章 涵， 趙玉霞， 楊惠然， 董 雪

(信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 信陽 464000)

糖尿病腎病是臨床常見疾病類型，隨著病情發(fā)展可降低患者腎功能。蛋白濾過的最后屏障是足細(xì)胞，若其發(fā)生損傷可導(dǎo)致腎功能異常，進(jìn)而促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)生，故減輕其損傷成為治療糖尿病腎病的重要方法。研究表明，高血糖可引發(fā)氧化應(yīng)激，從而加重腎損傷，最終促進(jìn)糖尿病腎病發(fā)生[1-3]。紅花CarthamustinctoriusL.屬于菊科植物，其主要活性成分為紅花黃色素，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤等作用，并可保護(hù)心血管、神經(jīng)系統(tǒng)[4]，但尚無關(guān)于該成分對(duì)足細(xì)胞損傷的作用。

長鏈非編碼RNA FGD5反義RNA 1(lncRNA FGD5-AS1)在牙周炎中表達(dá)下調(diào)，并可能通過調(diào)控miR-142-3p/細(xì)胞因子信號(hào)抑制分子6(SOCS6)分子軸從而減緩牙周炎的發(fā)展[5]。生物信息學(xué)分析顯示，微小RNA-302a-3p(miR-302a-3p)可能是FGD5-AS1的靶基因，在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并可能參與糖尿病腎病的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[6]。但紅花黃色素是否通過調(diào)控FGD5-AS1/miR-302a-3p通路而影響足細(xì)胞損傷尚不明確，故本實(shí)驗(yàn)探討該成分對(duì)高糖誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞損傷的影響，分析其機(jī)制是否與調(diào)控FGD5-AS1/miR-302a-3p通路相關(guān)，以期為糖尿病腎病防治提供新方向。

1 材料

1.1 細(xì)胞 小鼠足細(xì)胞MPC5，購自美國ATCC公司。

1.2 試劑與藥物 紅花黃色素(批號(hào)180120)購自山東豐泰生物科技有限公司，采用無菌生理鹽水溶解紅花黃色素，制成質(zhì)量濃度為30 mg/mL的母液，置于4 ℃冰箱中保存。葡萄糖(批號(hào)G8270)、甘露醇(批號(hào)PHR1007)購自美國Sigma公司;亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-302a-3p寡核苷酸模擬物(miR-302a-3p mimics)及mimic 陰性對(duì)照序列(miR-NC)、FGD5-AS1小分子干擾RNA(si-FGD5-AS1)購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol試劑(批號(hào)20181003)購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；反轉(zhuǎn)錄(批號(hào)4387391)與熒光定量檢測(cè)試劑盒(批號(hào)4385612)購自美國Thermo Fisher公司；MTT(批號(hào)20181102)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)20171216)購自蘇州宇恒生物科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(批號(hào)A21020)購自武漢艾美捷科技有限公司；兔抗鼠活化的半胱氨酸蛋白酶12(cleaved caspase-12)(批號(hào)2202)、脫氧核糖核酸修復(fù)酶降解產(chǎn)物(cleaved-PARP)抗體(批號(hào)5625)、兔抗鼠C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(CHOP)(批號(hào)5554)、磷酸化真核細(xì)胞起始因子(p-eIF2α)(批號(hào)9721)購自美國CST公司；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)抗體(批號(hào)sc-13539)購自美國Santa Cruz公司。

1.3 儀器 Multiskan Sky 酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀購自北京艾格斯生物科技有限公司；StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

2 方法

2.1 分組 MPC5細(xì)胞接種于6孔板(每孔3×104個(gè))，分為對(duì)照組(含5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基孵育48 h)、甘露醇組(含19.5 mmol/L 甘露醇、5.5 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)48 h)、高糖組(含25 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基孵育48 h)[7]及高糖+紅花黃色素低、中、高劑量組(含有25 mmol/L 葡萄糖與0.5、1、2 μmol/L紅花黃色素的培養(yǎng)基共同處理48 h)[8]。后續(xù)實(shí)驗(yàn)分組為高糖+pcDNA組(pcDNA轉(zhuǎn)染至小鼠足細(xì)胞，含有5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h)、高糖+pcDNA-FGD5-AS1組(pcDNA-FGD5-AS1轉(zhuǎn)染至小鼠足細(xì)胞，加入含有5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h)、高糖+紅花黃色素高劑量+si-NC組(si-NC轉(zhuǎn)染至小鼠足細(xì)胞，含有5.5 mmol/L葡萄糖與2 μmol/L紅花黃色素的培養(yǎng)基共同處理48 h)、高糖+紅花黃色素高劑量+si-FGD5-AS1組(si-FGD5-AS1轉(zhuǎn)染至小鼠足細(xì)胞，含有5.5 mmol/L葡萄糖與2 μmol/L紅花黃色素的培養(yǎng)基共同處理48 h)。

2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集各組MPC5細(xì)胞接種于96孔板(每孔1×104個(gè))，每孔添加20 μL MTT溶液，孵育4 h后4 ℃、2 000 r/min離心10 min，吸棄上清，每孔添加150 μL DMSO，25 ℃下避光振蕩5 min，檢測(cè)各孔在490 nm波長處的光密度(OD)值。存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 預(yù)冷PBS洗滌各組MPC5細(xì)胞2次，取500 μL結(jié)合緩沖液加到細(xì)胞沉淀中，加入Annexin V-FITC、PI各5 μL，25 ℃下避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MPC5細(xì)胞凋亡率。

2.4 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中FGD5-AS1、miR-302a-3p的表達(dá) Trizol法提取MPC5細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后配置反應(yīng)體系。反應(yīng)體系為10 μL SYBR Green Master Mix、0.4 μL正向引物、0.4 μL反向引物、1 μL cDNA、8.2 μL ddH2O。FGD5-AS1以GAPDH為內(nèi)參，miR-302a-3p以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算FGD5-AS1、miR-302a-3p相對(duì)表達(dá)量。

2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)FGD5-AS1的靶基因 分別將FGD5-AS1野生熒光素酶報(bào)告載體(WT-FGD5-AS1)、突變載體(MUT-FGD5-AS1)與miR-NC或miR-302a-3p mimics共轉(zhuǎn)染至MPC5細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性。

2.6 Western blot檢測(cè)cleaved caspase-12、cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表達(dá) MPC5細(xì)胞加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，在25 ℃下分別孵育一抗(1∶1 000稀釋)2 h，再孵育二抗(1∶5 000稀釋)2 h。曝光，顯影，Image J軟件分析各條帶相對(duì)內(nèi)參GAPDH的灰度值。

3 結(jié)果

3.1 紅花黃色素對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞增殖及凋亡的影響 與對(duì)照組比較，甘露醇組細(xì)胞存活率、凋亡率、cleaved caspase-12、cleaved-PARP蛋白表達(dá)無明顯變化(P>0.05)，表明高滲對(duì)細(xì)胞活性的影響較小，即可排除高滲對(duì)細(xì)胞活性的影響；與甘露醇組比較，高糖組細(xì)胞存活率降低(P<0.05)，cleaved caspase-12和cleaved-PARP蛋白表達(dá)、凋亡率升高(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+紅花黃色素低、中、高劑量組細(xì)胞存活率升高(P<0.05)，cleaved caspase-12和cleaved-PARP蛋白表達(dá)、凋亡率降低(P<0.05)，見圖1、表1。

表1 紅花黃色素對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞增殖及凋亡的影響

注：A為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)紅花黃色素對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞凋亡率的影響，B為Western blot法檢測(cè)紅花黃色素對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞cleaved caspase-12以及cleaved-PARP蛋白表達(dá)的影響。

3.2 紅花黃色素對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷的影響 與對(duì)照組比較，甘露醇組細(xì)胞CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表達(dá)無明顯變化(P>0.05)，即可排除高滲對(duì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響；與甘露醇組比較，高糖組CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+紅花黃色素低、中、高劑量組CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，見圖2、表2。

圖2 紅花黃色素對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞內(nèi)CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表達(dá)的影響

表2 紅花黃色素對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷的影響

3.3 紅花黃色素對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞FGD5-AS1、miR-302a-3p表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，甘露醇組細(xì)胞FGD5-AS1、miR-302a-3p的表達(dá)無明顯變化(P>0.05)，即可排除高滲對(duì)細(xì)胞內(nèi)FGD5-AS1、miR-302a-3p表達(dá)的影響；與甘露醇組比較，高糖組FGD5-AS1表達(dá)降低(P<0.05)，miR-302a-3p表達(dá)升高(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+紅花黃色素低、中、高劑量組FGD5-AS1表達(dá)升高(P<0.05)，miR-302a-3p表達(dá)降低(P<0.05)，見表3。

表3 紅花黃色素對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞FGD5-AS1、miR-302a-3p表達(dá)的影響

3.4 FGD5-AS1過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞增殖、凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷的影響 與高糖+pcDNA組比較，高糖+ pcDNA-FGD5-AS1組細(xì)胞存活率升高(P<0.05)，cleaved caspase-12、cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α以及GRP78蛋白表達(dá)、凋亡率降低(P<0.05)，見圖3、表4。

表4 FGD5-AS1過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞增殖、凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷的影響

注：A為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FGD5-AS1過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞凋亡率的影響，B為Western blot法檢測(cè)FGD5-AS1過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞中cleaved caspase-12、cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表達(dá)的影響。

3.5FGD5-AS1靶向調(diào)控miR-302a-3pstarBase預(yù)測(cè)顯示FGD5-AS1與miR-302a-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖4。與WT-FGD5-AS1共轉(zhuǎn)染時(shí)，與miR-NC組比較，miR-302a-3p組熒光素酶活性降低(P<0.05)；與MUT-FGD5-AS1共轉(zhuǎn)染時(shí)miR-NC組與miR-302a-3p組熒光素酶活性比較，熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，見表5。pcDNA-FGD5-AS1組miR-302a-3p的表達(dá)低于pcDNA組(P<0.05)；si-FGD5-AS1組miR-302a-3p的表達(dá)高于si-NC組(P<0.05)，見表6。

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表6 FGD5-AS1靶向調(diào)控miR-302a-3p的表達(dá)

圖4 FGD5-AS1與miR-302a-3p的結(jié)合位點(diǎn)

3.6 干擾FGD5-AS1表達(dá)可降低紅花黃色素對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞增殖、凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用 與高糖+紅花黃色素高劑量+si-NC組比較，高糖+紅花黃色素高劑量+si-FGD5-AS1組細(xì)胞存活率降低(P<0.05)，cleaved caspase-12、cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α及GRP7蛋白表達(dá)、凋亡率升高(P<0.05)，見圖5、表7。

圖5 干擾FGD5-AS1表達(dá)聯(lián)合紅花黃色素對(duì)cleaved caspase-12、cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表達(dá)的影響

表7 干擾FGD5-AS1表達(dá)可降低紅花黃色素對(duì)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞增殖、凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用

4 討論

糖尿病腎病是引起終末期腎病的重要原因之一，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，其主要病理特征為腎小球基底膜增厚，足細(xì)胞損傷是糖尿病腎病發(fā)生的重要原因之一，高糖處理足細(xì)胞后可增加細(xì)胞凋亡率，研究表明小柴堿等中藥可通過維持足細(xì)胞功能穩(wěn)定性從而減緩糖尿病腎病的發(fā)展[9-10]。lnRNA表達(dá)異?？赏ㄟ^競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA從而參與糖尿病腎病、心血管疾病等多種疾病發(fā)生及發(fā)展過程[11]。關(guān)于紅花黃色素治療糖尿病腎病的作用機(jī)制及其可能作用靶點(diǎn)尚未闡明。

紅花黃色素屬于類黃酮化合物，其可用于治療腦血管疾病等炎癥性疾病，研究顯示紅花黃色素可有效控制肺纖維化發(fā)展進(jìn)程，并可抑制肝癌、乳腺癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12-14]。本研究結(jié)果顯示高糖處理后小鼠足細(xì)胞存活率降低，并可促進(jìn)cleaved caspase-12以及cleaved PARP的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而不同濃度的紅花黃色素處理后MPC5細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞凋亡率降低，并可抑制cleaved caspase-12、cleaved PARP的表達(dá)，且隨著藥物劑量的增加而逐漸變化。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)caspase-12被激活剪切為cleaved caspase-12并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，PARP屬于細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子，其活化形成cleaved-PARP從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15-16]。提示高糖可誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞增殖，而紅花黃色素可抑制高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞增殖。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要指標(biāo)是CHOP、p-eIF2α、GRP78，研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是引起細(xì)胞凋亡的重要途徑之一，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)GRP78的生成量增加并可激活CHOP、caspase-12從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而PERK與GRP78解體后可激活eIF2α形成p-eIF2α從而促進(jìn)CHOP表達(dá)最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。本研究結(jié)果顯示高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞中CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表達(dá)升高，而紅花黃色素能降低CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表達(dá)，且隨著藥物劑量的增加而逐漸降低，提示紅花黃色素可能通過抑制高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而抑制細(xì)胞凋亡。

FGD5-AS1在OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可能通過充當(dāng)miR-223的海綿分子從而減輕神經(jīng)元損傷[18]。本研究結(jié)果顯示高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞中FGD5-AS1的表達(dá)降低，而不同濃度的紅花黃色素處理后小鼠足細(xì)胞中FGD5-AS1的表達(dá)升高，提示紅花黃色素的保護(hù)作用可能依賴于FGD5-AS1表達(dá)增加。FGD5-AS1過表達(dá)后高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞存活率升高，凋亡率降低，cleaved caspase-12、cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α、GRP78表達(dá)下調(diào)，提示FGD5-AS1在糖尿病腎病足細(xì)胞損傷中可能發(fā)揮保護(hù)作用。同時(shí)本研究進(jìn)一步分析顯示FGD5-AS1可靶向結(jié)合miR-302a-3p，并可負(fù)向調(diào)控miR-302a-3p的表達(dá)，高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞中miR-302a-3p的表達(dá)升高，而不同濃度的紅花黃色素處理后miR-302a-3p表達(dá)降低，且隨著藥物劑量的增加而逐漸降低，提示紅花黃色素可能通過調(diào)控FGD5-AS1與miR-302a-3p表達(dá)從而對(duì)小鼠足細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示干擾FGD5-AS1表達(dá)與紅花黃色素共同處理后，高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞存活率降低，cleaved caspase-12、cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α以及GRP7蛋白表達(dá)上調(diào)，凋亡率升高。提示干擾FGD5-AS1表達(dá)可減弱紅花黃色素對(duì)高糖誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，紅花黃色素可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡來減輕高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能與上調(diào)FGD5-AS1/miR-302a-3p途徑有關(guān)。這為闡釋紅花黃色素治療糖尿病腎病的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，還可為明確FGD5-AS1在糖尿病腎病發(fā)生過程中的作用機(jī)制提供參考依據(jù)。