呂浩，周方偉綜述 許昱審校

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是特應(yīng)性個(gè)體接觸致敏原后由免疫球蛋E(IgE) 介導(dǎo)的炎性因子釋放、多種免疫活性細(xì)胞(T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等)共同參與的鼻黏膜變態(tài)反應(yīng)性疾病[1]。蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是由一類依賴Ca2+和磷脂激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族。PKC催化的磷酸化對(duì)細(xì)胞多種生理活動(dòng)必不可少，如增殖、分化等，是重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[2]。PKC及其同工酶家族表達(dá)于各種免疫細(xì)胞中，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、2型輔助T細(xì)胞(Th2)、B淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等，參與調(diào)節(jié)固有免疫和獲得性免疫的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[3]。前期研究表明，AR患者外周血淋巴細(xì)胞中PKC的活性增高，并且與外周血中IL-4、IL-5水平呈正相關(guān)[4]。不同PKC亞型參與不同的信號(hào)通路，并且具有一定的細(xì)胞特異性。然而目前對(duì)于PKC的各種同工酶亞型在變應(yīng)性鼻炎中的具體機(jī)制仍不清楚。筆者從AR的免疫學(xué)機(jī)制出發(fā)，綜述PKC各家族成員在輔助性T細(xì)胞1/輔助性T細(xì)胞2(Th1/Th2)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞/輔助性T細(xì)胞17(Treg/Th17)、B淋巴細(xì)胞、Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞 (ILC2s)、肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞中的作用，以期為AR提供新的治療思路。

1 PKC的結(jié)構(gòu)及分類

根據(jù)PKC激活方式的不同及調(diào)控結(jié)構(gòu)域之間的差異，將目前已知的10種PKC家族成員分為3類：經(jīng)典蛋白激酶C(PKCα、PKCβ1、PKCβ2、PKCγ)，新型蛋白激酶C(PKCδ、PKCε、PKCη、PKCθ)，非典型蛋白激酶C(PKCζ、PKCλ/ι)[5]。所有PKC同工酶具有共同的一般結(jié)構(gòu)，由2個(gè)主要結(jié)構(gòu)域組成，包括高度保守的催化結(jié)構(gòu)域(由三磷酸腺苷/底物COOH-末端結(jié)合域和催化所需序列組成)和將酶維持在非活性構(gòu)象的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(位于蛋白質(zhì)的NH2-末端，包含1個(gè)自抑制性假底物結(jié)構(gòu)域和2個(gè)離散的膜靶向序列)[5]。調(diào)節(jié)區(qū)和催化區(qū)通過鉸鏈區(qū)(該部位對(duì)蛋白酶極其敏感)連接一起。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)，經(jīng)典蛋白激酶C由5個(gè)可變區(qū) (V區(qū)) 和4個(gè)保守區(qū) (C區(qū)) 組成。C1是二酰甘油 (DAG) 或佛波酯(PMA)的結(jié)合位點(diǎn)，C2區(qū)含有酸性脂質(zhì)的識(shí)別位點(diǎn)，并且負(fù)責(zé)結(jié)合Ca2+，C1和C2合稱PKC的調(diào)節(jié)區(qū)；C3有1個(gè)ATP結(jié)合基序，為PKC提供能量和磷酸基團(tuán)，C4是底物結(jié)合區(qū)，催化中心位于此區(qū)，C3和C4區(qū)合稱為PKC的催化區(qū);該組的活性取決于Ca2+、DAG和磷脂酰絲氨酸 (PS)[6]。新型蛋白激酶C在結(jié)構(gòu)上與經(jīng)典蛋白激酶C類似， 但其C2區(qū)不具有與Ca2+結(jié)合的酸性氨基酸殘基;因此，它不依賴于Ca2+，而是需要DAG和PS來激活。非典型蛋白激酶C與前2組結(jié)構(gòu)不同，C1區(qū)含有能夠與神經(jīng)酰胺或PIP3結(jié)合的非經(jīng)典C1結(jié)構(gòu)域，且缺少C2區(qū)。因此它們不能被上述第二信使激活。aPKC的PB1 (phox and bem 1)結(jié)構(gòu)域能夠與同樣有PB1結(jié)構(gòu)域的支架蛋白(包括P62、PAR-6和NBR1)結(jié)合，從而調(diào)控蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象和激酶活性[7]。

2 AR發(fā)病機(jī)制

目前研究表明，AR的發(fā)病機(jī)制主要表現(xiàn)為Th1/Th2/Th17和Treg的免疫失衡。一般認(rèn)為，AR的發(fā)病過程始于接觸變應(yīng)原。當(dāng)變應(yīng)原侵入鼻黏膜上皮后，由抗原提呈細(xì)胞(APC)攝取，被加工成小肽并與特定的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅱ類分子結(jié)合，形成抗原肽—MHCⅡ類分子復(fù)合物，并表達(dá)在細(xì)胞膜表面，被CD4+初始 T細(xì)胞表面的受體和其他共刺激分子識(shí)別后，使幼稚T細(xì)胞分化為Th2細(xì)胞，并產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子?？乖禺愋訲h2細(xì)胞直接刺激B細(xì)胞，誘導(dǎo)其分化為漿細(xì)胞并產(chǎn)生抗體[8]。而IL-4可以誘導(dǎo)B細(xì)胞IgM抗體發(fā)生類別轉(zhuǎn)換，促進(jìn)IgE形成[9]。IgE與肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和APC表面的IgE高親和力受體結(jié)合，使這些細(xì)胞對(duì)變應(yīng)原致敏。當(dāng)機(jī)體再次暴露于變應(yīng)原，IgE-FcεRI復(fù)合物在APC上的交聯(lián)有助于APC加速攝取變應(yīng)原并進(jìn)行加工和呈遞。同樣，這也引起肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放多種炎性介質(zhì)從而在AR的發(fā)病中起作用[10]。同時(shí)，受損的鼻黏膜上皮分泌胸腺間質(zhì)淋巴生成素(TSLP)、IL-33、IL-25等上皮源性細(xì)胞因子，激活Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞釋放Th2細(xì)胞因子,促進(jìn)AR的進(jìn)展。Th17細(xì)胞可通過促炎因子募集嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等促進(jìn)炎性細(xì)胞向鼻黏膜局部募集，從而促使發(fā)生變應(yīng)性炎性反應(yīng)[10]。Treg細(xì)胞作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，通過釋放細(xì)胞因子和細(xì)胞間接觸等多種機(jī)制，直接抑制變應(yīng)原特異性Th2細(xì)胞的活化[11]。

3 PKC在AR相關(guān)免疫細(xì)胞中的作用

3.1 PKC在Th2細(xì)胞中的作用 Th2反應(yīng)是AR發(fā)病機(jī)制的核心。PKC家族成員在T細(xì)胞中的作用已被廣泛研究，其中PKCθ的作用尤為突出。APC細(xì)胞表面的抗原肽—MHCⅡ類分子復(fù)合物與初始T細(xì)胞上的T細(xì)胞抗原受體(TCR)及共刺激分子CD28相互作用形成免疫突觸，PKCθ被特異性募集到免疫突觸中，隨后刺激T細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1、NFAT，從而引發(fā)T細(xì)胞活化、增殖、分化等一系列免疫反應(yīng)[12]。此后，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)PKCθ在T細(xì)胞亞群的作用。PKCθ可正向調(diào)控Th2和Th17細(xì)胞數(shù)量及功能，而對(duì)Th1細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞則無明顯影響。 有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在OVA致敏的過敏性哮喘小鼠模型中，PKCθ基因缺陷小鼠的血清及肺泡灌洗液中OVA特異性IgE水平明顯降低，體外培養(yǎng)PKCθ缺陷型T細(xì)胞則無法產(chǎn)生IL-4[13]。 后續(xù)研究進(jìn)一步解釋了PKCθ缺陷型T細(xì)胞IL-4產(chǎn)生障礙的原因， PKCθ可激活CD4+T細(xì)胞NF-κB，進(jìn)而促進(jìn)IL-6的分泌，這誘導(dǎo)了CD4+T細(xì)胞IL-4的自分泌[14]。而IL-4正是誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化及維持Th2細(xì)胞分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子[15]。另一項(xiàng)研究揭示了PKCθ正向調(diào)控Th2細(xì)胞分化的新機(jī)制。在PKCθ基因缺陷的Th2細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)GATA結(jié)合蛋白3(GATA3)表達(dá)水平明顯下降，而GATA3蛋白是Th2細(xì)胞特征性轉(zhuǎn)錄因子[16]。這說明PKCθ也可以通過上調(diào)GATA3表達(dá)，促進(jìn)Th2細(xì)胞的分化。

除PKCθ外，aPKC在變應(yīng)性疾病中也起著非常重要的作用。在條件性PKCλ/ι基因缺陷小鼠(僅在活化的T細(xì)胞中PKCλ/ι缺失)中，外周血Th2細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)明顯降低，同時(shí)也觀察到OVA特異性IgE血清水平顯著降低[17]。而在對(duì)另一種aPKC(PKCζ)的研究中，也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。在OVA誘導(dǎo)的過敏性哮喘小鼠模型中，PKCζ基因缺陷小鼠的支氣管肺泡灌洗液中Th2型細(xì)胞因子顯著減少；體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)PKCζ是激活JAK1/STAT6信號(hào)通路所必需的因子，該信號(hào)通路控制Th2效應(yīng)子功能和IL-4受體信號(hào)傳導(dǎo)[18-19]。

PKC不僅在誘導(dǎo)分化Th2細(xì)胞階段發(fā)揮作用，而且分化成熟的Th2細(xì)胞生理活動(dòng)也依賴PKC。最近一項(xiàng)研究表明，電壓門控鈣通道Cav1.2是人高度分化的Th2細(xì)胞中Ca2+響應(yīng)和細(xì)胞因子產(chǎn)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)通道，而PKCα/β是Cav1.2鈣通道下游信號(hào)通路的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[20]。在OVA致敏的過敏性哮喘小鼠模型中，運(yùn)用PKCα/β抑制劑G6976可降低Ca2+促發(fā)的Th2細(xì)胞活化和細(xì)胞因子產(chǎn)生[21]。

3.2 PKC在Th17/Treg細(xì)胞中的作用 Th17細(xì)胞主要分泌促炎因子IL-17A、IL-17F、IL-6、IL-23等，通過調(diào)節(jié)Th2型細(xì)胞因子IL-5參與AR的發(fā)生和發(fā)展。Wachowicz等[22]發(fā)現(xiàn)PKCθ可促進(jìn)nave T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，體外實(shí)驗(yàn)表明 PKCθ可以激活STAT3、Th17特征性轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤核受體γt(RORγt)及IL-17A/F基因組轉(zhuǎn)錄；在Th17細(xì)胞分化完成后，PKCθ通過抑制STAT4基因啟動(dòng)子來穩(wěn)定Th17細(xì)胞表型。Sen等[23]的研究進(jìn)一步揭示了PKCθ激活轉(zhuǎn)錄因子RORγt的分子機(jī)制。Th17細(xì)胞在分化初始時(shí)共表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Foxp3，F(xiàn)oxp3直接綁定到RORγt蛋白拮抗其結(jié)合DNA，類固醇受體共激活劑(SRC1)結(jié)合RORγt可促進(jìn)Foxp3從RORγt釋放，隨后通過泛素—蛋白酶體途徑降解，從而逆轉(zhuǎn)了Foxp3介導(dǎo)的RORγt抑制作用。而PKCθ催化SRC1 磷酸化，是促進(jìn)SRC1 結(jié)合RORγt的關(guān)鍵步驟。此外，另有研究表明，在屋塵螨(HDM)誘導(dǎo)的過敏性氣道炎性反應(yīng)模型中， PKCλ/ι基因缺陷型小鼠較對(duì)照組小鼠支氣管肺泡灌洗液中的浸潤(rùn)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量及Th17細(xì)胞因子(包括IL-17、IL-21和IL-22)水平明顯降低[24]。后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PKCλ/ι亦是通過上調(diào)STAT3和RORγt蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)Th17細(xì)胞的活化。Treg細(xì)胞對(duì)于維持免疫穩(wěn)態(tài)和自身耐受性具有重要作用，AR患者中Treg細(xì)胞數(shù)目及比例明顯降低。有研究表明，在PKCθ基因敲除小鼠的淋巴器官中，CD25+CD4+Foxp3+T細(xì)胞的百分比降低[25]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PKCθ可以通過calcineurin/NFAT通路上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)，從而促進(jìn)Treg細(xì)胞的發(fā)育[26]。

3.3 PKC在Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞中的作用 Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞 (ILC2s)是一種新型固有免疫細(xì)胞，因分泌Th2型細(xì)胞因子而得名，主要分布于呼吸道、消化道等黏膜組織中，參與調(diào)節(jié)組織損傷、寄生蟲、變應(yīng)原等刺激后的機(jī)體反應(yīng)[27-28]。目前研究表明，PKCθ信號(hào)通路與ILC2s激活密切相關(guān)。Madouri等[29]發(fā)現(xiàn)在過敏性哮喘小鼠模型中，PKCθ對(duì)于ILC2s的激活和促進(jìn)Th2型反應(yīng)是必需的；敲除PKCθ基因后，小鼠肺組織中ILC2s總數(shù)量顯著降低，同時(shí)分泌IL-5、IL-13的ILC2s比例也明顯減少。體外實(shí)驗(yàn)表明，PKCθ基因缺陷型小鼠中ILC2s數(shù)量降低與IRF4、NFAT1表達(dá)減少有關(guān)。而轉(zhuǎn)錄因子IRF4與NFAT1協(xié)同作用可促進(jìn)T細(xì)胞IL-4基因的表達(dá)及Th2細(xì)胞反應(yīng)。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)是最主要的ILC2s激活因子之一，激活后的ILC2s釋放大量Th2型細(xì)胞因子[30]。Nomura等[31]發(fā)現(xiàn)在人鼻成纖維細(xì)胞中，PKCδ抑制劑可抑制TSLP的產(chǎn)生。

3.4 PKC在B細(xì)胞中的作用 AR患者的特征之一在于外周血中記憶性B細(xì)胞或漿細(xì)胞分化增加[32]。與PKCθ在T細(xì)胞中發(fā)揮主要作用類似，PKCβ被認(rèn)為是B細(xì)胞中起關(guān)鍵作用的PKC同工酶。研究發(fā)現(xiàn)，在PKCβ基因敲除小鼠中，外周血B細(xì)胞活化、增殖、抗體產(chǎn)生方面存在明顯缺陷[33]。隨后研究表明，抗原與初始B細(xì)胞抗原受體(BCR)結(jié)合，導(dǎo)致受體相關(guān)酪氨酸激酶(Src家族、Syk和Btk)激活，這誘導(dǎo)了第二信使DAG和三磷酸肌醇的產(chǎn)生。受DAG刺激，PKCβ轉(zhuǎn)位到BCR信號(hào)體中，激活關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Myc、NF-κB等，最終促進(jìn)B細(xì)胞活化、增殖。B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化的啟動(dòng)受轉(zhuǎn)錄因子PAX5和IRF4的雙重調(diào)控[34]。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)PKCβ可以上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子PAX5和IRF4表達(dá)，從而促進(jìn)生發(fā)中心的形成和漿細(xì)胞分化[35]。綜上所述，PKCβ是B細(xì)胞免疫反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)因子。因此，靶向抑制抗原特異性B細(xì)胞中PKCβ，或許是治療AR有效的策略。

3.5 PKC在肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞中的作用 肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞是AR中關(guān)鍵的效應(yīng)細(xì)胞。Ca2+動(dòng)員在肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒階段起關(guān)鍵作用，而PKCδ是FcεRI信號(hào)通路中Ca2+動(dòng)員下游的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[36-37]。在過敏性哮喘小鼠模型中，腹腔注射PKCδ特異性抑制劑rottlerin可降低支氣管肺泡灌洗液中組胺濃度。另有研究表明，PKCδ可以通過非Ca2+依賴途徑參與嗜堿性粒細(xì)胞的脫顆粒作用，在大鼠嗜堿性粒細(xì)胞系RBL-2H3中發(fā)現(xiàn)，PKCδ促進(jìn)膜融合因子Munc18a在Ser313處的磷酸化，從而導(dǎo)致嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒[38]。運(yùn)用PKCδ抑制劑Ro-03-0432以濃度依賴性方式抑制嗜堿性粒細(xì)胞系RBL-2H3組胺濃度。而組胺是過敏反應(yīng)，特別是速發(fā)相反應(yīng)中的主要炎性介質(zhì)之一。其作用主要是通過靶細(xì)胞(如血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞)表面組胺H1受體來介導(dǎo)[39]?；ǚ郯Y患者鼻癥狀評(píng)分(VAS)與鼻黏膜中組胺H1受體(H1R)mRNA水平之間存在顯著相關(guān)性[40]。Islam等[41]研究發(fā)現(xiàn)，PKCδ信號(hào)通路促進(jìn)H1受體基因的表達(dá)。在甲苯2，4-二異氰酸酯(TDI)致敏的AR大鼠模型中，運(yùn)用PKCδ抑制劑可以顯著改善AR大鼠打噴嚏、流涕等癥狀。這些研究均表明，PKCδ通過調(diào)控肥大細(xì)胞在變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。因此PKCδ是抗過敏藥開發(fā)中一個(gè)富有前景的靶蛋白。關(guān)于PKC在嗜酸性粒細(xì)胞中的作用則知之甚少，有限的研究表明，PKCζ是唯一在嗜酸性粒細(xì)胞中發(fā)揮作用的PKC同工酶。在體外實(shí)驗(yàn)中，用PKCζ特異性抑制劑處理受血小板活化因子(PAF)或補(bǔ)體5a(C5a)刺激的人嗜酸性粒細(xì)胞后，嗜酸性粒細(xì)胞超氧陰離子及活性氧的產(chǎn)生明顯下降；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)PKCζ抑制劑減弱了嗜酸性粒細(xì)胞脫顆粒和黏附作用[42]。

4 小結(jié)與展望

綜上所述， PKC是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，其介導(dǎo)AR發(fā)病的多種免疫細(xì)胞活化和功能。PKC及下游信號(hào)通路的激活參與了Th1/Th2、Th17/Treg平衡，促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞活化，從而影響AR進(jìn)程。然而目前為止，對(duì)PKC在變應(yīng)性疾病中的研究大多聚焦于哮喘，而AR中的相關(guān)研究仍然匱乏。深入研究PKC不同亞型在AR中的調(diào)節(jié)機(jī)制，有利于為治療AR及其他變應(yīng)性疾病提供新的治療靶點(diǎn)。