李 靖， 賀亞都， 王愛民， 李勇軍， 鄭 林， 劉 亭*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州省藥物制劑重點實驗室/省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004；4.銅仁市萬山區(qū)人民醫(yī)院，貴州 銅仁 554200；5.貴州維康子帆藥業(yè)股份有限公司，貴州 修文 550200)

在肝臟表面廣泛分布著高表達(dá)的攝取型和外排型轉(zhuǎn)運體[1-2]。攝取型轉(zhuǎn)運體主要包括有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運多肽(organic anion-transporting polypeptide，OATP)、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運體(organic anion transporter，OAT)、有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運體(organic cation transporter，OCT)等，外排型轉(zhuǎn)運體主要包括乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated proteins，MRPs)等[3-5]。越來越多的研究表明，肝臟轉(zhuǎn)運體的活性或表達(dá)量決定著藥物的代謝命運，直接影響到藥物的攝入和清除[6]。因此，研究藥物對肝臟轉(zhuǎn)運體的活性或表達(dá)，對于闡明藥物間的相互作用，指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。骨康膠囊是貴州傳統(tǒng)苗藥復(fù)方制劑，主要由補(bǔ)骨脂、三七、續(xù)斷、芭蕉根和酢漿草組成，具有滋補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋壯骨、通絡(luò)止痛等功效[7-8]，常與其他藥物聯(lián)用于骨性關(guān)節(jié)炎、骨折、骨質(zhì)疏松癥的治療[9-11]。目前尚無關(guān)于骨康膠囊影響藥物轉(zhuǎn)運體活性或表達(dá)的報道。為更好地指導(dǎo)骨康膠囊臨床應(yīng)用，本實驗從蛋白表達(dá)的角度，研究骨康膠囊對大鼠肝臟藥物轉(zhuǎn)運體有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運體1(organic cation transporter 1，OCT1)、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運多肽1B1(organic anion-transporting polypeptide 1B1，OATP1B1)、多藥耐藥相關(guān)蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1，MRP1)、多藥耐藥相關(guān)蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2，MRP2)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)表達(dá)的影響，期望為避免骨康膠囊潛在的藥物相互作用提供參考。

1 材料

1.1 動物 24只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，購自長沙天勤生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(湘)2014-0011。研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號1503017)。

1.2 試劑與藥物 骨康膠囊(貴州維康子帆藥業(yè)股份有限公司，批號20180521)。超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號103018190830)；膜蛋白提取試劑盒(美國賽默飛公司，批號UC279290)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司，批號20190215)；OCT1抗體(批號GR3239193-1)、OATP1B1抗體(批號GR3191515-16)、MRP1抗體(批號GR3219564-3)、MRP2抗體(批號GR3269764-1)、BCRP/ABCG2抗體(批號GR3229567-3)、P-gp抗體(批號GR3219236-1)(英國Abcam公司)；GAPDH抗體(批號TH270579)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(批號TB260069)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(批號TC262979)(美國Invitrogen公司)。

1.3 儀器 PowerPacTMBasic電泳儀、Trans-Blot? TurboTMSystem蛋白快速轉(zhuǎn)印儀(美國Bio-Rad公司)；GBOX-Chemi-XL1.4凝膠成像系統(tǒng)(英國Syngene公司)。

2 方法

2.1 分組與給藥 將24只大鼠隨機(jī)分為4組，即空白組，骨康膠囊低、中、高劑量組，每組6只，空白組灌胃給予滅菌蒸餾水7 d，每天2次，骨康膠囊用滅菌蒸餾水配成混懸液后灌胃給藥，低、中、高劑量分別為0.43、0.86、1.72 g/(kg·d-1)，連續(xù)7 d，每天2次。

2.2 大鼠肝臟藥物轉(zhuǎn)運體蛋白表達(dá)檢測 各組大鼠給藥7 d后禁食12 h，自由飲水，股動脈放血處死，取肝臟，生理鹽水灌洗，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，膜蛋白提取試劑盒提取膜蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?0 μg蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離，使用半干轉(zhuǎn)系統(tǒng)，在25 V、1.0 A條件下轉(zhuǎn)膜30 min，使用5%BSA在4 ℃下封閉12 h，加入GAPDH抗體(1∶5 000)、OCT1抗體(1∶1 000)、OATP1B1抗體(1∶5 000)、MRP1抗體(1∶500)、MRP2抗體(1∶1 000)、BCRP抗體(1∶1 000)、P-gp抗體(1∶1 000)，在4 ℃下孵育10 h，1×TBST洗膜5次，加入相應(yīng)的二抗(1∶2 000)，于室溫下孵育1.5 h，1×TBST洗膜5次，加入化學(xué)發(fā)光顯影液顯影，使用Quantity one軟件進(jìn)行條帶灰度值分析，計算目的蛋白/內(nèi)參蛋白灰度值。

3 結(jié)果

3.1 骨康膠囊對大鼠肝臟OCT1、OATP1B1蛋白表達(dá)的影響 骨康膠囊低、中劑量組大鼠OCT1蛋白表達(dá)較空白組升高(P<0.01)，高劑量組無明顯變化(P>0.05)，各劑量組大鼠OATP1B1蛋白表達(dá)均較空白組降低(P<0.01)，并呈劑量依賴性，見圖1、表1。

表1 骨康膠囊對大鼠肝臟OCT1、OATP1B1蛋白表達(dá)的影響

注：A為空白組，B為骨康膠囊低劑量組，C為骨康膠囊中劑量組，D為骨康膠囊高劑量組。

3.2 骨康膠囊對大鼠肝臟MRP1、MRP2蛋白表達(dá)的影響 骨康膠囊低劑量組大鼠MRP1蛋白表達(dá)較空白組降低(P<0.05)，中、高劑量組升高(P<0.05，P<0.01)，低、高劑量組大鼠MRP2蛋白表達(dá)與空白組比較無明顯變化(P>0.05)，中劑量組升高(P<0.01)，見圖2、表2。

注：A為空白組，B為骨康膠囊低劑量組，C為骨康膠囊中劑量組，D為骨康膠囊高劑量組。

表2 骨康膠囊對大鼠肝臟MRP1、MRP2蛋白表達(dá)的影響

3.3 骨康膠囊對大鼠肝臟BCRP、P-gp蛋白表達(dá)的影響 骨康膠囊各劑量組大鼠BCRP、P-gp蛋白表達(dá)均較空白組降低(P<0.01)，見圖3、表3。

注：A為空白組，B為骨康膠囊低劑量組，C為骨康膠囊中劑量組，D為骨康膠囊高劑量組。

表3 骨康膠囊對大鼠肝臟BCRP、P-gp蛋白表達(dá)的影響

4 討論

肝臟藥物轉(zhuǎn)運體參與藥物的吸收、分布、代謝、排泄，其活性的變化可引起生理疾病及藥物相互作用[12]，影響臨床用藥的安全性和有效性[13]。例如，OCT1介導(dǎo)了許多內(nèi)源性物質(zhì)和藥物從血液進(jìn)入肝臟進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化[14]。利福平可增加OCT1表達(dá)，二甲雙胍與其聯(lián)用后可增強(qiáng)二甲雙胍的降血糖作用[15]。OATP1B1參與肝臟從血液中攝取、清除外源性物質(zhì)，參與非結(jié)合型膽紅素及許多臨床藥物的轉(zhuǎn)運，如利福平、氟伐他汀、甲氨蝶呤等[16-17]。MRP1、MRP2、P-gp和BCRP可以將內(nèi)源或者外源物泵出胞外[16,18-22]。研究表明多柔比星與MRP1的表達(dá)抑制劑聯(lián)用后，可增強(qiáng)其抗結(jié)腸癌療效[23]。川芎的活性成分四甲基吡嗪以及黃連解毒湯等中藥制劑均可通過調(diào)節(jié)MRP2的表達(dá)而起到利膽、改善膽汁淤積病癥的作用[24]。β-淀粉樣蛋白以P-gp為跨膜載體，通過血腦屏障進(jìn)入血液中[25]。BCRP可介導(dǎo)化療耐藥、內(nèi)分泌治療耐藥、分子靶向藥物的耐藥等，轉(zhuǎn)運鹽酸米托蒽醌、柔紅霉素、阿霉素、拓?fù)湮骺怠⒁懒⑻婵档瓤鼓[瘤藥物[26-27]。

Western blot結(jié)果表明，不同劑量骨康膠囊對大鼠肝臟藥物轉(zhuǎn)運體的影響不同。高劑量骨康膠囊不影響大鼠OCT1蛋白表達(dá)，低、中劑量骨康膠囊升高大鼠OCT1蛋白表達(dá)，從而增加機(jī)體對OCT1底物的吸收；低、中、高劑量骨康膠囊均抑制大鼠OATP1B1蛋白表達(dá)，可能會降低機(jī)體對OATP1B1底物的吸收；不同劑量骨康膠囊對MRP1的影響有所差異：低劑量骨康膠囊抑制大鼠MRP1蛋白表達(dá)，中、高劑量骨康膠囊升高大鼠MRP1蛋白表達(dá)；低、高劑量骨康膠囊不影響大鼠MRP2蛋白表達(dá)，中劑量骨康膠囊升高大鼠MRP2蛋白表達(dá)；低、中、高劑量骨康膠囊均抑制大鼠BCRP、P-gp蛋白表達(dá)，可能會減少聯(lián)用藥物的外排，增加其生物利用度。

綜上所述，骨康膠囊可劑量依賴性地改變大鼠肝臟藥物轉(zhuǎn)運體OATP1B1蛋白表達(dá)，非劑量依賴性地改變大鼠肝臟藥物轉(zhuǎn)運體OCT1、MRP1、MRP2、BCRP和P-gp蛋白表達(dá)。這一結(jié)果提示當(dāng)骨康膠囊與相關(guān)藥物尤其是一些治療窗較窄的藥物聯(lián)合使用時，可能會發(fā)生轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的藥物相互作用，影響藥物的吸收、分布等。與藥物轉(zhuǎn)運體OATP1B1相關(guān)藥物聯(lián)合使用時，可通過給藥劑量預(yù)測由轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的藥物相互作用，但與藥物轉(zhuǎn)運體OCT1、MRP1、MRP2、BCRP和P-gp相關(guān)藥物聯(lián)合使用，較難通過給藥劑量預(yù)測由轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的藥物相互作用。當(dāng)然，由于動物和人在轉(zhuǎn)運體表達(dá)調(diào)控上的差異，該結(jié)論需要進(jìn)一步臨床研究來確證。