林芝，胡致偉，瞿旭東，林雙君

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，微生物代謝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，教育部代謝與發(fā)育科學(xué)國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，上海200240）

植物次生代謝產(chǎn)物種類豐富，廣泛參與植物生長、發(fā)育、防御等生理活動，是天然藥物以及先導(dǎo)物的重要來源［1-6］。許多植物次生代謝產(chǎn)物含有多個手性中心，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，雖然大部分可以通過化學(xué)全合成手段獲得，但可以有效放大的并不多，多數(shù)仍依賴于從植物中分離提取。然而，植物生長周期長，組分復(fù)雜，從中提取往往面臨著效率低、耗時長、成本高等問題，有些含量低的次生代謝產(chǎn)物更是難以獲取，極大地制約了新型藥物的研發(fā)。相較于植物，微生物生長周期短、遺傳操作簡單、易于培養(yǎng)，可結(jié)合代謝工程有效地富集目標(biāo)分子，因此，通過在微生物宿主中重構(gòu)植物代謝途徑，以期形成經(jīng)濟(jì)、高效的植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的替代途徑，成為合成生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。近年來，植物代謝途徑研究、酶工程以及生物技術(shù)的發(fā)展，促使植物次生代謝產(chǎn)物的微生物合成研究取得了多個突破性進(jìn)展，最具代表性的例子就是通過釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）生產(chǎn)抗瘧藥青蒿素的前體青蒿酸（artemisinin）［4］，已進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)階段，見證了微生物合成生產(chǎn)途徑的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

芐基異喹啉類生物堿（benzylisoquinoline alkaloid，BⅠA）是一類具有重要研究和藥用價值的次生代謝產(chǎn)物，廣泛分布于罌粟科、木蘭科、蕓香科、小檗科等植物，已被發(fā)現(xiàn)2500 多種。該類生物堿具有抗癌、鎮(zhèn)痛、止咳、降壓、抗菌、抗炎、免疫抑制等多種生理活性［7-12］，目前成功應(yīng)用于臨床的就有鎮(zhèn)痛藥嗎啡（morphine）和可待因（codeine），止咳藥海罌粟堿（glaucine）、諾司卡品（noscapine），肌肉松弛劑罌粟堿（papaverine）以及用于帕金森病治療的阿撲嗎啡（apomorphine）等［6］。工業(yè)上生產(chǎn)BⅠA 主要依賴于從植物中直接提取或提取前體，經(jīng)簡單的化學(xué)半合成獲得。其中，最為人熟知的BⅠA植物供體就是罌粟（Opium poppy），已經(jīng)被人們廣泛種植，用于提供嗎啡、可待因和阿撲嗎啡前體等。除此之外，大部分含有BⅠA 的植物屬于野生資源，難以大規(guī)模種植，采集困難，受環(huán)境影響大。因此，研究人員致力于對BⅠA 的生物合成途徑進(jìn)行解析，在此基礎(chǔ)上通過模擬植物中BⅠA 的合成途徑在微生物里重構(gòu)該類生物堿的合成途徑，以期獲得高效的BⅠA 生產(chǎn)途徑和更多的活性衍生物。到目前為止，研究者們已經(jīng)打通了多種BⅠA 的微生物合成途徑，包括蒂巴因（thebaine）、木蘭花堿（magnofluorine）等，為通過微生物工業(yè)化生產(chǎn)BⅠA 提供了基礎(chǔ)。然而，由于多數(shù)BⅠA 結(jié)構(gòu)復(fù)雜，代謝途徑冗長，涉及到的催化酶對主代謝流途徑上的BⅠA 中間體具有寬泛的選擇性，導(dǎo)致代謝流不可控、目的化合物產(chǎn)量低等問題。本文對BⅠA 的微生物合成途徑以及突破性成果進(jìn)行總結(jié)，并結(jié)合相關(guān)酶體外催化特性的研究進(jìn)展，指出在酶催化元件的選取和改進(jìn)方面需要關(guān)注的問題和解決方案，希望能為后續(xù)推進(jìn)BⅠA 微生物合成途徑的工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 BIA的結(jié)構(gòu)類型及生物合成途徑概述

根據(jù)基本骨架類型，BⅠA 可大致分為7 類（圖1）：芐基異喹啉類（benzylisoquinoline）、雙芐基異喹啉類（bisbenzylisoqunolines）、阿樸啡和異阿樸啡類（aporphines）、嗎啡烷類（morphinane）、原小檗堿和小檗堿類（protoberberine）、普 羅 托 品 類 （protopine）、 苯 并 菲 啶 類（benzophenanthridines）［13-14］。BⅠA 雖然結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，但是其生物合成途徑的起始步驟卻十分相似，大多是由酪氨酸的代謝產(chǎn)物多巴胺（dopamine）和4-羥基-苯乙醛（4-hydroxyphenyl acetaldehyde，4-HPAA）在去甲烏藥堿合酶（NCS）的作用下，通過Pictet-Spengler反應(yīng)先形成S-去甲烏藥堿［（S）-norcoclaurine］，隨后經(jīng)過3 個甲基轉(zhuǎn)移酶（6OMT，CNMT，4'OMT） 和 1 個 細(xì) 胞 色 素 P450 氧 化 還 原 酶（NMCH）的作用形成關(guān)鍵的中間體S-牛心果堿［（S）-reticuline］。以上步驟可統(tǒng)稱為上游共性化合成途徑（圖1）［15-17］。

圖1 BⅠA的骨架類型及其生物合成途徑Fig.1 Skeletons of BⅠAs and the proposed pathways for their biosynthesis

S-牛心果堿通過異構(gòu)、偶聯(lián)、重排、甲基化、去甲基化等反應(yīng)，幾乎可以形成所有骨架類型的BⅠA，如S-牛心果堿通過小檗堿橋酶（BBE）作用可形成S-金黃紫堇堿［（S）-scoulerine］［18］，是原小檗堿類和小檗堿類、芐基異喹啉類、苯并菲啶類等BⅠA 生物堿的共同中間體，可在甲基轉(zhuǎn)移酶（SOMT1）、P450 酶CAS 和黃素依賴的氧化酶（STOX）的催化下生成小檗堿（berberine）［19-20］，或通過6 步酶反應(yīng)形成血根堿（sanguinarine）。異構(gòu)酶REPⅠ則可催化S-牛心果堿形成R-牛心果堿，后者是嗎啡烷類生物堿的共同中間體［21-23］，可在P450 酶SalSyn 作用下偶聯(lián)形成嗎啡烷的基本骨架［24］；S-牛心果堿也可以通過 P450 酶 CTS 作用形成阿樸啡類生物堿［25］。雖然BⅠA 結(jié)構(gòu)多樣，但是每一個大類特征骨架的形成途徑相同，骨架上的取代修飾類型也很少，主要包括羥基、甲基、甲氧基和亞甲二氧基等，對應(yīng)的修飾酶的類型也十分相似，比如負(fù)責(zé)骨架6 位和7位羥基的甲基化都是由S-腺苷-L-甲硫氨酸［（S）-adenosyl-L-methionine，SAM］依賴的甲基化酶，負(fù)責(zé)6、7 位和3'、4'位亞甲基二氧基形成的都是P450 酶。后修飾酶性質(zhì)以及底物的相似性，導(dǎo)致在微生物里重構(gòu)植物中BⅠA 的天然合成途徑時，常常發(fā)生交叉反應(yīng)和代謝旁流。掌握BⅠA 生物合成途徑中酶的催化特性，從而有目的地改進(jìn)，將是在微生物中實(shí)現(xiàn)BⅠA 高效合成途徑的關(guān)鍵點(diǎn)之一。

2 微生物合成BIA 及相關(guān)酶的體外催化特性研究進(jìn)展

鑒于S-牛心果堿在BⅠA生物合成途徑的重要性以及結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，微生物合成BⅠA常常以S-牛心果堿的滴度作為上游合成途徑效率的評估點(diǎn)。本綜述中，作者將對S-牛心果堿的微生物合成途徑進(jìn)行單獨(dú)的總結(jié)，在此基礎(chǔ)上，延伸出對下游各個骨架類型的微生物合成途徑研究進(jìn)展的介紹。同時，我們將總結(jié)途徑中關(guān)鍵酶的體外催化特性以及對代謝流的影響，為后續(xù)BⅠA 的微生物合成途徑的優(yōu)化提供參考。目前，BⅠA異源合成常用的微生物宿主為大腸桿菌（Escherichia coli）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），以下主要介紹這兩類微生物宿主生產(chǎn)BⅠA的研究進(jìn)展。

2.1 S-牛心果堿

S-牛心果堿在植物中的生物合成途徑起始于多巴胺和4-羥基苯乙醛（4-HPAA），兩個底物在NCS 的作用下，通過Pictet-Spengler 反應(yīng)形成S-去甲烏藥堿，隨后經(jīng)6OMT 催化6位羥基甲基化形成S-烏 藥 堿 ［（S）-coclaurine］， 再 經(jīng) CNMT 催 化氮上甲基化形成S型N-甲基烏藥堿［（S）-N-methylcoclaurine］，最后經(jīng)NMCH和4'OMT依次催化4'位發(fā)生羥化和羥基的甲基化形成S-牛心果堿（圖1）。由于細(xì)胞色素P450 酶NMCH 是膜蛋白，在大腸桿菌中表達(dá)難度大，是最初采用大腸桿菌合成牛心果堿的主要瓶頸。為了克服該瓶頸，2008 年，Minami 和Sato 等通過在大腸桿菌中引入多巴胺的單胺氧化酶（MAO）來替代NMCH，串聯(lián)NCS、6OMT、CNMT 和 4'OMT 的編碼基因，以多巴胺為前體，成功通過大腸桿菌合成了外消旋的牛心果堿（2 mg/L，1.3%）（圖2）［26］。隨后，上述團(tuán)隊(duì)通過提高體系中NCS 的表達(dá)水平以及穩(wěn)定中間體，將牛心果堿的產(chǎn)量和產(chǎn)率分別提升至54 mg/L 和13%［27］；同時，成功通過提高大腸桿菌中酪氨酸的產(chǎn)量，完成從簡單的甘油前體到S-牛心果堿的合成，產(chǎn)量約為46 mg/L［28-30］。

通過釀酒酵母合成牛心果堿也是在2008 年首次實(shí)現(xiàn)，由于當(dāng)時還不能在釀酒酵母中表達(dá)出有活 性 的 NCS［31］， 因 此 ， Hawkins 和 Smolke 等 直接以外消旋的全去甲勞丹堿（norlaudanosoline）為前體，通過將6OMT、CNMT 和4'OMT 的編碼基因?qū)脶劸平湍?，獲得了外消旋的牛心果堿（150 mg/L，10%），繞開了NCS 和NMCH 負(fù)責(zé)的兩步催化［32-33］。除了NCS 的低活性，在酵母中從頭合成牛心果堿還主要受限于L-酪氨酸3位無法羥化，導(dǎo)致多巴胺合成受阻（圖2，紫色部分）。雖然在動物和植物里發(fā)現(xiàn)了酪氨酸3 位單加氧酶（tyrosine 3-monooxygenase；EC 1.14.16.2）可以催化L-酪氨酸3位發(fā)生羥化，但該反應(yīng)需要輔因子四氫生物蝶呤（tetrahydrobiopterin）的參與，而酵母不能合成該輔因子［34］。另一個可催化L-酪氨酸3 位發(fā)生羥化的酶為酪氨酸酶（tyrosinase；EC 1.14.18.1），已經(jīng)成功用于大腸桿菌合成牛心果堿，然而，該酪氨酸酶會催化L-3，4-二羥基-苯丙氨酸（L-3，4-dihydroxyphenylalanine，L-DOPA）進(jìn)一步氧化生成大量的副產(chǎn)物黑色素（melanin），且不能在酵母中表達(dá)出活性蛋白［28，35-36］。上述瓶頸的突破是在2015 年，由兩個團(tuán)隊(duì)分別采用了兩種策略完成。其中，Dueber 和Martin 團(tuán)隊(duì)從甜菜（Beta vulgaris）中篩選到了一個可以在酵母中發(fā)揮活性的酪氨酸羥化酶，該酶野生型不需要四氫生物蝶呤輔因子，但會繼續(xù)氧化L-DOPA 形成L-多巴醌（L-dopaquinone），導(dǎo)致副產(chǎn)物黑色素的形成。對此，該團(tuán)隊(duì)巧妙地利用了一個可以將L-DOPA轉(zhuǎn)化成黃色熒光色素甜菜黃素（betaxanthin）的生物傳感器，加快了隨機(jī)突變優(yōu)化的篩選速度，獲得了L-DOPA氧化活性受到抑制的酪氨酸羥化酶突變體，將 L-DOPA 的產(chǎn)量提高了 2.8 倍［37］。而 Smolke團(tuán)隊(duì)則通過在酵母中表達(dá)褐家鼠（Rattus norvegicus）來源的酪氨酸合酶三突變體TyrHR37E/R38E/W166Y——突變后可減少L-酪氨酸和兒茶酚胺類化合物對酶的抑制，并在酵母中重構(gòu)褐家鼠中四氫生物蝶呤的合成途徑來完成L-酪氨酸3 位的羥化；同時，該團(tuán)隊(duì)也對初級代謝產(chǎn)物磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate， PEP） 和 赤 蘚 糖 -4-磷 酸（erythrose-4-phosphate，E4P）到4-羥基-苯丙酮酸（4-hydroxy-phenylpyruvate，4-HPP）轉(zhuǎn)化路徑上的四個相關(guān)酶進(jìn)行過表達(dá)和突變優(yōu)化，提高了L-酪氨酸和 4-HPAA 的產(chǎn)量［21］。在此基礎(chǔ)上，上述兩個團(tuán)隊(duì)均將各自建立的L-DOPA 酵母合成途徑，串聯(lián)了L-DOPA 脫羧酶、NCS、6OMT、CNMT、NMCH 和4'OMT 的編碼基因，在酵母中實(shí)現(xiàn)了從葡萄糖到S-牛心果堿的合成。雖然每升產(chǎn)量都在微克級別，與達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)水平差距甚大，但在實(shí)驗(yàn)水平上證實(shí)了酵母從頭合成牛心果堿的可行性，對后續(xù)研究起到了極大的推動作用。

圖2 S-牛心果堿的微生物合成途徑總結(jié)及代謝流示意圖Fig.2 Pathway for the microbial synthesis of benzylisoquinoline alkaloids

2020 年，Martin 團(tuán)隊(duì)在前期研究基礎(chǔ)上，繼續(xù)對酵母中莽草酸途徑（shikimate pathway）、埃利希途徑（Ehrlich pathway）和L-酪氨酸的代謝途徑進(jìn)行了連續(xù)20 多次的迭代優(yōu)化，包括過表達(dá)莽草酸途徑上分支酸合酶、預(yù)苯酸脫氫酶、苯丙酮酸脫羧酶和敲除旁支產(chǎn)物L(fēng)-苯丙氨酸和L-色氨酸合成相關(guān)的預(yù)苯酸脫水酶、吲哚-3-甘油磷酸合酶來積累4-HPP；對埃利希途徑上7 個相關(guān)的還原酶和氧化酶的編碼基因進(jìn)行敲除，從而阻止4-HPAA被還原和氧化等，結(jié)合酶突變抑制反饋調(diào)節(jié)以及發(fā)酵工藝的優(yōu)化，將通過酵母從頭合成S-牛心果堿的產(chǎn)量提高了57 000 倍，提升至4.6 g/L［38］。該研究成果標(biāo)志著微生物合成S-牛心果堿已經(jīng)達(dá)到了工業(yè)化生產(chǎn)水平，體現(xiàn)了微生物體系生產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物的巨大潛力。

除去初級代謝相關(guān)途徑，目前微生物合成S-牛心果堿途徑中所涉及到的酶包括NCS、6OMT、CNMT、NMCT 和4'OMT 等，主要來源于罌粟（Papaver somniferum）、 花 菱 草 （Eschscholzia californica）、日本黃連（Coptis japonica）、黃唐松草（Thalictrum flavum）和南天竹（Nandina domestica）等植物。體外酶活測試研究表明野生型的NCS 催化活性低，立體選擇性受底物自發(fā)反應(yīng)影響，可能是 BⅠA 合成途徑中的限速步驟［31］；對 NCS 的氮端進(jìn)行截短可以有效提高其在微生物體內(nèi)的活性［39-41］。NCS 采用的酶催化機(jī)理是先結(jié)合多巴胺，再結(jié)合4-HPAA。其中，多巴胺結(jié)構(gòu)基本包含在酶活性口袋中，導(dǎo)致NCS 對胺類底物的識別性較窄；4-HPAA 大部分結(jié)構(gòu)在活性口袋之外，導(dǎo)致NCS對醛類底物的識別性十分寬泛［31-42］。比如C.japonica來源的CjNCS 可以識別苯乙醛類、3-吲哚乙醛類、烷基醛類等底物類似物［38，42-45］；T. flavum來源的TfNCS 除了能識別醛類底物類似物外，還可以識別惰性更強(qiáng)的酮類底物類似物，包括環(huán)酮、苯基酮以及烷基酮等［44-51］。這兩類 NCS 也是構(gòu)筑 BⅠA微生物合成途徑的常用酶，根據(jù)其對醛和酮類底物的雜泛性，預(yù)示著控制微生物體內(nèi)相關(guān)類似物的合成，可能有助于提高BⅠAs 的產(chǎn)量。值得一提的是，近期有報道稱NCS 對酵母具有一定的毒性［52］，因此加大對該酶優(yōu)化和挖掘的研究力度，可能是提高牛心果堿微生物合成產(chǎn)量的關(guān)鍵之一。

6OMT、4'OMT 和 CNMT 分別負(fù)責(zé) BⅠA 骨架6 位羥基、4'位羥基和氮原子上的甲基化，均屬于SAM 依賴的甲基化酶。自然界中，賦予BⅠA 結(jié)構(gòu)多樣性的除了基本骨架的重排、偶聯(lián)導(dǎo)致骨架類型的不同之外，很大程度還依賴于甲基化酶雜泛性和專一性的隨機(jī)交叉作用，比如全去甲勞丹堿，在上述三個簡單的甲基化酶的作用下，就可能可以形成 20 多種不同的 BⅠA 結(jié)構(gòu)［53］，因此，對這些酶的底物雜泛性和區(qū)域選擇性進(jìn)行解析，選取選擇性高的酶元件，對于確保微生物合成BⅠA 代謝流的方向、減少旁支產(chǎn)物十分重要。到目前為止已報道了 10 個 6OMT，分別來自于 7 個種屬［54-63］；8 個 CNMT，分別來自 4 個種屬［26，56-57，59，64-66］；5 個4'OMT， 分 別 來 自 3 個 種 屬［54-56，59-60，66-67］。 多 數(shù)6OMT 和 4'OMT 對 3'、4'、6 或 7 位羥基存在交叉的區(qū)域選擇性（圖 3）［53］，其中，P. somniferum和T.flavum來源的6OMT和4'OMT區(qū)域選擇性較為專一，也是目前微生物合成牛心果堿最常用的甲基化酶元件。CNMT 雖然區(qū)域選擇性較好，但是具有寬泛的底物識別性，對于S型和R型芐基異喹啉類底物都能識別，且不能很好地控制氮上甲基化的數(shù)量［64-65］，在復(fù)雜BⅠA的微生物合成過程中，可能會導(dǎo)致多種氮上單甲基化和雙甲基化的旁支產(chǎn)物。NMCH為P450膜蛋白，難以在大腸桿菌中異源表達(dá)，因此以大腸桿菌作為宿主構(gòu)筑牛心果堿時常用MAO代替，但其可被用于酵母體系。對于NMCH，目前只報道了2個，分別來自E.californica（CYP80B1）和P. somniferum（CYP80B3），底物專一性都很強(qiáng)，只識別S型N-甲基烏藥堿，對于R型以及氮上未甲基化底物都不能識別［68-69］，這可能會使微生物合成牛心果堿途徑中其他酶元件所產(chǎn)生的旁支產(chǎn)物不能被NMCH 催化回到主代謝流，導(dǎo)致整體產(chǎn)率的下降。

圖3 代表性的6OMT和4'OMT對3'、4'、6以及7位羥基的交叉區(qū)域選擇性Fig.3 Cross-regioselectivity of 6OMT and 4'OMT to 3',4',6 and 7 hydroxyl groups

2.2 阿樸啡類

阿樸啡類生物堿含有特征性的聯(lián)苯型四環(huán)結(jié)構(gòu)骨架［圖4（a）］，廣泛分布于自然界，具有抗癌、抗病毒、抗瘧疾、抗炎等多種重要生理活性，目前已經(jīng)在20 個科100 多種屬植物中分離到了500 多個化合物［7-11，70］。阿樸啡結(jié)構(gòu)的多樣性很大程度依賴于骨架上多樣的甲基化、亞二甲基化、羥化取代方式以及骨架氧化程度的差異，該類生物堿大部分生物合成途徑?jīng)]有被闡明，這也是限制該類生物堿在微生物底盤細(xì)胞中合成的主要原因。2008 年，Sato 等在C. japonica中發(fā)現(xiàn)了一個P450 酶 CYP80G2 可以催化S-牛心果堿的 8 位和2'位發(fā)生偶聯(lián)完成聯(lián)苯型四環(huán)骨架的構(gòu)筑，形成S-紫堇塊莖堿（corytuberine）［25］，該酶底物專一性較強(qiáng)，對于R-牛心果堿和類似物大部分不能識別，與上游途徑中NMCH一起，可能會導(dǎo)致大量旁支產(chǎn)物不能回到主代謝流；S-紫堇塊莖堿可以在RNMT催化下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成木蘭花堿（magnoflorine）［71］?；诖税l(fā)現(xiàn)，該團(tuán)隊(duì)在建立了大腸桿菌牛心果堿合成途徑的基礎(chǔ)上，將CTS 和CNMT（可替代RNMT 行使氮上雙甲基化功能）的編碼基因轉(zhuǎn)入酵母，通過共培養(yǎng)的方式完成了紫堇塊莖堿和木蘭花堿（7.2 mg/L）的微生物合成，成為首例微生物體系成功合成阿樸啡類生物堿［圖4（b））［26］。由于該類生物堿生物合成途徑研究的欠缺，尤其是R型結(jié)構(gòu)和一些關(guān)鍵后修飾生物合成途徑的未知，導(dǎo)致目前只有紫堇塊莖堿和木蘭花堿得以在微生物體系中合成。

圖4 阿樸啡類生物堿的代表性骨架結(jié)構(gòu)（a）和微生物合成途徑（b）Fig.4 Skeletons of aporphines(a)and their microbial synthesis(b)

2.3 原小檗堿和小檗堿類以及苯并菲啶類

原小檗堿和小檗堿類以及苯并菲啶類屬于BⅠA七大骨架類型中的兩大類，具有抗微生物、降壓、鎮(zhèn)靜、抗白血病和抗腫瘤等多種生理活性［72］，大部分天然合成途徑仍然未知。目前成功通過微生物合成的主要為小檗堿（berberine，原小檗堿和小檗堿類）和血根堿（sanguinarine，苯并菲啶類），兩者的生物合成途徑均是先由S-牛心果堿在黃素氧化酶BBE 的作用下形成共同中間體S-金黃紫堇堿［（S）-Scoulerine］。該酶對底物識別范圍較窄，對R-牛心果堿以及大部分底物類似物都不能識別［73-74］，但會催化S-牛心果堿發(fā)生六電子氧化形成脫氫金黃紫堇堿（dehydroscouierine）［75］。隨后，S-金黃紫堇堿經(jīng)甲基化酶SOMT1、P450 酶CAS 和氧化還原酶STOX 作用可以形成小檗堿［76-79］；經(jīng)四個 P450 酶 CFS、SPS、MSH 和 P6H，一個甲基化酶TNMT 和一個氧化還原酶DBOX 的作用下可

以生成血根堿［77-78，80］。由于小檗堿和血根堿下游途徑中涉及到多個膜蛋白，包括BBE、多個P450酶等，因此常選用能表達(dá)膜蛋白的釀酒酵母體系作為異源合成的宿主。雖然在2008 年，通過將C.japonica中編碼BBE的基因?qū)脶劸平湍?，和產(chǎn)牛心果堿的大腸桿菌工程菌共培養(yǎng)，就已經(jīng)實(shí)現(xiàn)通過微生物將多巴胺轉(zhuǎn)化成S-金黃紫堇堿（8.3 mg/L，2.2%）［26］；也 可 以通過將P. somniferum來源 的BBE 編碼基因和T. flavum來源的 SOMT 和 CAS 的編碼基因依次導(dǎo)入產(chǎn)牛心果堿的釀酒酵母工程菌，以外消旋的全去甲勞丹堿為前體，依次獲得小檗堿合成途徑中的中間體四氫非洲防己胺［（S）-tetrahydrocolumbamine］（約60 mg/L）和四氫小檗堿 ［（S）-canadine］（約 30 mg/L，轉(zhuǎn)化率 1%～2%）［32］，后續(xù)研究報道四氫小檗堿可以自發(fā)形成小檗堿，但可能受限于當(dāng)時的檢測條件，并未報道有小檗堿的產(chǎn)生。直至2015 年，Smolke 等通過優(yōu)化后者代謝通路上CAS 的表達(dá)量，結(jié)合密碼子優(yōu)化、酶元件的篩選以及發(fā)酵條件的優(yōu)化，將四氫小檗堿產(chǎn)量提高了70 多倍，最終實(shí)現(xiàn)了小檗堿（39 μg/L）的微生物合成［81］。值得一提的是，該途徑會積累較多的中間代謝產(chǎn)物，導(dǎo)入或缺失Berberis wilsonae來源的STOX 編碼基因并不會對小檗堿的最終產(chǎn)量造成影響，表明該STOX可能并沒有在酵母中行使功能。在酵母中異源表達(dá)出活性更好的STOX，可能有助于提高小檗堿的產(chǎn)量。

對于血根堿的微生物合成，2014 年，Martin團(tuán)隊(duì)將血根堿生物合成途徑上6OMT、CNMT、4'OMT 以及 CFS、SPS、TNMT、MSH、P6H 的編碼基因?qū)脶劸平湍?，以外消旋的全去甲勞丹堿為前體，成功通過釀酒酵母合成了二氫血根堿（dihydrosanguinarine）及其氧化衍生物血根堿［33］（圖5）。該過程還產(chǎn)生了副產(chǎn)物N-甲基金黃紫堇堿（N-methylscoulerine）和N-甲基碎葉紫堇堿（N-methylcheilanthifoline），可能是TNMT 底物識別寬泛導(dǎo)致，因此該研究推測TNMT的底物寬泛性以及膜蛋白的表達(dá)活性可能是影響產(chǎn)量的主要原因。隔年，Smolke團(tuán)隊(duì)也基于相似的策略，通過對途徑上左旋華紫堇堿［（S）-cheilanthifoline］的產(chǎn)量進(jìn)行優(yōu)化，從而獲得了血根堿及代謝通路上的中間體，包括刺罌粟堿（stylopine，676 μg/L）、cis-N-甲基刺罌粟堿（cis-N-methylstylopine，548 μg/L）、原阿片堿（protopine，252 μg/L）和血根堿（80 μg/L）［82］。緊接著，Sato團(tuán)隊(duì)也通過將BBE、CFS和SPS的編碼基因?qū)脶劸平湍?，通過喂養(yǎng)外消旋的牛心果堿獲得了血根堿的前體刺罌粟堿［83］。然而到目前為止，還未能通過微生物體系建立起原小檗堿和小檗堿類以及苯并菲啶類BⅠA的從頭合成途徑。

圖5 小檗堿和血根堿的微生物合成途徑Fig.5 Microbial synthesis of berberine and sanguinarine

2.4 諾司卡品等芐基異喹啉類生物堿

芐基異喹啉類是BⅠA 七大骨架類型之一，其中最具代表性的就是諾司卡品（noscapine）。諾司卡品最初由法國化學(xué)家Robiquet 在1817 年從P.somniferum中分離鑒定，已長期作為止咳藥物應(yīng)用于臨床，生物安全性高，并在1998 年后陸續(xù)被報道具有抗腫瘤、抗癌等活性［84-89］。與小檗堿和血根堿相同，諾司卡品的生源途徑也經(jīng)由中間體S-金黃紫堇堿，隨后在S9OMT（SOMT1）、CAS作用下形成小檗堿的前體四氫小檗堿，所需的酶與小檗堿合成途徑相同；最后四氫小檗堿在TNMT、CYP82Y1、 CYP82X2、 AT1、 CYP82X1、 CXE1、SDR1 和N4'OMT 等8 個酶作用下形成諾司卡品［76，90-92］。 2016 年 ， Smolke 團(tuán) 隊(duì)［93］報 道 了N4'OMT 是由兩個基因編碼的異源二聚體酶（OMT2/OMT3），突破了在微生物體內(nèi)合成諾司卡品的最后一個瓶頸。通過在酵母中表達(dá)16 個諾司卡品生物合成的下游基因，以全去甲勞丹堿為前體，成功合成了諾斯卡品［（1.64±0.38）μmol/L］。催化四氫小檗堿到諾司卡品合成的多個酶均具有較為寬泛的底物選擇性，會產(chǎn)生多種旁支產(chǎn)物，然而也因?yàn)闆]有底物專一性酶的限制，所以大部分旁支產(chǎn)物最終都會重新匯聚到主代謝流，形成諾司卡品（圖6）。隨后在2018 年，Smolke 團(tuán)隊(duì)將來自植物、細(xì)菌和動物的30多個基因?qū)脶劸平湍钢?，其中包?個植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位酶基因；通過對異源途徑各個酶表達(dá)水平的協(xié)調(diào)，優(yōu)化發(fā)酵條件，成功通過酵母從頭合成了諾司卡品（約2.8 mg/L），將產(chǎn)量提高了18 000倍。對此優(yōu)化后的諾司卡品產(chǎn)生菌喂養(yǎng)鹵素取代的酪氨酸類似物，可以得到對應(yīng)鹵素取代的芐基異喹啉類生物堿，表明了微生物合成在創(chuàng)造多種新穎BⅠA衍生物的潛在應(yīng)用價值［40］。

圖6 諾司卡品的微生物合成途徑Fig.6 Microbial synthesis of noscapine

2.5 嗎啡烷類

嗎啡烷類生物堿是目前臨床上用于鎮(zhèn)痛的主要藥物之一，自1806 年嗎啡被分離到后，其生物合成途徑也逐漸被破解［94］，該類生物堿的基本骨架是由R-牛心果堿偶聯(lián)形成［6］。最初通過微生物合成嗎啡烷類生物堿的主要瓶頸在于R-牛心果堿的生物合成途徑未知，只能以一些R型或外消旋的中間體為前體，通過微生物轉(zhuǎn)化而得，比如將P. somniferum來源的T6ODM、COR、CODM 編碼基因?qū)脶劸平湍?，以蒂巴因（thebaine）為喂養(yǎng)前體，獲得一系列嗎啡烷類產(chǎn)物［95-96］。直到2015 年，嗎啡生物合成途徑中負(fù)責(zé)將S-牛心果堿轉(zhuǎn)化成R-牛心果堿的差向易構(gòu)酶（REPⅠ）被解析［22-23］，才使得通過微生物從頭合成嗎啡烷類生物堿得以實(shí)現(xiàn)（圖7）。REPⅠ是由N 端的細(xì)胞色素P450 結(jié)構(gòu)域和C 端的醛酮還原酶（aldo-keto reductase）結(jié)構(gòu)域融合而成，也被簡寫成STORR。Smolke 團(tuán)隊(duì)和其他兩個課題組共同報道了REPⅠ的發(fā)現(xiàn)。通過在酵母中導(dǎo)入來源于植物、動物、細(xì)菌以及酵母的21 條和23 條相關(guān)合成基因，Smolke 團(tuán)隊(duì)分別在酵母中實(shí)現(xiàn)了從糖到蒂巴因和氫可酮（hydrocodone）的合成。雖然產(chǎn)量上只有 7.8 μg/L 和 0.3 μg/L，距離工業(yè)應(yīng)用還需要大幅度的優(yōu)化，但該工作為嗎啡的微生物合成的可行性提供了有利的證據(jù)［21］。隔年，Minami團(tuán)隊(duì)以大腸桿菌為宿主，由于REPⅠ在大腸桿菌中表達(dá)活性不佳，該團(tuán)隊(duì)通過自發(fā)Pictet-Spengler反應(yīng)提供R-牛心果堿和四步階段發(fā)酵方式，從甘油合成了蒂巴因，是酵母合成體系產(chǎn)量的300倍；在此基礎(chǔ)上繼續(xù)引入T6ODM和MorB編碼基因，利用尼奧平酮（neopinone）到可待因酮（codeinone）的自發(fā)反應(yīng)，合成了氫可酮［97］。

圖7 嗎啡烷類生物堿的微生物合成途徑Fig.7 Microbial synthesis of morphinane

R-牛心果堿在 SalSyn、SalR 和 SalAT 的作用下形成蒂巴因的前體氫化沙羅泰里啶-7-O-乙酸（salutaridinol 7-O-acetate）［98-101］，該前體在前期研究中被認(rèn)為是自發(fā)轉(zhuǎn)化成蒂巴因，且受pH 的影響，在pH=8～9 時有利于轉(zhuǎn)化為蒂巴因，在pH=6～7時，會自發(fā)轉(zhuǎn)化成副產(chǎn)物［102］。直至2018年在罌粟中發(fā)現(xiàn)可以催化該步轉(zhuǎn)化發(fā)生的蒂巴因合酶THS，以全去甲勞丹堿為前體，在合成蒂巴因的酵母工程菌加入THS，蒂巴因產(chǎn)量是缺失THS的24倍，表明在植物體內(nèi)該步反應(yīng)是有酶參與的［103］。蒂巴因接著在T6ODM 作用下轉(zhuǎn)化成尼奧平酮［104］，可自發(fā)異構(gòu)形成可待因酮（codeinone），繼續(xù)在COR和CODM 的作用下依次形成可待因（codeine）和嗎啡（morphine）［105］。由于 COR 和 CODM 底物識別十分寬泛，因此在通過微生物合成嗎啡烷類生物堿時很難控制代謝流的方向，獲取單一組分，早期合成嗎啡烷類生物堿的酵母工程菌產(chǎn)生的生物堿超過50%是副產(chǎn)物［24，95，104-105］。近期，在罌粟中又發(fā)現(xiàn)一個異構(gòu)酶NⅠSO 可以催化尼奧平酮到可待因酮的轉(zhuǎn)化，在酵母工程菌中導(dǎo)入CODM、T6ODM、COR 和NⅠSO 編碼基因可以獲得7.6 μg/（L·OD）的可待因，產(chǎn)量是未導(dǎo)入NⅠSO 編碼基因的42 倍；繼續(xù)導(dǎo)入Pseudomonas putidaM10 來源的morB可獲得35μg/（L·OD）氫可酮（hydrocodone），是前期不加NⅠSO編碼基因的30倍，表明NⅠSO在植物體作用可能是加速尼奧平酮向可待因酮的轉(zhuǎn)換，促進(jìn)可待因和嗎啡等生物堿的積累，減少旁支產(chǎn)物的生成［95，106-107］。嗎啡烷類生物堿的微生物合成途徑的研究進(jìn)展，深刻體現(xiàn)了BⅠA植物次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑的解析對構(gòu)建微生物合成途徑的重要性。

3 挑戰(zhàn)與機(jī)遇

在過去十多年時間里，我們見證了芐基異喹啉類生物堿的微生物合成途徑從無到有、產(chǎn)量從低到高的發(fā)展歷程，每一步都離不開天然生物合成途徑的解析，每一個突破都伴隨著關(guān)鍵酶催化反應(yīng)及其機(jī)理的闡明。因此，大部分BⅠA 生物合成途徑認(rèn)知的缺失，如杷堿類（pavine）、枯拉靈類（cularine）以及骨架上的修飾途徑等（圖1），為未來發(fā)展BⅠA 的微生物合成途徑帶來了巨大挑戰(zhàn)。除此之外，BⅠA微生物合成途徑中酶活性低和底物選擇性差等導(dǎo)致的代謝流不可控、產(chǎn)率低等問題也是我們亟待解決的難題。所幸的是，基因測序技術(shù)和生物技術(shù)的發(fā)展大大加快了我們對天然產(chǎn)物生物合成途徑解析的速度，也為發(fā)展BⅠA的微生物合成途徑積累了越來越多可供篩選的酶學(xué)元件；與此同時，酶工程和晶體學(xué)的發(fā)展也極大地提高了酶催化性能的優(yōu)化效率。研究者們也開發(fā)了多種方案去解決酶底物選擇性差引起的代謝流不可控問題，包括適當(dāng)?shù)卣{(diào)整代謝流通量以及通過時間和空間的調(diào)整，阻止酶與有干擾的代謝中間體的接觸，從而減少副產(chǎn)物的生成等［14］。前者常用的調(diào)整方式有運(yùn)用不同強(qiáng)度的啟動子，控制基因的拷貝數(shù)等；后者則可通過將酶放在不同細(xì)胞器以及菌株中進(jìn)行表達(dá)從而有效地隔離酶與有干擾的代謝中間體，以及通過調(diào)控酶在不同時間點(diǎn)表達(dá)，率先積累某一目標(biāo)代謝中間體，再啟動后續(xù)途徑中酶的表達(dá)，從而促進(jìn)代謝中間體的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化，有效防止代謝旁流。此外，研究者們也采用選取底物識別寬泛的酶以及通過酶工程去拓展各個酶的底物識別能力，從而將旁支產(chǎn)物重新轉(zhuǎn)化至主代謝流上的化合物，提高微生物合成BⅠA的產(chǎn)量。

目前，微生物合成BⅠA 的途徑設(shè)計(jì)基本都是模擬其在植物體中的天然生物合成途徑，因此，代謝途徑冗長、酶元件的選擇也十分局限，且依賴于生物合成途徑的解析。由于植物遺傳操作不便，大多基因不成簇以及存在內(nèi)含子等因素，造成了植物生物合成途徑解析較為困難。隨著酶催化反應(yīng)知識的不斷增長和可獲得的基因序列的積累，研究者們對BⅠA 微生物合成途徑的設(shè)計(jì)不再僅局限于傳統(tǒng)上效仿自然的設(shè)計(jì)思路，逐漸開始創(chuàng)造全新的人工微生物合成途徑，如通過對亞胺還原酶進(jìn)行篩選和改造，獲得了可立體專一性地還原1-芐基二氫異喹啉類化合物形成1-芐基四氫異喹啉類化合物的亞胺還原酶庫，經(jīng)CNMT 催化可進(jìn)一步形成牛心果堿類似物，從而建立了一條便捷高效的牛心果堿類似物的微生物合成途徑［108-109］，可作為多種BⅠA 微生物合成的中間體，比如阿樸啡類生物堿、小檗堿等。這些全新的BⅠA 人工微生物合成途徑的設(shè)計(jì)，為發(fā)展該類生物堿的生產(chǎn)途徑提供了更加廣泛的啟示，也是突破和超越現(xiàn)有BⅠA 微生物合成途徑研究成果的機(jī)遇。