鄧英立，丁 燕,2，Nigel G J Richards，王寅鵬，肖 偉，朱靖博,2*

(1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 植物資源化學(xué)與應(yīng)用研究所,大連 116034；3.英國卡迪夫大學(xué) 化學(xué)院，卡迪夫 CF103AT；4.江蘇康緣股份藥業(yè)有限公司,連云港 222001)

天然除蟲菊酯是從除蟲菊(Chrysanthemum cinerariifolium)中提取出來的6種單萜酯類物質(zhì)的統(tǒng)稱，包括除蟲菊酯I (pyrethrin I)、瓜葉菊酯I (cinerin I)、茉酮菊酯I (jasmolin I)、除蟲菊酯 II (pyrethrin II)、瓜葉菊酯II (cinerin II)、茉酮菊酯II (jasmolin II) 6種有效成分[1-3](結(jié)構(gòu)通式如圖 1)。它具有低毒、低殘留、高效和不易產(chǎn)生抗藥性等特性[1,4]，其中除蟲菊酯I和II含量高且具有快速擊倒和致死害蟲效果，是除蟲菊農(nóng)藥制劑中的主要有效成分[5]。FAO和WHO對原藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)純度要求在90%以上[6]，但天然除蟲菊酯中各成分結(jié)構(gòu)相似、分子量相近使其分離制備困難[7]。

目前的分離方法都存在進樣少、溶劑損失大、只能實現(xiàn)毫克級制備的缺點[8-10]，如 D Wei[10]采用高效液相色譜制備出高純度化合物，但僅從1 mL 70%除蟲菊精油中得到單一成分1 mg；方忠瑩[11]借助高速逆流色譜制備得到除蟲菊素I (12 mg)和II (24 mg)、瓜葉菊素I (11 mg)和II (17 mg)、茉酮菊素I (9 mg)和II (13 mg)，純度90%以上。真空液相色譜具有裝置簡單、進樣量大、分離速度快的優(yōu)點，目前已廣泛用于萜類、木脂素和萜類等天然活性物質(zhì)的分離[12]，如朱靖博等采用 AUTO-VLC(石油醚：乙酸乙酯)富集了木脂素類組分且得到2個純度＞90%的化合物[13]；Pelletier[14]經(jīng) VLC分離純化得到了烏頭中二萜生物堿。除蟲菊酯屬于單萜酯類化合物，文章首次采用AUTO-VLC分離天然除蟲菊酯。

除蟲菊酯對溫度、光照、氧氣和 pH等環(huán)境因素敏感，暴露于環(huán)境中會很快失去活性，其最主要的降解方式是光化學(xué)降解[15]，除蟲菊酯分子含有三元環(huán)、雙鍵和酮基等結(jié)構(gòu)，見光不穩(wěn)定[16]，其吸收光能后共價鍵斷裂發(fā)生降解。Pan研究發(fā)現(xiàn)天然除蟲菊酯在田間的降解速度快于溫室條件下，證明光降解是其降解的重要途徑[3]。見光易降解特性使天然除蟲菊酯類農(nóng)藥商品化使用和質(zhì)量控制受到極大的限制[16]。而在農(nóng)藥制劑中添加光保護劑如木質(zhì)素[17]、BHA[18]和竹醋酸[19]等，可在一定程度上改善農(nóng)藥光不穩(wěn)定性。本文重點研究采用AUTO-VLC對天然除蟲菊酯目標(biāo)物制備分離；探討分離得到的餾分的光穩(wěn)定特性及光保護劑對其穩(wěn)定性的影響。研究旨在為天然除蟲菊酯農(nóng)藥大規(guī)模生產(chǎn)以及研制穩(wěn)定的除蟲菊酯制劑提供理論支持，加速植物源農(nóng)藥的發(fā)展進程。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

天然除蟲菊酯粗提物(總含量49%)及混合標(biāo)準(zhǔn)品(云南南寶生物科技有限責(zé)任公司)；二叔丁基對甲酚、焦性沒食子酸、3,4,5-三羥基苯甲酸、2-羥基-4-甲基二苯甲酮、木質(zhì)素磺酸鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；乙腈、甲醇、正己烷、乙酸乙酯(天津康科德科技有限公司)；高效液相色譜S6000(大連華譜新創(chuàng)新技術(shù)有限公司)；分體式照度計、紫外燈(深圳市聚茂源科技發(fā)展公司)；PC型紫外分光光度計(大連源博科學(xué)器材有限公司)；Bomexc C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、自動化真空液相色譜、制備型高效液相色譜(大連博邁科技發(fā)展有限公司)。

圖 1 除蟲菊酯提取物中 6 種除蟲菊酯的結(jié)構(gòu)[3]錯誤!未找到引用源。

1.2 色譜方法

1.2.1 HPLC分析方法

采用華譜S6000色譜系統(tǒng)對天然除蟲菊酯進行分析，分析柱選擇C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相由0.1%乙酸水溶液(A)和乙腈(B)組成；洗脫梯度為：0～10 min(48%～62% B)、10～40 min(62%～80%B)、40～50 min(80%～100% B)；流速為 1.0 mL/min；進樣量是10 μL；柱溫為30 °C；檢測波長230 nm。

1.2.2 TLC分析方法

選用3 cm×10 cm的薄層硅膠色譜板，用毛細管吸取天然除蟲菊酯溶液在薄層板基線中央點樣，溶液單向上行展開，展開劑：正己烷∶乙酸乙酯=9∶1(體積比)；顯色劑：濃硫酸香草醛；顯色后100 ℃烘干，計算斑點Rf值。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)對照圖譜的建立

精密稱取天然除蟲菊酯混合標(biāo)準(zhǔn)品和粗提物各5 mg，分別加入乙腈配置成1 mg/mL溶液，經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾，使用高效液相色譜測定混合標(biāo)準(zhǔn)品和除蟲菊酯浸膏，分析方法見1.2.1；使用薄層色譜法測定混合標(biāo)準(zhǔn)品(圖2-b)，分析方法見1.2.2。

1.4 天然除蟲菊酯化學(xué)成分制備分離

1.4.1 AUTO-VLC洗脫劑和洗脫條件的篩選

選擇洗脫劑1 (正己烷∶乙酸乙酯=95∶5，體積比)、洗脫劑2 (正己烷∶氯仿=95∶5)、洗脫劑3(氯仿∶丙酮=95∶5) 3種洗脫劑對0.6 mg/mL的天然除蟲菊酯樣品進行展開，按照1.2.2方法，計算Rf值，篩選出最佳洗脫劑。

圖2 天然除蟲菊酯混合標(biāo)準(zhǔn)品和粗提物HPLC圖(a)和TLC圖(b)

改變最佳洗脫體系體積比，增加溶劑強度(100∶0、 99∶1、98∶2、97∶3、96∶4、95∶5、94∶6、93∶7、92∶8、91∶9、90∶10……)，使化合物在薄層板上依次展開，按照1.2.2方法，計算Rf值，確定AUTO-VLC制備分離天然除蟲菊酯的分離條件。

1.4.2 AUTO-VLC 分離天然除蟲菊酯

采用 AUTO-VLC對天然除蟲菊酯進行分離研究，選擇SiO2填料柱(150 mm×280 mm)；取2 000 g(200～300目)硅膠填充至色譜柱內(nèi)；取100 g天然除蟲菊酯與200 g硅膠干法混合樣品；洗脫劑為正己烷和乙酸乙酯；柱壓為0.6 MPa，設(shè)定10個儲液罐抽真空時間分別為20 min，自動收集每份樣品，分別濃縮、干燥、稱重，進行HPLC分析。

1.5 天然除蟲菊酯光穩(wěn)定性研究

1.5.1 天然除蟲菊酯光降解規(guī)律研究

1.5.1.1 天然除蟲菊酯紫外光照射穩(wěn)定性試驗[20]

配制天然除蟲菊酯 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 5個濃度的溶液，用移液管準(zhǔn)確移取樣品溶液1 mL，均勻地涂在直徑為5 cm的玻璃培養(yǎng)皿上，讓溶劑蒸發(fā)。將培養(yǎng)皿暴露在紫外燈下，對照組覆蓋鋁箔置于黑暗中。采用照度計測定累計光照強度，設(shè)定紫外累計光照強度 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3×104Lux，分別取不同累計光照強度下的樣品板，用甲醇(1 mL)提取，HPLC分析。分別根據(jù)公式⑵和⑶計算降解率和光解半衰期(T1/2)，每處理重復(fù)3次。

1.5.1.2 天然除蟲菊酯太陽光照射穩(wěn)定性試驗[20]

太陽光照試驗在無云日(9月至10月)上午9時至下午5時進行，使樣品能獲得最多的直射陽光。培養(yǎng)皿表面溫度變化范圍為 25～35℃。按照 1.5.1.1方法操作，設(shè)置太陽累計光照強度0、5、10、15、20、25×104Lux，分別取不同太陽累計光照強度下的樣品板，用甲醇(1 mL)提取，HPLC分析。計算天然除蟲菊酯的降解率和半衰期，每處理重復(fù)3次。

式中：C0為天然除蟲菊酯的初始濃度，C為天然除蟲菊酯光強下的未降解濃度，k是光降解速率常數(shù)。

1.5.1.3 不同波長紫外光下天然除蟲菊酯降解試驗

準(zhǔn)確稱取天然除蟲菊酯6 mg，加入乙腈配置成0.6 mg/mL溶液，測定在不同波長(200～400 nm)紫外光下天然除蟲菊酯的降解率，每處理重復(fù)3次。

1.5.2 穩(wěn)定劑對天然除蟲菊酯穩(wěn)定效果的研究

將天然除蟲菊酯分別與穩(wěn)定劑(木質(zhì)素磺酸鈉、3,4,5-三羥基苯甲酸、二叔丁基對甲酚、焦性沒食子酸、2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮)按 1∶1加入甲醇溶液中，溶解、配置成除蟲菊酯-穩(wěn)定劑0.6 mg/mL的溶液，用移液管取1 mL于培養(yǎng)皿中，蒸發(fā)溶劑后將培養(yǎng)皿置于紫外光和太陽光下，待紫外光累計光強達到3×104Lux，太陽光強累計達到 25×104Lux后移取1 mL甲醇于培養(yǎng)皿中提取，進行HPLC分析，測定5種穩(wěn)定劑保護效果，篩選最佳保護劑。改變除蟲菊酯精油與最佳穩(wěn)定劑溶液的比例(摩爾比)(1∶0.1、1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2)，按上述方法，篩選兩者最佳比例，每處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 天然除蟲菊酯化學(xué)成分的分離

2.1.1 AUTO-VLC 洗脫劑和洗脫條件的選擇

AUTO-VLC成功分離主要取決于能否選擇合適的兩相溶劑系統(tǒng)，通常是通過TLC法來選擇[21]。薄層色譜分析結(jié)果顯示：洗脫劑1處理的薄層板上出現(xiàn)2個深藍色的斑點，由混合標(biāo)準(zhǔn)對照TLC圖(圖2-b)及公式⑴可知，靠近前沿的斑點是除蟲菊酯 I類化合物，Rf是0.28；另一個斑點是除蟲菊酯II類化合物，Rf是0.1，在365 nm及245 nm處有熒光且出現(xiàn)斑點，斑點分布均勻，組分分離效果較好。洗脫劑 2處理出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，Rf接近于 0，組分在原點未展開，增大極性，組分出現(xiàn)一定分離度，仍存在拖尾現(xiàn)象，這說明此洗脫體系不適合。洗脫劑 3中所有組分在靠近溶劑前端的位置緊密洗脫在一起，即組分不被固定相吸附。經(jīng)觀察比較，最終選擇洗脫溶劑1 (正己烷和乙酸乙酯)進行分離。

改變正己烷和乙酸乙酯體積比，增加溶劑強度，使化合物在薄層板上依次展開[22]，得到適合天然除蟲菊酯的洗脫比例。試驗結(jié)果表明(表1)：隨著乙酸乙酯含量的增加，Rf增大；一般認為絕對Rf為0.2，相對Rf為 0.1[23]時，洗脫強度適合于色譜柱分離，當(dāng)正己烷∶乙酸乙酯=96∶4 (體積比)時，Rf(Py I)=0.201，洗脫體積5 BV，Rf(Py II)=0.077，洗脫體積13 BV。綜合考慮洗脫體積以及除蟲菊酯分離效果，選擇正己烷∶乙酸乙酯=96∶4，洗脫體積13 BV作為AUTO-VLC分離天然除蟲菊酯的條件。

2.1.2 AUTO-VLC分離天然除蟲菊酯

在優(yōu)化的AUTO-VLC分離條件下，100 g樣品經(jīng)過AUTO-VLC分離共得到49個組分(V1～V49)，耗時僅為16.5 h。根據(jù)TLC分析結(jié)果合并相似組分共得到10個組分，依次命名為A～J。通過與標(biāo)準(zhǔn)對照圖譜(圖2-a)比對發(fā)現(xiàn)天然除蟲菊酯目標(biāo)化合物與雜質(zhì)得到明顯的分離，表2顯示組分C、D、E、G、H、I和J目標(biāo)化合物純度在90%以上，總質(zhì)量52.1 g，其中組分E的除蟲菊酯I純度達到93.5%，組分H中除蟲菊酯II純度達到92.3%，組分I中除蟲菊酯II純度達到90.4%，達到FAO和WHO對原藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)純度在 90%的要求。目標(biāo)化合物回收率92.5%。試驗結(jié)果表明：AUTO-VLC相較于傳統(tǒng)制備方法取得重大突破，實現(xiàn)克級以上的制備量，對天然除蟲菊酯復(fù)雜組分有很好的分離效果，且分離時間短，耗費溶劑少，回收率高。

表1 AUTO-VLC分離條件的確定

表2 AUTO-VLC分離天然除蟲菊酯組分信息

2.2 天然除蟲菊酯光穩(wěn)定性研究

2.2.1 天然除蟲菊酯光降解規(guī)律研究

紫外光和太陽光波長范圍不同，提供的能量不同[24]，對不同初始濃度的樣品進行不同累計光強的紫外光和太陽光照射。結(jié)果表明(圖3)：光照初期降解速率較高而后降解趨于平緩，天然除蟲菊酯初始濃度越高，全部降解所需光強越多，早期降解量越多；0.2 mg/mL除蟲菊酯在紫外光累計光強達到2.5×104Lux時完全降解，而在太陽光累計光強達到20×104Lux時完全降解，這說明紫外光對天然除蟲菊酯的降解作用明顯高于太陽光。進一步研究了天然除蟲菊酯在不同波長紫外光下降解規(guī)律(表 3)，結(jié)果表明：在紫外波長為230 nm時天然除蟲菊酯降解最快，且波長為200～290 nm時降解速率較快，波長在350 nm以上時降解緩慢。天然除蟲菊酯主要在波長較短的紫外光下降解。紫外光波長短，能量高，穿透性強，天然除蟲菊酯降解快[23]。

天然除蟲菊酯的濃度隨累計光強的變化用一級動力學(xué)方程ln(C0/C)=kt擬合如圖4，擬合方程動力學(xué)參數(shù)列于表3，通過圖4和表3可知在紫外光下二者的線性相關(guān)系數(shù)R2：0.968～0.985，太陽光下線性相關(guān)系數(shù)R2：0.839～0.926。這表明天然除蟲菊酯的光解符合準(zhǔn)一級動力學(xué)方程。隨著天然除蟲菊酯初始濃度增加，其降解速率增加，半衰期減小。

圖3 天然除蟲菊酯濃度隨紫外累計光照強度(a)和太陽累計光照強度(c)變化曲線

表3 天然除蟲菊酯溶液在不同波長紫外光下的降解率

2.2.2 光穩(wěn)定劑對天然除蟲菊酯穩(wěn)定效果研究

光穩(wěn)定劑能選擇性地吸收高能量的光，使之變成無害的能量釋放或消耗，從而對農(nóng)藥起到保護作用[25]。不同穩(wěn)定劑對天然除蟲菊酯在不同光照下保護作用如圖5-1，由圖5可知5種保護劑的保護效果依次是 2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮＞木質(zhì)素磺酸鈉＞焦性沒食子酸＞3,4,5-三羥基苯甲酸＞二叔丁基對甲酚。

在紫外光累計光強3×104Lux和太陽光累計光強25×104Lux時，在2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮的保護下除蟲菊酯降解率分別是9.8%、17.9%，這種穩(wěn)定劑強烈的保護作用可能與它結(jié)構(gòu)有關(guān)，它能被紫外線激活，變成鯤型結(jié)構(gòu)并隨之放出熒光而被還原[11,16]。該過程能大量吸收紫外線，從而可以屏蔽紫外光對天然除蟲菊酯的降解[25]。

圖4 不同濃度天然除蟲菊酯光降解反應(yīng)ln(C0/C)與累計光照強度的關(guān)系圖

表4 不同濃度的天然除蟲菊酯光降解反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)

不同用量的2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮保護天然除蟲菊酯免于光降解的情況如圖 5-2。由圖 5-2可知，當(dāng)天然除蟲菊酯與2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮比例為1∶0.5時，天然除蟲菊酯在紫外光下降解率降低了 76.1%，在太陽光下降解率降低了 65.1%，可見2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮的保護作用明顯；當(dāng)兩者比例為 1∶1時，天然除蟲菊酯在紫外光下降解率為 10.1%，太陽光下降解率為 15.9%；在一定范圍內(nèi)，隨著兩者比例增加，天然除蟲菊酯降解率下降，2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮對天然除蟲菊酯保護效果增強，當(dāng)兩者比例達到1∶1后降解率下降不明顯。綜上可知，天然除蟲菊酯與 2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮的摩爾比為1∶1時，2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮可顯著降低天然除蟲菊酯的光降解性，這為研制穩(wěn)定高效的除蟲菊酯農(nóng)藥制劑提供了理論支持。

3 結(jié) 論

隨著天然產(chǎn)物的分離朝著全自動、全成分和較大制備量的方向發(fā)展，許多中藥成分采用自動化的制備色譜進行研究。本文是首次采用AUTO-VLC對天然除蟲菊酯化合物制備分離進行探究，分離過程中建立了TLC展開篩選AUTO-VLC分離條件的方法，即洗脫劑為正己烷∶乙酸乙酯=96∶4(體積比)，洗脫量為13 BV，從100 g天然除蟲菊粗提物中分離得到純度在90%以上的除蟲菊酯I (16.5 g)和除蟲菊酯II (13.05 g)，耗時16.5 h。AUTO-VLC較傳統(tǒng)制備液相色譜分離所用時間縮短，且打破只能實現(xiàn)毫克制備的局限。此研究為天然除蟲菊酯分離提供新的分離技術(shù)平臺。

紫外光和太陽光照射下天然除蟲菊酯的光解均符合一級反應(yīng)動力學(xué)規(guī)律，隨著天然除蟲菊酯初始濃度增加，其降解速率增加，半衰期減小，光照初期除蟲菊酯降解速率較高而后趨于平緩。天然除蟲菊酯在紫外光下降解率明顯大于可見光下，且在波長230 nm下出現(xiàn)最大降解率。研究發(fā)現(xiàn)除蟲菊酯活性物質(zhì)的羥基容易降解，酸和醇部分容易發(fā)生氧化，在紫外光照射下更容易降解[26]，這與文章中天然除蟲菊酯在紫外光下更容易降解的情況相一致。

5種保護劑的保護效果依次是2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮＞木質(zhì)素磺酸鈉＞焦性沒食子酸＞3,4,5-三羥基苯甲酸＞二叔丁基對甲酚，且除蟲菊酯與2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮保護劑的摩爾比為1∶1時，2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮對天然除蟲菊酯保護效果最好。

試驗結(jié)果可為天然除蟲菊酯農(nóng)藥大規(guī)模制備分離及制備合適的穩(wěn)定制劑提供理論依據(jù)，促進其商品化進程。但本課題對除蟲菊酯類農(nóng)藥制劑及在農(nóng)田中的應(yīng)用還需要進一步的研究。