng)［1-3］?；诨瘜W(xué)合成殺蟲劑對(duì)人類健康和環(huán)境生態(tài)的諸多負(fù)面影響，尋找安全替代殺蟲劑來源在生物學(xué)研究中至關(guān)重要。

生物農(nóng)藥是從生物體中合成的天然物質(zhì)，根據(jù)來源不同，可分為生化生物農(nóng)藥、植物生物農(nóng)藥和微生物生物農(nóng)藥［4］。相對(duì)化學(xué)合成農(nóng)藥，大部分生物農(nóng)藥易降解（有毒生物來源的除外），更加安全，而且對(duì)環(huán)境的負(fù)面影響更小。其中植物來源的次生代謝物，如酚類、萜類、生物堿等，均可作為生物農(nóng)藥用于植物保護(hù)［5-6］。作為植物性天然殺蟲劑的重要來源之一，植物精油是從植物中提取的混合揮發(fā)性芳香化合物，富含次生代謝產(chǎn)物，如萜類、苯丙素和脂肪酸等，對(duì)哺乳動(dòng)物無毒，而且在環(huán)境中停留時(shí)間短，然而精油的性能取決于化學(xué)成分、毒性和生物活性［7］，提取混合物的復(fù)雜性和提純步驟中的困難限制了其大量應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域［5-7］。

除蟲菊酯是一種廣泛使用的植物源殺蟲劑，來自菊科植物除蟲菊（Tanacetum cinerariifolium），是除蟲菊花精油的主要成分。目前從除蟲菊中天然提取仍然是除蟲菊酯的主要生產(chǎn)方式，然而除蟲菊的種植受海拔、土壤、氣溫的影響較為明顯，全球每年的產(chǎn)量?jī)H為0.8 萬噸，而對(duì)天然除蟲菊酯的需求已超過2.1 萬噸，供給嚴(yán)重不足（http：//www.fao.org/faostat/en/#data/QC）。雖然除蟲菊酯的工業(yè)合成類似物以相對(duì)低廉的價(jià)格和較大規(guī)模的生產(chǎn)，產(chǎn)量每年5萬噸以上，但是伴隨而來的是化學(xué)合成引起的環(huán)境污染、不可再生能源消耗和不易降解的擬除蟲菊酯環(huán)境殘留，同時(shí)由于需求增長(zhǎng)過快，合成前體價(jià)格暴漲。盡管目前也有部分植物源殺蟲劑投入使用，但是除蟲菊酯仍然是全球使用最廣泛的植物源殺蟲劑［8-9］。

近100年的使用和研究表明除蟲菊酯在農(nóng)藥應(yīng)用方面效果是十分可觀的。最近幾年除蟲菊酯的生物合成已有了深入研究，鑒定到的基因也從2個(gè)增加到了9 個(gè)［10-15］，為體外生物合成生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。另外，近期的合成生物學(xué)研究表明，通過異源宿主表達(dá)，利用內(nèi)源性除蟲菊酯防御系統(tǒng)改造農(nóng)作物來提高農(nóng)作物的抗蟲性；或者微生物發(fā)酵生產(chǎn)除蟲菊酯或其前體物質(zhì)是可行的［16-17］。

21 世紀(jì)以來，合成生物學(xué)領(lǐng)域迅速發(fā)展，除蟲菊酯作為一類重要的綠色殺蟲劑，從簡(jiǎn)單的單酶催化到將合成元件流水線式組裝入微生物細(xì)胞工廠或者是植物底盤，從頭合成或從中間體通過一系列反應(yīng)最終得到產(chǎn)物或者提高除蟲菊酯在綠色農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，運(yùn)用合成生物學(xué)理念，改變傳統(tǒng)的除蟲菊酯的應(yīng)用方法，將有利于降低生產(chǎn)成本和環(huán)境污染。本文主要介紹了除蟲菊酯的成分和結(jié)構(gòu)、研究歷史，闡明目前的生物合成機(jī)制，總結(jié)了目前天然除蟲菊酯在合成生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用研究進(jìn)展，期待在未來可以利用合成生物學(xué)手段提高綠色農(nóng)藥的利用效率。

1 除蟲菊和除蟲菊酯的生物合成

1.1 簡(jiǎn)介和研究歷史

除蟲菊起源于克羅地亞（圖1），19 世紀(jì)初在西歐、美國(guó)等地人們發(fā)現(xiàn)了除蟲菊特殊的殺蟲性質(zhì)，產(chǎn)品主要作為家用殺蟲劑［10，18］。19 世紀(jì)末傳入日本，至20 世紀(jì)30 年代日本在種植生產(chǎn)方面處于壟斷地位［19］。第二次世界大戰(zhàn)后，東非國(guó)家承接了世界上大部分除蟲菊的生產(chǎn)，其中肯尼亞是世界上除蟲菊的主產(chǎn)地，其除蟲菊產(chǎn)量占全球產(chǎn)量的70%～90%［20］。隨著人類社會(huì)的不斷發(fā)展，綠色可持續(xù)的發(fā)展觀念逐漸成形，20 世紀(jì)初天然的除蟲菊酯成為廣泛使用的農(nóng)業(yè)農(nóng)藥的替代品，在抵御昆蟲侵害方面起重要的作用（圖1）［21-22］。

圖1 除蟲菊酯發(fā)展與應(yīng)用年鑒Fig.1 Chronicles for the development and application of pyrethrins and their derivatives

除蟲菊酯是一種快速接觸性神經(jīng)毒劑，它攻擊昆蟲的外周神經(jīng)系統(tǒng)，滲透到昆蟲的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，作用于神經(jīng)膜的電壓敏感鈉通道，激活閾值較低的鈉通道來影響鈉通道，導(dǎo)致鈉電流長(zhǎng)時(shí)間流入神經(jīng)元，從而破壞昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)［8］。神經(jīng)興奮導(dǎo)致能量耗竭和神經(jīng)肌肉疲勞，引發(fā)多動(dòng)、震顫和僵硬癱瘓，以致死亡［23，24］，這在許多情況下是不可逆的［25］。與許多作用相對(duì)緩慢的植物性殺蟲劑相比，除蟲菊酯起效非?？欤?6］。

除蟲菊酯被廣泛用于家庭、農(nóng)業(yè)園藝、食品儲(chǔ)存、醫(yī)療和獸醫(yī)重要害蟲的防治，對(duì)多種蟲類都有效，包括昆蟲綱的鱗翅目（卷心菜環(huán)紋夜蛾［27］和黏蟲［28］）、雙翅目（家蠅［29］）、膜翅目、同翅目（蚜蟲［30］）、鞘翅目（蟑螂［31］）、胸翅目、半翅目（臭蟲［31］）、劍翅目、蚤目、纓翅目（西花薊馬［21］），以及蛛形綱的蜱螨［31］、硬蜱［8，32-33］。

除蟲菊酯的優(yōu)勢(shì)是對(duì)于蜜蜂和蝴蝶沒有毒性［33］，對(duì)哺乳動(dòng)物和人類的毒性也相對(duì)較低［20］。根據(jù)美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局（USEPA）和世界衛(wèi)生組織（WHO）的測(cè)定，天然除蟲菊酯對(duì)于大鼠的半數(shù)致死量（LD50）是700 mg/kg，而人工合成的氯氰菊酯和溴氰菊酯的LD50分別為247 mg/kg 和128 mg/kg［34］。雖然除蟲菊酯對(duì)于魚類有一定毒性，但相較于擬除蟲菊酯毒性較低，天然除蟲菊酯對(duì)虹鱒魚的LD50為5.1 mg/kg，芐呋菊酯、氯氰菊酯和溴氰菊酯的LD50則分別為0.28 mg/kg、0.38 mg/kg和1.97 mg/kg［34］.

除蟲菊酯在光照下容易被降解，其半衰期為2 h 至2 天［35-36］。天然除蟲菊酯噴灑果實(shí)表面的半衰期不超過2 h，而在土壤中的殘留也在4 天內(nèi)從0.91 mg/kg 降為0.11 mg/kg，一個(gè)月之后則小于0.002 mg/kg［37-38］。人工設(shè)計(jì)生產(chǎn)的擬除蟲菊酯在土壤中的半衰期可以長(zhǎng)達(dá)數(shù)周或數(shù)月，在35～165天不等［34，39］，易導(dǎo)致害蟲對(duì)擬除蟲菊酯產(chǎn)生耐藥性，從而對(duì)環(huán)境和生態(tài)造成不容忽視的危害［40-43］。相比之下，天然除蟲菊酯對(duì)已產(chǎn)生擬除蟲菊酯耐藥性的一些害蟲仍有效果［44］。

1.2 結(jié)構(gòu)和分類

1923 年，Yamamoto 首次報(bào)道除蟲菊中活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)含有一個(gè)環(huán)丙烷環(huán)［45］。1924 年，諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Staudinger 和Ruzicka 確定了酸配體部分的正確結(jié)構(gòu)［46］。LaForge 和 Barthel 于 1944 年最終確定了除蟲菊酯Ⅰ和Ⅱ的正確結(jié)構(gòu)，同時(shí)從除蟲菊提取物中分離出瓜菊酯Ⅰ和Ⅱ［47］。除蟲菊酯Ⅰ酸配體的絕對(duì)構(gòu)型由Crombie和Harper于1954年確定［45］，隨后，除蟲菊酯Ⅱ酸配體的絕對(duì)構(gòu)型由Ⅰnouye 和 Ohno 確 定［45，48］。 1958 年 ， Katsuda 和Ⅰnouye證實(shí)了醇配體的絕對(duì)構(gòu)型，即除蟲酮醇和瓜菊酮醇［49］。1966 年，Godin 和他的同事分離出兩種更相關(guān)的次要成分，茉莉菊酯Ⅰ和Ⅱ（圖2）［50］。這進(jìn)一步促進(jìn)了除蟲菊酯作用方式和合成通路的研究。

圖2 除蟲菊酯不同組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structures of pyrethrins

除蟲菊可以合成六種不同的除蟲菊酯，分為Ⅰ型和Ⅱ型的茉莉菊酯、除蟲菊酯和瓜菊酯。從結(jié)構(gòu)方面而言，除蟲菊酯由一個(gè)醇配體和一個(gè)酸配體縮合而成［51］。依據(jù)側(cè)鏈的不同，酸配體有兩種：菊酸（chrysanthemic acid）和第二菊酸（pyrethric acid）。含有菊酸的為Ⅰ型，含有第二菊酸的為Ⅱ型。醇配體有三種，包括：瓜菊酮醇（cinerolone）、茉莉酮醇（jasmolone）和除蟲菊酮醇（pyrethrolone），含有不同醇基的分別被命名為：瓜菊酯（cinerin）、茉莉菊酯（jasmolin）和除蟲菊酯（pyrethrin），如圖2所示［52］。不同除蟲菊植株中6種除蟲菊酯成分含量有所不同，除蟲菊酯Ⅰ、Ⅱ占大部分（約70%），其含量直接決定了該混合物的殺蟲活性［34］。

以天然除蟲菊酯的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，對(duì)其酮醇部分或有機(jī)酸部分分別或同時(shí)進(jìn)行修飾，合成相對(duì)更加穩(wěn)定的擬除蟲菊酯。根據(jù)其對(duì)不同配體的修飾不同，可以將其分為三類：對(duì)酸配體修飾所得的擬除蟲菊酯（如四溴菊酯、氟胺氰菊酯等）；對(duì)天然除蟲菊酯醇配體修飾，如丙烯菊酯、炔呋菊酯等擬除蟲菊酯；對(duì)醇、酸和酯鍵同時(shí)修飾，如醚菊酯、三氟醚菊酯等［53］。

1.3 合成途徑

除蟲菊酯主要在花序中合成，大約94%的除蟲菊酯積累在種子中［20，22］。在成熟植物中，葉片含有的除蟲菊酯遠(yuǎn)低于花，在受到損傷誘導(dǎo)后含量增加［8，20，25，54］。腺毛在除蟲菊酯的生物合成中起著主要作用，酸配體和醇配體的合成主要位于花子房外壁的腺體腺毛中，酸醇縮合發(fā)生在果皮中［22］。目前對(duì)除蟲菊酯生物合成路徑中酸配體的合 成 解 析 已 經(jīng) 完 成［11，15］， 醇 配 體 中 茉 莉 酮醇和除蟲酮醇的合成通路也已基本解析完成（圖3）［12-13］。

圖3 除蟲菊酯生物合成途徑Fig.3 Pyrethrin biosynthesis pathway

酸配體菊酸和第二菊酸來源于質(zhì)體中1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸（DXP）萜類途徑［1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate（DXP）terpenoid pathway］。菊醇合成酶（TcCDS，chrysanthemyl diphosphate synthase）是除蟲菊酯生物合成的第一個(gè)關(guān)鍵酶，定位于質(zhì)體中，屬于異型的萜類合成酶［15，22，55-56］，能夠催化兩個(gè)二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP，dimethylallyl pyrophosphate）分子生成菊醇二磷酸（CPP，chrysanthemyl diphosphate）［56］，CPP可以在同樣定位于質(zhì)體的磷酸水解酶Nudix1 的作用下水解生產(chǎn)菊醇二磷酸［57］，推測(cè)可能還有其他磷酸酶參與菊醇的合成［11，57］。菊醇是合成菊酸和第二菊酸的分支點(diǎn)。菊醇隨后在兩步脫氫酶（TcADH2，alcohol dehydrogenase 2 和TcALDH1， aldehyde dehydrogenase 1）的作用下，依次氧化為菊酮和菊酸［11］；菊醇在羥化酶 （TcCHH，chrysanthemol 10-hydroxylase）、脫氫酶TcADH2 和TcALDH2 的作用下生成10-羧基菊酸，然后進(jìn)一步在甲基轉(zhuǎn)移酶（TcCCMT，10-carboxychrysanthemic acid methyltransferase）的作用下將C10 位氧化形成的羧基甲基化形成甲酯，即第二菊酸，這些步驟都發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中［11］。

與除蟲菊酯酸配體的生物合成相比，對(duì)醇配體的生物合成通路的解析尚不完整。用［1-13C］-D-葡萄糖飼喂產(chǎn)生除蟲菊酯的除蟲菊花器官，檢測(cè)到與醇配體前體亞麻酸相一致的帶有13C 標(biāo)記除蟲菊酯［58-59］。兩個(gè)細(xì)胞色素P450 酶參與茉莉酮醇和除蟲酮醇的合成，羥化酶（TcJMH，jasmone hydroxylase）催化茉莉酮（jasmone）生成茉莉酮醇開始，茉莉酮醇在除蟲酮醇合成酶（TcPYS，pyrethrolone synthase）的作用下，將戊烯基的末尾碳碳鍵去飽和生成除蟲酮醇［12-13，57］。上游前體茉莉酮，推測(cè)來自于茉莉酸合成途徑，是以亞麻酸為前體的一系列氧化還原反應(yīng)，合成最早發(fā)生在質(zhì)體中，隨后進(jìn)入過氧化物酶體，分別定位于質(zhì)體膜的JASSY 和過氧化物體膜的CTS（COMATOSE）的兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與中間體在不同細(xì)胞器間的運(yùn)輸。最近的標(biāo)記研究表明，12-氧代植物二烯酸（OPDA）和順式茉莉酮都是醇配體的前體，而反應(yīng)繞過了茉莉酸［60］，除蟲菊中催化順式茉莉酮生成的酶還需要進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。

最后在細(xì)胞外周，醇配體和酸配體在酯水解酶TcGLⅠP（GDSL lipase）的催化作用下進(jìn)行酸醇縮合生成除蟲菊酯［61］，菊酸和第二菊酸在與醇配體進(jìn)行醇酸縮合之前是否先與輔酶A偶聯(lián)存在爭(zhēng)議，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索［51］。相關(guān)基因總結(jié)于表1。

表1 參與除蟲菊酯生物合成途徑的基因Tab.1 Genes involved in the pyrethrin biosynthesis pathway

除蟲菊酯生物合成在多個(gè)不同層面受到調(diào)控，包括組織和發(fā)育時(shí)期、細(xì)胞區(qū)隔和誘導(dǎo)積累，但是目前僅停留在基因表達(dá)和代謝物積累的測(cè)定上，尚未有分子生物學(xué)和生物化學(xué)的報(bào)道驗(yàn)證相關(guān)調(diào)控因子和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，有待進(jìn)一步研究。大部分生物合成發(fā)生在早期發(fā)育中的花蕾中轉(zhuǎn)錄分析表明，所有與除蟲菊酯生物合成相關(guān)的基因主要在管狀花中表達(dá)［11-13，15-16，57］。所有除蟲菊酯生物合成基因的mRNA 水平在花蕾發(fā)育早期都很高，但隨著花的開放和成熟而減少［11，13，15-16，57］。除蟲菊幼苗中可檢測(cè)到低量的除蟲菊酯，TcCDS 等相關(guān)合成基因轉(zhuǎn)錄水平在幼苗中也相對(duì)較低［10，22］。除蟲菊酯從花組織轉(zhuǎn)移到發(fā)育中的瘦果中，并隨后在胚中積累［10，22］。 茉 莉 酸 甲 酯 、 揮 發(fā) 性 有 機(jī) 化 合 物（VOCs，volatile organic compounds）和機(jī)械傷害都可以誘導(dǎo)菊酯在除蟲菊花組織中的合成，且相關(guān)基因的表達(dá)和菊酯在營(yíng)養(yǎng)組織中的積累均可以受到誘導(dǎo)［10，65-66］。除蟲菊酯合成涉及多個(gè)細(xì)胞區(qū)室的轉(zhuǎn)變，酸配體合成最早在質(zhì)體，后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中，合成的酮醇配體也需要進(jìn)入細(xì)胞間隙才會(huì)被定位其中的TcGLⅠP 催化［22］，尚不明確這些配體的轉(zhuǎn)移是否需要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的參與，如圖3所示。

隨著轉(zhuǎn)錄組共表達(dá)技術(shù)和各種體外驗(yàn)證手段，特別是煙草瞬時(shí)表達(dá)體系的成熟，菊酸和第二菊酸的完整合成途徑，以及部分醇配體的合成途徑得到解析。除蟲菊的基因組草圖近期也得到測(cè)定，大小為7.1 Gb，其中發(fā)現(xiàn)了大量的防御相關(guān)毒性蛋白、調(diào)控蛋白和代謝相關(guān)酶類的編碼基因，有些為物種特異性基因［67］。以上條件為除蟲菊酯合成途徑的完全解析和調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)，進(jìn)而為利用合成生物學(xué)進(jìn)行體外異源合成奠定了良好的基礎(chǔ)。

2 除蟲菊酯的合成應(yīng)用

2.1 天然除蟲菊酯傳統(tǒng)生產(chǎn)方法的局限性

目前從除蟲菊中提取仍然是天然除蟲菊酯的主要生產(chǎn)方式，通常通過對(duì)磨碎的除蟲菊花器官進(jìn)行油基提取而獲得，通過噴灑的方式使用。20 世紀(jì)90 年代之前，天然除蟲菊酯的提取技術(shù)主要是溶劑萃取法，正己烷［68-69］、丙酮、甲醇、丙醇、二氯甲烷［69］、石油醚［70］和乙醇等有機(jī)溶劑進(jìn)行提?。?4，71-72］。有機(jī)溶劑提取產(chǎn)能較快，但是涉及安全和污染的問題。隨后超臨界流體萃取工藝得到發(fā)展［73］，其處理周期短，無溶劑回收問題，生產(chǎn)過程安全高效，加速了天然除蟲菊酯市場(chǎng)的擴(kuò)展。另外，微波萃取技術(shù)和超聲波輔助提取以其工序短、節(jié)能低耗、溶劑少、安全穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，也得到了科研領(lǐng)域和技術(shù)市場(chǎng)的青睞［74-75］。天然提取的方法雖然可以大規(guī)模應(yīng)用，但是受限于原料供應(yīng)，生產(chǎn)量受到限制。

利用懸浮培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行代謝物的生產(chǎn)，能夠確保在生產(chǎn)過程中更好地控制原材料的供應(yīng)、質(zhì)量和成本，而不受社會(huì)、政治、經(jīng)濟(jì)和氣候波動(dòng)的影響，所以高產(chǎn)愈傷組織細(xì)胞系產(chǎn)生除蟲菊酯，可以作為一種替代品，成為除蟲菊酯的原料庫。Levy 在1981 年利用莖尖或者是葉芽作為外植體開發(fā)了一種成功的培養(yǎng)技術(shù)［76］，但是除蟲菊酯主要在花器官中合成，所以利用體外生產(chǎn)除蟲菊酯存在一定的難度。1990 年Zito 和Tio 分析了三年生溫室植物的愈傷組織，結(jié)果表明，因?yàn)橛鷤M織中亞麻酸的含量較低（在醇配體合成通路上），愈傷組織中產(chǎn)生的除蟲菊酯含量較低［77］。Hitmi 等培養(yǎng)的除蟲菊愈傷組織產(chǎn)生的除蟲菊酯的含量為1%左右，但是細(xì)胞懸浮培養(yǎng)不能積累除蟲菊酯［78-79］。McLaughlin Gromley 公司于1984 年申請(qǐng)了一種用粗提的酶合成除蟲菊酯專利。該生產(chǎn)方法制備含有除蟲菊和萬壽菊的無細(xì)胞勻漿并加入甲羥戊酸或焦磷酸異戊烯孵育產(chǎn)除蟲菊酯［78］。目前懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的方法在現(xiàn)實(shí)應(yīng)用中并未得到推廣。

天然結(jié)構(gòu)的除蟲菊酯的化學(xué)合成目前有一些理論可行的方法，但未有大規(guī)模應(yīng)用。普瑞林醇等前體可通過Sonogashira 反應(yīng)形成瓜菊酮醇等醇配體［52］。外消旋菊酯乙酯通過差相異構(gòu)和外消旋可形成菊酸［80］。TsCl/N-甲基咪唑（NMⅠ）可介導(dǎo)酸醇配體的結(jié)合酯化形成除蟲菊酯［52，81］。

2.2 除蟲菊酯的異源表達(dá)合成進(jìn)展

鑒于化學(xué)合成和離體培養(yǎng)的研究未能大規(guī)模應(yīng)用，所以利用最新的合成生物學(xué)技術(shù)生產(chǎn)除蟲菊酯成為一個(gè)新的研究方向。隨著除蟲菊酯合成途徑的逐漸解析和底盤生物的構(gòu)建成熟，利用合成生物學(xué)手段異源表達(dá)除蟲菊酯合成酶，進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)除蟲菊酯及其前體物質(zhì)成為可能。由于途徑的全面解析是最近幾年才出現(xiàn)的進(jìn)展，利用異源生物表達(dá)來進(jìn)行合成生物學(xué)生產(chǎn)和改良作物抗性的相關(guān)研究尚處在起步階段。

Hu 等將除蟲菊酯的酸配體第一個(gè)合成酶TcCDS（TcCHS）編碼基因在杭菊（Chrysanthemum morifolium）中過表達(dá)，異源引入除蟲菊酯的合成途徑，結(jié)果檢測(cè)到揮發(fā)性菊醇（volatile chrysanthemol）的釋放和菊醇的糖基化衍生物菊醇苷（chrysanthemyl-6-O-malonyl-β-D-glucopyranoside）的積累，菊醇含量達(dá)到47 pmol/（h·g）（以鮮重計(jì)），菊醇苷的含量達(dá)到1.1 mmol/L，這兩種成分對(duì)蚜蟲具有獨(dú)立的生物活性，且植株并沒有導(dǎo)致有害表型的出現(xiàn)。TcCDS 在植物中的表達(dá)顯著減少了蚜蟲的繁殖，誘導(dǎo)了一種雙重防御系統(tǒng)，既有揮發(fā)性菊醇的氣味驅(qū)避作用，又有其非揮發(fā)性糖苷對(duì)蚜蟲產(chǎn)生的威懾作用［17］。

Xu 等在番茄果實(shí)中重構(gòu)了菊酸生物合成途徑，該途徑自然條件下產(chǎn)生高水平的四烯類色素番茄紅素，這是一種與菊酸具有共同前體二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）的類異戊二烯類化合物，通過在番茄果實(shí)中表達(dá)來源于除蟲菊的菊醇二磷酸合成酶（TcCDS）基因，和來源于野生番茄的醇脫氫酶（ADH）基因與醛脫氫酶（ALDH），實(shí)現(xiàn)了菊酸的異源生物合成。其中菊醇二磷酸合成酶基因來自于除蟲菊，另外兩個(gè)基因來自于野生番茄品種。表達(dá)這三種基因的番茄果實(shí)中的菊酸含量是非轉(zhuǎn)基因植株中番茄紅素的含量的1.7 倍，達(dá)到 67.1 μg/g FW，轉(zhuǎn)移的 DMAPP 中有97% 轉(zhuǎn)化為菊酸［16］。

在隨后的研究中，Xu 等采用邊解析邊重構(gòu)的策略，利用發(fā)掘的醇脫氫酶（TcADH2）、醛脫氫酶（TcALDH1）、細(xì)胞色素P450 酶（TcCCH）和甲基轉(zhuǎn)移酶（TcCCMT1）以及前期報(bào)道的TcCDS在煙草瞬時(shí)表達(dá)體系中完整重組了第二菊酸的合成通路，第二菊酸的總產(chǎn)量（包括游離和糖基化修飾）達(dá)到（24.0±2.7）μg/g［15］，為異源合成除蟲菊酯奠定了基礎(chǔ)。

醇配體的異源重組合成尚未見報(bào)道，沒有醇配體和酸配體的組裝就無法形成完整的除蟲菊配體。而且由于醇配體的前體茉莉酮在常見底盤物種（如煙草）中含量非常低，所以預(yù)測(cè)如果僅過表達(dá)參與合成的細(xì)胞色素P450，生成的產(chǎn)物含量也會(huì)過低沒有應(yīng)用價(jià)值。目前茉莉酮的合成途徑也尚未完全解析，制約著代謝重組應(yīng)用。茉莉酮的含量在很多植物（如茉莉花）的花器官中含量非常高，所以利用茉莉花等材料發(fā)掘茉莉酮的合成關(guān)鍵酶，是重組生產(chǎn)醇配體和完整除蟲菊酯的必要條件。

目前除蟲菊合成相關(guān)的調(diào)控因子和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)亦未有報(bào)道，關(guān)鍵催化酶及調(diào)控因子是否形成復(fù)合體亦未有報(bào)道，所以下游合成生物學(xué)應(yīng)用受到限制，進(jìn)一步深入研究除蟲菊酯合成途徑的調(diào)控和轉(zhuǎn)運(yùn)是除蟲菊酯合成生物學(xué)應(yīng)用的關(guān)鍵。未來更多的合成生物學(xué)技術(shù)和思路的引路將更進(jìn)一步助力合成生物學(xué)的研究，包括但不限于：利用特殊的啟動(dòng)子優(yōu)化組織特異性表達(dá)；通過密碼子優(yōu)化、增加基因的拷貝數(shù)和強(qiáng)啟動(dòng)子來增加節(jié)點(diǎn)基因的表達(dá)量；通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白引入和亞細(xì)胞定位改造來聚合上下游代謝的空間區(qū)隔；催化酶的融合表達(dá)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)優(yōu)化等手段增加催化活性；以及大片段組裝多基因串聯(lián)轉(zhuǎn)化和表達(dá)來提高異源表達(dá)的效率等，均是合成生物學(xué)研究的重點(diǎn)。

3 展 望

2016 年美國(guó)農(nóng)業(yè)部的報(bào)告預(yù)測(cè)，到2025 年，生物基化學(xué)品的產(chǎn)值將超過5000 億美元，占全部化學(xué)品的25%左右［82］。設(shè)計(jì)和合成的工程細(xì)菌用于靶向治療中的藥物載體等。以青蒿酸異源合成為標(biāo)志，合成生物學(xué)在天然產(chǎn)物、抗生素等的人工合成方面展現(xiàn)出巨大潛力。微生物發(fā)酵工程具有快速、便捷、易操控的優(yōu)勢(shì)，最新的發(fā)展通過多種技術(shù)將酶發(fā)掘、活性改造、途徑和菌種優(yōu)化、混菌發(fā)酵和發(fā)酵體系的工程優(yōu)化等相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了酵母中阿片（opiate）類藥物的全合成［83］，丁醇生物的生產(chǎn)［84］，青蒿酸［85］、紫杉烷類、硫醚抗生素等的合成［86］。植物源次級(jí)代謝產(chǎn)物在微生物中的人工生物合成，降低了對(duì)野生和珍稀植物資源的依賴，減少了對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞。目前還沒有關(guān)于利用微生物工廠化生產(chǎn)除蟲菊酯系列產(chǎn)物的研究和應(yīng)用，隨著其合成通路中關(guān)鍵酶得到進(jìn)一步的挖掘，加強(qiáng)了利用微生物發(fā)酵工程進(jìn)行工廠化生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)和潛力。

利用植物底盤進(jìn)行除蟲菊酯的生物技術(shù)生產(chǎn)具有重要意義，開發(fā)高效的植物底盤能夠提高除蟲菊酯的產(chǎn)量及其替代品的開發(fā)。與單細(xì)胞微生物相比，雖然植物體系更加復(fù)雜，周期更長(zhǎng)、基因組更大、細(xì)胞器更多、代謝與調(diào)控機(jī)制更復(fù)雜，但是植物合成生物學(xué)研究也具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，植物底盤本身具有豐富的前體物質(zhì)和完善的蛋白表達(dá)調(diào)控體系，植物來源的天然產(chǎn)物生物合成、調(diào)控及轉(zhuǎn)運(yùn)元件、線路和模塊能更好適配植物底盤。在優(yōu)化后植物底盤能夠?qū)崿F(xiàn)前體的足量供應(yīng)和催化酶等的高表達(dá)，克服原產(chǎn)植物中特異性和含量低的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)在葉片、果實(shí)、毛狀根、腺毛等組織中的規(guī)模化生產(chǎn)。同時(shí)作為自養(yǎng)生物，植物利用自然中的陽光、土壤、水等作為能量和營(yíng)養(yǎng)的來源，是未來綠色合成生物學(xué)的一個(gè)重要研究方向。隨著植物基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組和表型組等組學(xué)大數(shù)據(jù)的快速發(fā)展，利用多種組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行突變體庫篩選、元件發(fā)掘以及模型預(yù)測(cè)加速了植物代謝網(wǎng)絡(luò)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等數(shù)據(jù)發(fā)掘工作，已成為植物合成生物學(xué)研究的必備研究策略，為未來植物合成生物學(xué)研究提供了新的契機(jī)。

隨著新型載體系統(tǒng)、工程菌、大片段組裝和人工染色體以及高通量測(cè)序技術(shù)等的發(fā)展和完善，合成生物學(xué)的學(xué)科體系也日趨成熟。最近很多研究通過大片段組裝，實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因同時(shí)導(dǎo)入底盤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)。例如Zhu等利用高效多基因轉(zhuǎn)化疊加技術(shù)在胚乳中工程合成花青素培育出“紫胚乳水稻”［87］；Fu等成功解析了紫錐菊中菊苣酸的生物合成途徑，并在煙草中成功實(shí)現(xiàn)了異源構(gòu)建［88］。隨著除蟲菊酯合成途徑的解析，利用植物作為底盤進(jìn)行除蟲菊酯相關(guān)代謝產(chǎn)物的異源表達(dá)開始有了相關(guān)的報(bào)道［16］，下一步通過大片段組裝來進(jìn)行除蟲菊酯完整途徑的構(gòu)建和異源生產(chǎn)也具有更加廣闊的前景，為未來新型綠色農(nóng)藥的開發(fā)和規(guī)?；a(chǎn)提供保障，實(shí)現(xiàn)我國(guó)清潔、低能耗、無公害的農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展。