呂建明，趙歡，胡丹，高昊

（1 暨南大學(xué)藥學(xué)院，中藥及天然藥物研究所，廣東 廣州 510632； 2 暨南大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632）

炔基是許多臨床一線藥物的重要功能基團(tuán)［1］，如 FDA 批準(zhǔn)的第 1 個口服避孕藥 Enovid?［2］以及用于治療艾滋病毒感染的第1代非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑Sustiva?［3］等的主要成分都是含有炔基的小分子化合物［4-7］。自然界中也存在大量具有廣泛生物活性的炔類天然產(chǎn)物［8-11］，如從箭毒蛙的皮膚中分離獲得的histrionicotoxin 類生物堿是煙堿型乙酰膽堿受體的非競爭性抑制劑［12］，從多種傘形科植物中分離獲得的falcarinol 類聚炔化合物具有抗腫瘤、抗炎以及抗菌等活性［13-14］，從細(xì)菌中分離獲得的烯二炔類抗生素能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長［15-16］。此外，炔基還可參與一系列的化學(xué)反應(yīng)［17-21］，是重要的化學(xué)合成模塊，廣泛用于活性天然產(chǎn)物［22-23］以及功能材料［24］等的合成。特別是基于末端炔基與疊氮化物的環(huán)加成反應(yīng)（即點擊化學(xué)反應(yīng)），在藥物篩選、化學(xué)生物學(xué)以及蛋白組學(xué)等研究領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用［25］。

由于炔基是一個非常重要的結(jié)構(gòu)單元，因此開發(fā)高效的炔類化合物合成策略具有重要的意義。目前最常用的策略是通過化學(xué)方法直接制備含有炔基的目標(biāo)產(chǎn)物，但其不足之處是反應(yīng)條件嚴(yán)苛、成本高以及反應(yīng)效率低等［26-27］。另一策略是生物轉(zhuǎn)化，即將炔類化合物作為底物添加到微生物培養(yǎng)體系中或在體外與酶共孵育，通過生化反應(yīng)把炔基整合到目標(biāo)化合物中［28-31］。但是由于炔類前體通常不易獲得，該策略存在一定的局限性。合成生物學(xué)是指基于工程化設(shè)計思路，通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化的元器件和模塊來改造天然系統(tǒng)或從頭合成全新的人工生命體系，其能將結(jié)構(gòu)簡單、易于獲得、廉價的起始原料高效地轉(zhuǎn)化成不同的高附加值產(chǎn)品，而且操作簡單、綠色環(huán)保，在化學(xué)品合成領(lǐng)域有極大的應(yīng)用潛力［32-33］。因此，基于合成生物學(xué)技術(shù)的從頭合成有望成為對傳統(tǒng)化學(xué)合成以及生物轉(zhuǎn)化策略的有效補充，但其成功實施的前提是獲得催化天然產(chǎn)物中炔基形成的酶，即炔基合成酶。近年來，研究人員開展了不同炔類天然產(chǎn)物的生物合成研究，以期為炔類化合物的生物制造提供豐富的酶工具。本文綜述了不同天然產(chǎn)物中炔基的生物合成研究現(xiàn)狀，然后介紹了不同炔基合成酶在炔類化合物從頭生物合成方面的應(yīng)用情況。

1 天然產(chǎn)物中炔基的生物合成

人們從動物、植物與微生物中分離鑒定了大量不同類型的炔類天然產(chǎn)物［8，34-35］，包括脂肪酸類、聚酮類、聚酮-非核糖體肽雜合體類、氨基酸類、雜萜類等，而且炔基在同一類天然產(chǎn)物中的位置也各不相同，提示自然界中可能存在多種炔基形成機制。

1.1 脂肪酸中炔基的生物合成

炔類脂肪酸是目前分離鑒定數(shù)量最多的炔類天然產(chǎn)物，在昆蟲［36］、植物［10］與微生物［10］中均有發(fā)現(xiàn)。20 世紀(jì)60 年代，針對不飽和脂肪酸中炔基的生物合成，研究人員提出了兩種可能的機制，分別是氧化脫氫機制與烯醇消除機制。其中，氧化脫氫機制指的是脂肪酸中的順式雙鍵直接脫氫生成炔基［圖1（a）］［37］。對于烯醇消除機制，研究人員推測脂肪酸首先經(jīng)焦磷酸化形成焦磷酸烯醇式中間體， 然后發(fā)生脫羧反應(yīng)生成炔基［圖1（b）］［38］。

圖1 脂肪酸中炔基形成的兩種假說Fig.1 Two hypotheses for the biosynthesis of acetylenic bonds in fatty acids

1998 年，Lee 等［39］首先通過體外實驗發(fā)現(xiàn)高山還陽參（Crepis alpina）種子的微粒體蛋白可以在含有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的反應(yīng)體系中將14C 標(biāo)記的亞油酸酯（linoleate，1）轉(zhuǎn)化成含有炔基的還陽參油酸酯（crepenynate，2）。而且作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)反應(yīng)體系中加入一氧化碳或P450 還原酶抗體后，依然可以檢測到還陽參油酸酯的生成，因此推測催化脂肪酸中炔基合成的酶并非P450 氧化酶，可能是一類與催化脂肪酸中碳碳單鍵脫氫形成雙鍵的去飽和酶（desaturase）類似的酶。隨后，作者從C.alpina種子的cDNA中找到候選基因Crep1，其編碼的蛋白與擬南芥中的Δ12 去飽和酶有56%的相似性。最后，作者通過在釀酒酵母以及擬南芥中異源表達(dá)證實Crep1 可以將亞油酸酯C-12 與C-13 之間的雙鍵脫氫轉(zhuǎn)化成炔鍵（圖2），并將這類特殊的可以催化炔基生成的去飽和酶命名為乙炔酶（acetylenase）。此后，研究人員又陸續(xù)從其他植物、昆蟲以及微生物中鑒定了多個乙炔酶（表1）。進(jìn)一步的研究顯示乙炔酶不僅可以將脂肪鏈中的順式雙鍵脫氫生成炔基，還可像普通的脂肪酸去飽和酶一樣催化雙鍵的形成，如乙炔酶Crep1 可以催化油酸酯（oleate）脫氫生成（Z，E）-9，12-十八碳二烯酸酯［9（Z），12（E）-octadecadienoate］與（Z，Z）-9，12-十八碳二烯酸酯［9（Z），12（Z）-octadecadienoate］［40］。

表1 已鑒定的參與炔類脂肪酸生物合成的乙炔酶Tab.1 Acetylenases identified for the biosynthesis of acetylenic fatty acids

圖2 Crep1催化還陽參油酸酯中炔基的形成Fig.2 Crep1-mediated formation of acetylenic bond in crepenynate

雖然研究人員對乙炔酶的認(rèn)識較晚，但是早在20 世紀(jì)60 年代人們已經(jīng)開始了脂肪酸去飽和酶的研究［51］。去飽和酶是一類在有氧條件下通過二鐵活性中心作用于脂肪鏈碳碳單鍵的脫氫酶，分為可溶性型和膜結(jié)合型［52-54］。其中，可溶性的去飽和酶主要以連接在酰基載體蛋白（ACP）上的脂肪酸為底物，而膜結(jié)合的去飽和酶主要作用于與輔酶A、甘油或磷酸連接的脂肪酸。乙炔酶作為一類特殊的去飽和酶也無法直接作用于游離的脂肪酸，而是以脂肪酸酯為底物進(jìn)行氧化脫氫［39，48，50］。但與普通的去飽和酶不同，目前已鑒定的乙炔酶，包括以連接在酰基載體蛋白CayD 上的脂肪酸為底物的乙炔酶CayB 與CayC［50］，均屬于膜結(jié)合蛋白。2015 年，Bai 等［55］解析了小鼠來源的膜結(jié)合型的硬脂酰輔酶A（stearoyl-CoA）去飽和酶SCD1的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)SCD1 中共有9 個保守的組氨酸負(fù)責(zé)與活性中心的兩個金屬鐵離子結(jié)合，包括H116XXXXH121、 H153XXH156H157、 H294XXH297H298與His265。此外，Asn261 也可通過一分子水結(jié)合其中的一個金屬離子。將已報道的乙炔酶與SCD1 進(jìn)行氨基酸序列比較，結(jié)果顯示乙炔酶中也含有負(fù)責(zé)與鐵離子結(jié)合的保守組氨酸殘基，此外，有些乙炔酶也如SCD1 一樣含有保守的天冬酰胺，但該天冬酰胺在一些乙炔酶中會變?yōu)樘K氨酸（圖3）。此外，CayC 與CpAcet6 僅含有8 個保守的組氨酸殘基，另外1個被谷氨酰胺取代（圖3），推測這兩個乙炔酶可能像可溶性的去飽和酶一樣通過谷氨酰胺以及組氨酸與鐵離子進(jìn)行結(jié)合［56］。為了闡明乙炔酶催化的碳碳雙鍵脫氫是同步進(jìn)行還是分步進(jìn)行，Reed等［57］將2H標(biāo)記的亞油酸喂養(yǎng)到可以表達(dá)Crep1的釀酒酵母中，通過動力學(xué)同位素效應(yīng)實驗發(fā)現(xiàn)Crep1 首先拔去底物C-12 位上的氫（kH/kD=14.6±3.0），然后C-13 位上的氫再快速離去（kH/kD=1.25±0.8）（圖4），這與去飽和酶催化碳碳雙鍵形成的過程類似［58］。

圖3 乙炔酶與SCD1的氨基酸序列比對Fig.3 Sequence alignment of acetylenases with SCD1

圖4 乙炔酶催化機制Fig.4 Proposed catalytic mechanism for acetylenases

1.2 聚酮化合物中內(nèi)部炔基的生物合成

烯二炔（enediyne）是一類微生物來源的炔類聚酮化合物，其核心骨架中含有兩個炔鍵與同一雙鍵共軛的獨特結(jié)構(gòu)。根據(jù)核心骨架的差異，此類化合物分為九元烯二炔與十元烯二炔［59-60］。九元烯二炔是由以雙環(huán)［7.3.0］十二碳烯二炔（bicyclo［7.3.0］dodecadiynene）為核心的發(fā)色團(tuán)與輔基蛋白組成的，其中輔基蛋白主要用于穩(wěn)定發(fā)色團(tuán)，同時將發(fā)色團(tuán)轉(zhuǎn)運至胞外，如C-1027（3）（圖5）。十元烯二炔是以雙環(huán)［7.3.1］十三碳烯二炔（bicyclo［7.3.1］tridecadiynene）為核心骨架，此類化合物比較穩(wěn)定，不需要與輔基蛋白結(jié)合，如calicheamicin（4）（圖5）。不論是九元烯二炔還是十元烯二炔，其核心骨架均可發(fā)生重排反應(yīng)形成苯環(huán)雙自由基，然后奪取DNA脫氧核糖結(jié)構(gòu)上的氫，從而誘導(dǎo)DNA 雙鏈發(fā)生斷裂，因此，烯二炔類化合物具有極強的抗腫瘤活性［59-60］。目前，基于多聚物載體系統(tǒng)或抗體偶聯(lián)的烯二炔類藥物已在腫瘤治療中取得了一定的成功，如聚（苯乙烯-馬來酸）-neocarzinostatin于1994年在日本批準(zhǔn)上市用于治療肝癌［61］，CD33單克隆抗體-calicheamicin于2000年在美國被FDA批準(zhǔn)上市用于治療白血?。?2］。

圖5 典型的烯二炔抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.5 Chemical structures of typical enediyne antibiotics

早期關(guān)于烯二炔類抗生素的生物合成研究主要采用同位素示蹤的方法。Hensens 等［63］通過向neocarzinostatin 生產(chǎn)菌株Streptomyces carzinostaticus喂養(yǎng)13C與14C標(biāo)記的醋酸鈉來探究其生源，結(jié)果顯示neocarzinostatin的烯二炔核心結(jié)構(gòu)來源于首尾相連的乙酸單元。作者推測其核心結(jié)構(gòu)可能是由油酸酯在脂肪酸乙炔酶的作用下脫氫生成炔基，然后再發(fā)生碳碳鍵斷裂以及環(huán)化而形成的。Lam等［64］通過向Actinomadura verrucosospora喂養(yǎng)同位素標(biāo)記的醋酸鈉，發(fā)現(xiàn)烯二炔esperamicin A1核心骨架上的所有碳原子均來源于醋酸鈉，但是作者發(fā)現(xiàn)該菌株無法將油酸酯轉(zhuǎn)化成esperamicin A1。盡管同位素標(biāo)記實驗顯示烯二炔化合物的核心骨架來源于首尾相連的乙酸單元，但是無法準(zhǔn)確判斷其到底是來源于脂肪酸途徑還是聚酮途徑［65］。直到2002 年，Liu 等［66］與 Ahlert 等［67］在同一時間分別找到了C-1027 與calicheamicin 的生物合成基因簇，并通過基因敲除實驗發(fā)現(xiàn)一類重復(fù)使用的Ⅰ型聚酮合酶SgcE 與CalE8 分別參與它們核心骨架的形成。隨后，Zhang等［68］發(fā)現(xiàn)SgcE以及硫酯酶SgcE10在大腸桿菌中共同表達(dá)可催化生成1，3，5，7，9，11，13-pentadecaheptaene（5）（圖 6）。同樣地，Kong 等［69］通過體外酶催化反應(yīng)發(fā)現(xiàn)CalE8 與硫酯酶CalE7 可催化生成3，5，7，9，11，13-pentadecen-2-one（6）（圖6）。由此可見，烯二炔核心骨架的形成還需要其他修飾酶的參與。盡管 Kong 等［69］在 calicheamicin 的生物合成基因簇中發(fā)現(xiàn)了一個潛在的去飽和酶基因calU15，但將其與calE8以及calE7一起共表達(dá)后并未檢測到新的產(chǎn)物。目前，烯二炔抗生素核心骨架中炔基的生物合成機制仍不清楚。

圖6 推測的九元與十元烯二炔抗生素的生物合成途徑Fig.6 Proposed routes for biosynthesizing 9-membered and 10-membered enediyne antibiotics

1.3 聚酮-非核糖體肽雜合體中末端炔基的生物合成

海洋生物，特別是藍(lán)藻可以合成一類結(jié)構(gòu)特殊的連有末端炔基的肽類化合物［35，70］。2004 年 ，Edwards 等［71］從一株藍(lán)藻Lyngbya majusculaJHB中找到了聚酮-非核糖體肽雜合體jamaicamide B（7）（圖7）的生物合成基因簇，發(fā)現(xiàn)該基因簇中含有脂肪酰輔酶A 連接酶基因jamA，脂肪酸去飽和酶基因jamB以及?；d體蛋白編碼基因jamC，因此推測JamABC 可能負(fù)責(zé)jamaicamide B 中末端炔基的合成 。2011 年，Jones 等［72］發(fā) 現(xiàn) carmabin A（8）（圖7）的生物合成基因簇中含有與jamABC相似的3 個基因camABC。直到 2015 年，Zhu 等［73］首次闡明了jamaicamide B 中末端炔基的生物合成機制。首先連接酶JamA將5-己烯酸（5-hexenoic acid，9）與酰基載體蛋白JamC 連接形成5-hexenoyl-JamC（10），然后JamB催化5-hexenoyl-JamC中末端的碳碳雙鍵脫氫生成5-hexynoyl-JamC（11）（圖8），最后作為起始單元在聚酮合酶以及非核糖體肽合成酶的作用下引入到j(luò)amaicamide B 中。此外，作者還對乙炔酶JamB 的底物寬泛性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)JamB 對脂肪鏈的長度，碳碳雙鍵的位置以及?；d體蛋白JamC 均有嚴(yán)格的要求。為了獲得底物特異性不同于JamABC的酶工具，以期將不同長度的含有末端炔基的脂肪鏈引入到聚酮化合物或聚酮-非核糖體肽雜合體中，Zhu 等［74］以 JamABC 為探針在ⅠMG/JGⅠ數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行了基因挖掘，然后篩選到11 個候選的三基因表達(dá)盒。作者通過一系列的體外與體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)來源于Teredinibacter turneraeT7901 的ttuABC可活化 9-癸烯酸 （9-decenoic acid）并將其轉(zhuǎn)化成9-decynoyl-TtuC。

圖7 典型的含有末端炔基的聚酮-非核糖體肽雜合體的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.7 Chemical structures of typical terminal alkyne tagged PKS-NRPS hybrids

圖8 Jamaicamide B中末端炔基的生物合成途徑Fig.8 Biosynthetic pathway of terminal alkyne in jamaicamide B

1.4 氨基酸中末端炔基的生物合成

炔類氨基酸在細(xì)菌與真菌中均有發(fā)現(xiàn)，其炔基既可位于氨基酸側(cè)鏈的末端，也可位于側(cè)鏈的內(nèi)部［75-78］。2019 年，考慮到此前報道的脂肪酸以及聚酮-非核糖體肽雜合體中的炔基均是由一類特殊的去飽和酶（乙炔酶）催化形成的，Marchand等［79］推測 L-β-ethynylserine（βes，12）中的末端炔基可能也是由這類酶催化形成的。但是，作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)敲除βes 生產(chǎn)菌株Streptomyces cattleya中的去飽和酶基因后，該菌株仍可合成βes，提示βes中的炔基是由其他酶催化形成的。隨后，作者將包括S.cattleya在內(nèi)的兩株可以合成含有末端炔基氨基酸的鏈霉菌與其他26 株鏈霉菌進(jìn)行比較基因組分析，獲得了潛在的βes 生物合成基因簇。通過基因敲除與體外酶催化實驗，作者闡明了βes 的生物合成途徑（圖9）。首先，鹵化酶BesD 作用于L-lysine（13），在其Cγ位上連接一個氯原子形成4-Cl-L-lysine（14）。然后，氧化酶BesC 催化4-Cl-L-lysine 發(fā)生碳碳單鍵斷裂生成4-Cl-allylglycine（15）。裂解酶BesB 通過催化消除反應(yīng)將4-Clallylglycine 轉(zhuǎn)化成含有末端炔基的 L-propargylglycine（Pra，16）。氨基酸連接酶 BesA 可以將谷氨酸連接到Pra 的氨基上形成二肽化合物γ-L-glutamyl-L-Pra（17），其可在羥化酶BesE 的作用下轉(zhuǎn)化成γ-L-glutamyl-L-βes（18）。最后，在水解酶的作用下，γ-L-glutamyl-L-βes 脫去谷氨酸生成終產(chǎn)物βes。

圖9 L-β-ethynylserine的生物合成途徑Fig.9 The biosynthetic pathway of L-β-ethynylserine

為了深入了解BesB 是如何催化消除反應(yīng)形成炔基，作者將4-Cl-allylglycine、BesB 以及輔因子磷酸吡哆醛（PLP）添加至含有氘代水的緩沖溶液中進(jìn)行反應(yīng)，最后發(fā)現(xiàn)生成的Pra 的分子量增加了2，表明在BesB催化末端炔基形成的過程中發(fā)生了兩次質(zhì)子化反應(yīng)。人們在前期研究Pra 對PLP 依賴的胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionineγ-lyase，CSE）的抑制作用時，推測Pra 先與CSE 中的輔因子PLP結(jié)合，然后末端的炔基異構(gòu)成聯(lián)烯結(jié)構(gòu)，最后再與CSE 中的酪氨酸發(fā)生反應(yīng)從而抑制CSE 的功能［80-81］。因此，作者推測 4-Cl-allylglycine 進(jìn)入到BesB 的活性口袋后先與PLP 結(jié)合形成4-Clallylglycine-aldimine，然后依次脫去Cα與Cβ位上的質(zhì)子形成4-Cl-allylglycine-ketamine，繼續(xù)脫去氯離子形成聯(lián)烯化合物（圖10）。該中間體脫去Cδ位上的質(zhì)子后，再依次在Cβ與Cα位上發(fā)生質(zhì)子化便可形成Pra（圖10）。

圖10 BesB催化的末端炔基形成機制Fig.10 Mechanism for the biosynthesis of terminal alkyne catalyzed by BesB

1.5 雜萜中內(nèi)部炔基的生物合成

真菌中含有一類特有的異戊烯鏈中帶有炔基的雜萜化合物［8］，此類化合物還易與其他化合物發(fā)生聚合形成結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的聚合物［82-85］。前期，研究人員通過同位素標(biāo)記實驗發(fā)現(xiàn)此類化合物的非萜部分來源于莽草酸途徑［86］，但是其剩余的生物合成途徑，特別是異戊烯鏈中炔基的生物合成機制一直未被闡明。直到2020年，Lü等［87］與Chen等［88］分別解析了炔類雜萜biscognienyne B（19）以及asperpentyn（20）的生物合成途徑，發(fā)現(xiàn)此類化合物中的炔基是由P450酶催化形成（圖11）。

Lü等［87］從一株地衣內(nèi)生真菌Biscogniauxiasp.（71-10-1-1）中找到了biscognienyne B的生物合成基因簇，并利用米曲霉異源表達(dá)體系闡明了biscognienyne B 的生物合成途徑（圖11）。首先，對羥基苯甲酸（4-HBA，21）在異戊烯基轉(zhuǎn)移酶BisJ的作用下連接一個C5異戊烯鏈轉(zhuǎn)化成4-hydroxy-3-prenylbenzoic acid（22），其可被P450氧化酶BisⅠ催化生成含有炔基的化合物eutypinic acid（23）。然后，氧化脫羧酶BisD 催化氧化脫羧反應(yīng)將eutypinic acid 轉(zhuǎn)化成 siccayne（24）。異戊烯基轉(zhuǎn)移酶BisB可連接另一條C5異戊烯鏈到siccayne上從而生成pestalodiol E（25），最后在含有cupin結(jié)構(gòu)域的氧化酶BisC 與短鏈脫氫還原酶BisF 的作用下生成終產(chǎn)物biscognienyne B。為了能夠檢測到BisⅠ催化炔基形成過程中可能存在的中間體，闡明異戊烯鏈中炔基的形成機制，作者通過化學(xué)方法制備了甲基化的底物26，并將其喂養(yǎng)至單獨表達(dá)BisⅠ的米曲霉轉(zhuǎn)染菌株中。最后，作者從培養(yǎng)體系中分離獲得了脫氫產(chǎn)物27 與羥化產(chǎn)物28［圖12（a）］，提示BisⅠ可能先催化異戊烯鏈發(fā)生脫氫反應(yīng)生成具有（E）-1，3-diene結(jié)構(gòu)的中間體，然后繼續(xù)催化反式雙鍵脫氫形成炔基。但是，通過體外反應(yīng)以及喂養(yǎng)實驗，作者發(fā)現(xiàn)BisⅠ無法將反式雙鍵轉(zhuǎn)化成炔基。同一時間，Chen 等［88］從Aspergillussp. PSU-RSPG185 中找到了asperpentyn 的生物合成基因簇，包含有UbiA 型異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因atyB，P450 氧化酶基因atyI，氧化脫羧酶基因atyG，核黃素依賴的氧化還原酶基因atyA，含有cupin 結(jié)構(gòu)域的氧化酶基因atyE，短鏈脫氫還原酶基因atyC，乙醛還原酶基因atyD等，并推測了asperpentyn 的生物合成途徑（圖11）。通過在釀酒酵母中異源表達(dá)，作者證實P450 氧化酶AtyⅠ確實負(fù)責(zé)asperpentyn 中炔基的形成（圖11）。隨后，作者合成了一系列的底物類似物，并喂養(yǎng)到單獨表達(dá)AtyⅠ的釀酒酵母菌株中。喂養(yǎng)結(jié)果顯示AtyⅠ同樣無法作用于反式雙鍵，但是可以將化合物29 中的順式雙鍵脫氫轉(zhuǎn)化成炔基，從而生成30［圖12（b）］。綜上所述，P450 氧化酶BisⅠ與 AtyⅠ能夠以 4-hydroxy-3-prenylbenzoic acid為底物催化羥化反應(yīng)與脫氫反應(yīng)，生成羥基化產(chǎn)物31，以及具有（E）-1，3-diene或（Z）-1，3-diene結(jié)構(gòu)的脫氫產(chǎn)物32 與33，然后再將（Z）-1，3-diene 結(jié)構(gòu)中的順式雙鍵轉(zhuǎn)化成炔基（圖13）。由此可見，P450酶催化的異戊烯鏈內(nèi)部炔鍵的形成機制與去飽和酶催化的脂肪酸鏈內(nèi)部炔鍵的形成機制類似，均是通過脫去順式雙鍵上的兩個氫而形成的，我們推測這是由于底物在酶口袋中無法自由轉(zhuǎn)動，因此酶的金屬中心只能拔去雙鍵同側(cè)的兩個氫。此外，Lü等［87］發(fā)現(xiàn)BisⅠ對底物中異戊烯鏈的長度沒有嚴(yán)格的要求，可識別連有C5或C15異戊烯鏈的底物。

圖11 炔類雜萜biscognienyne B與asperpentyn的生物合成途徑Fig.11 Routes for the biosynthesis of acetylenic meroterpenoids biscognienyne B and asperpentyn

圖12 BisⅠ與AtyⅠ功能研究Fig.12 Functional analysis of BisⅠand AtyⅠ

圖13 BisⅠ或AtyⅠ催化的炔類雜萜中炔基的生物合成機制Fig.13 Mechanism of alkyne biosynthesis in acetylenic meroterpenoids catalyzed by BisⅠor AtyⅠ

2 非天然炔類化合物的從頭生物合成

炔類天然產(chǎn)物的生物合成研究為從頭生物合成非天然的炔類化合物提供了必要的酶工具，而且部分炔基合成酶已被用于非天然炔類化合物的構(gòu)建。

2.1 非天然炔類聚酮的從頭生物合成

Zhu等［73］發(fā)現(xiàn)jamABC三個基因可以將5-己烯酸轉(zhuǎn)化成5-hexynoyl-JamC（圖8），然后作為起始單元被聚酮合酶與非核糖體肽合成酶利用生成jamaicamide B。為了考察jamABC是否可以用于構(gòu)建含有末端炔基的非天然聚酮化合物，作者將jamABC與Huperzia serrate來源的可以識別不同起始單元的Ⅲ型聚酮合酶基因hspks1［89］一同導(dǎo)入到大腸桿菌Escherichia coliBAP1。由于沒有向大腸桿菌中導(dǎo)入5-己烯酸的合成元件，作者在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了5-己烯酸，以期jamABC與hspks1可以利用培養(yǎng)基中的5-己烯酸以及大腸桿菌提供的其他原料合成炔基標(biāo)記的聚酮化合物。經(jīng)過兩天的培養(yǎng)，作者從培養(yǎng)液中檢測到了聚酮化合物34（圖14），首次實現(xiàn)了非天然炔類化合物的從頭生物合成。

Zhu 等［73］和 Porterfield 等［90］還研究了jamABC與Ⅰ型聚酮合酶基因的組合?？姑顾厥且活愐跃旁p內(nèi)酯結(jié)構(gòu)為核心的聚酮-非核糖體肽雜合體，具有多種重要的生物活性［91-92］。前期，研究人員主要通過向培養(yǎng)體系中添加含有炔基的底物來獲得炔鍵標(biāo)記的抗霉素［29-30］。考慮到抗霉素生物合成途徑中的巴豆酰輔酶A 羧化酶/還原酶AntE 以及聚酮合酶AntD 具有寬泛的底物特異性［29］，可以引入不同的延伸單元，Zhu 等［73］將antD、antE以及剩余4 個負(fù)責(zé)抗霉素核心結(jié)構(gòu)生物合成的基因（非核糖體肽合成酶基因antC，?；o酶A 連接酶基因antF，酰基載體蛋白基因antG，還原酶基因antM）與jamABC一并導(dǎo)入到E. coliBAP1 中。同樣地，由于宿主菌株不含有5-已烯酸與鄰氨基苯甲酸的合成元件，作者就在培養(yǎng)基中添加了5-已烯酸與鄰氨基苯甲酸，結(jié)果顯示AntCDEFGM 與JamABC確實可以利用上述原料以及大腸桿菌提供的其他原料合成抗霉素35（圖14）。

圖14 非天然炔類聚酮的從頭生物合成Fig.14 De novo biosynthesis of non-natural acetylenic polyketides

LipPKS1 是脂霉素生物合成的第1 個模塊，由6 個結(jié)構(gòu)域組成，包括負(fù)責(zé)裝載起始單元的?；D(zhuǎn)移酶（AT）結(jié)構(gòu)域與ACP 結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)裝載延伸單元的AT 結(jié)構(gòu)域，酮基還原酶（KR）結(jié)構(gòu)域與ACP結(jié)構(gòu)域，以及負(fù)責(zé)將起始單元與延伸單元縮合的酮基合酶（KS）結(jié)構(gòu)域［93］。為了將LipPKS1與jamABC進(jìn)行組合，研究人員移除了LipPKS1 中負(fù)責(zé)識別與連接起始單元的AT與ACP結(jié)構(gòu)域［90］，并將負(fù)責(zé)以甲基丙二酸單酰輔酶A 作為延伸單元的AT結(jié)構(gòu)域換成可以識別丙二酸單酰輔酶A 的AT結(jié)構(gòu)域，最后在模塊的末端增加一個硫酯酶（TE）結(jié)構(gòu)域［94］。Porterfield 等［90］通過體外酶催化反應(yīng)發(fā)現(xiàn) JamABC 與改造后的 LipPKS1（LipPKS1*）組合后可生成 3-hydroxy-7-octynoic acid（36）（圖 14）。

上述研究初步證明負(fù)責(zé)炔基合成的三基因表達(dá)盒jamABC可以與具有寬泛底物特異性的聚酮合酶基因組合從而合成炔類聚酮化合物?；诖耍瑸榱藢崿F(xiàn)炔類聚酮化合物的高效從頭生物合成，將jamABC與其他所需的聚酮化合物合成元件一起導(dǎo)入到特定的底盤菌株后，一方面可以對三基因合成元件jamABC進(jìn)行優(yōu)化［90，95］，另一方面也可對底盤細(xì)胞與目標(biāo)化合物合成途徑的適配性進(jìn)行優(yōu)化［96］。

2.2 非天然炔類蛋白質(zhì)的從頭生物合成

蛋白質(zhì)中引入連有活潑基團(tuán)的非蛋白氨基酸在理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、控制與觀察蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位等方面有重要的應(yīng)用［97］。早期，人們通過對蛋白質(zhì)中的半胱氨酸、賴氨酸等進(jìn)行化學(xué)修飾來實現(xiàn)非蛋白氨基酸的引入［98］，但是該策略通常只適用于體外分離純化獲得的蛋白，無法用于體內(nèi)蛋白的修飾［99］。因此，研究人員開發(fā)了基因密碼子拓展技術(shù)，該技術(shù)主要是通過對氨酰-tRNA 合 成酶 （aminoacyl-tRNA synthetase）的改造來獲得可以識別非蛋白氨基酸的氨酰-tRNA，然后在蛋白質(zhì)合成過程中，新的氨酰-tRNA 可以將非蛋白氨基酸運輸?shù)教囟ǖ拿艽a子位點［100］。利用該技術(shù)，研究人員已在大腸桿菌、酵母菌以及哺乳動物細(xì)胞中實現(xiàn)了連有非蛋白氨基酸的蛋白質(zhì)的合成［101］。但是，由于此前一直未闡明含有炔基的氨基酸的生物合成途徑，研究人員采取直接向培養(yǎng)體系中添加炔類氨基酸來制備炔基標(biāo)記的蛋白質(zhì)［97，102］。Marchand 等［79］在闡明了炔類氨基酸βes 的生物合成途徑的基礎(chǔ)上，將負(fù)責(zé)中間體Pra 合成的besBCD三個基因，以及經(jīng)改造的氨酰-tRNA合成酶基因?qū)氲酱竽c桿菌，即將炔類氨基酸合成模塊與新的翻譯工具合成模塊同時導(dǎo)入到大腸桿菌，以期在不添加炔類氨基酸的情況下利用重組大腸桿菌合成炔基標(biāo)記的蛋白質(zhì)。培養(yǎng)兩天后，作者將菌株的蛋白粗提物與TAMRA-azide 熒光染料進(jìn)行點擊化學(xué)反應(yīng)，然后通過SDS-PAGE 對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析并用熒光觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pra 確實參與了蛋白質(zhì)的合成。未來可以對炔類氨基酸合成模塊besBCD進(jìn)行改造優(yōu)化，拓寬其底物寬泛性，以期獲得更多不同的炔類氨基酸，然后利用基因密碼子拓展技術(shù)合成含有不同炔類氨基酸的蛋白質(zhì)，為人類在醫(yī)藥、健康等領(lǐng)域的發(fā)展提供新的原料。

3 總結(jié)與展望

炔基不僅是許多臨床藥物與活性天然產(chǎn)物的關(guān)鍵功能基因，同時也是在化學(xué)反應(yīng)中被廣泛使用的重要結(jié)構(gòu)單元。但是，目前所采用的基于化學(xué)合成或底物喂養(yǎng)的炔類化合物合成策略均存在一定的局限性，限制了炔基在藥物化學(xué)、有機合成以及化學(xué)生物學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用。在合成生物學(xué)技術(shù)的推動下，從頭生物合成被認(rèn)為是一種可以彌補傳統(tǒng)策略的不足，具有廣闊應(yīng)用前景的新的炔類化合物制備技術(shù)，其核心要素是需明確天然產(chǎn)物中炔基的形成機制。因此，研究人員開展了一系列炔類天然產(chǎn)物的生物合成研究，以期獲得多樣的炔基合成酶，為從頭生物合成炔類化合物提供酶工具。經(jīng)過20 多年的努力，人們已從自然界中發(fā)現(xiàn)了4種針對不同類型天然產(chǎn)物的炔基形成方式，包括：①在脂肪酸中，乙炔酶催化碳碳雙鍵脫氫形成炔基；②在聚酮-非核糖體肽雜合體中，連接酶先將一條帶有末端雙鍵的脂肪酸鏈與?；d體蛋白結(jié)合，隨后乙炔酶將其末端雙鍵脫氫轉(zhuǎn)化成炔基，最后作為起始單元引入到聚酮-非核糖體肽合成體中；③在氨基酸中，鹵化酶先催化鹵化反應(yīng)使氨基酸的側(cè)鏈連接一個鹵原子，然后氧化酶使氨基酸的側(cè)鏈發(fā)生斷裂生成末端雙鍵，最后裂解酶脫去氨基酸側(cè)鏈的鹵原子從而形成末端炔基；④在雜萜中，P450 氧化酶連續(xù)兩次催化異戊烯鏈發(fā)生脫氫反應(yīng)生成炔基。在此基礎(chǔ)上，研究人員利用部分炔基合成酶實現(xiàn)了非天然炔類聚酮化合物以及炔基標(biāo)記蛋白質(zhì)的從頭生物合成。然而，為了更好地滿足不同炔類化合物的從頭生物合成的需求，研究人員仍需加強多方面的研究工作。

首先，自然界中存在多種結(jié)構(gòu)類型的炔類天然產(chǎn)物，目前僅找到了4種不同的負(fù)責(zé)炔基合成的基因元件，仍有一些炔類天然產(chǎn)物的炔基形成機制未被闡明，如烯二炔類抗生素核心骨架中的兩個炔基以及histrionicotoxin 類生物堿中的炔基等，因此有必要繼續(xù)開展其他炔類天然產(chǎn)物的生物合成研究，為炔類化合物的生物制造提供種類豐富的酶工具。其次，天然來源的炔基合成酶的底物特異性通常比較嚴(yán)格，無法用于制備結(jié)構(gòu)多樣的炔類化合物，因此有必要積極開展炔基合成酶的蛋白晶體結(jié)構(gòu)研究，為拓展其底物特異性提供理論基礎(chǔ)。除此之外，炔基合成酶在異源宿主或體外的催化效率問題同樣值得關(guān)注。盡管上述研究工作仍存在不小的挑戰(zhàn)，但是隨著基因測序技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)、基因編輯技術(shù)、蛋白晶體學(xué)技術(shù)等的不斷發(fā)展，這些瓶頸問題終將會被解決，從頭生物合成策略也有望在未來可以廣泛地用于炔類化合物的制造，從而與傳統(tǒng)的化學(xué)合成以及底物喂養(yǎng)策略相互補充，推動炔基在各領(lǐng)域的應(yīng)用。