周子琪， 劉益波， 郭珊珊， 索朗歐珠

(西藏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，西藏 拉薩 850030)

藏紫草為紫草科植物長花滇紫草OnosmahookeriClarke.var.longiforumDuthie及細花滇紫草OnosmahookeriC.B.Clarke的根，主要分布在西藏東部和南部，含有β-谷甾醇、紫草素、齊墩果酸、阿魏酸、山柰酚等活性成分[1-2]。它作為藏醫(yī)習(xí)用藥材，有38個藏藥方劑將其入藥，常用于皮膚病、肺炎、結(jié)核空洞、高山多血癥、燒燙傷的治療[3-4]，但尚缺乏關(guān)于抗炎作用及機制的基礎(chǔ)研究。因此，本實驗探究藏紫草醇提物抗炎作用及其機制，以期為該藥用植物進一步開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 SW-CJ-2FD型超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；RE-5299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市宇翔儀器公司)；CCL-170B-8型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(新加坡藝思高科技有限公司)；XSP-17CV型倒置生物顯微鏡(上海巴拓儀器有限公司)；AP-0650010型細胞計數(shù)板(德國Marienfeld公司)；Infinite M200 PRO型多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)；Mini P-4型小型垂直電泳系統(tǒng)(北京凱元信瑞儀器有限公司)；Tanon-4600型化學(xué)發(fā)光成像儀(上海天能科技有限公司)；TDZ5-WS型冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)。

1.2 藥材 藏紫草于2017年8月采自西藏林芝地區(qū)，經(jīng)西藏職業(yè)技術(shù)學(xué)院丁云春教授鑒定為紫草科植物長花滇紫草OnosmahookeriClarke.var.longiforum Duthie的根。

1.3 試劑 脂多糖(lipopolysaccharides, LPS，美國Sigma-Aldrich公司，批號L2630MSDS)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(fatal bovine serum, FBS)、0.25%胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素雙抗(美國Gibco公司，批號2081863、11041-8612、90326-2、91018-3)；地塞米松(上海麥克林生化科技有限公司，批號D829854-5g)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)、白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號98329-1、96021-0、90324-1、91019-1)；Griess、BCA蛋白濃度測定試劑盒和RIPA裂解液(北京索萊寶生物科技有限公司，批號20190908、20190405、R0010)；一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)抗體、環(huán)氧合酶-2(cyclo oxygen ase-2, COX-2)抗體、β-actin抗體、Lamin B抗體、p65抗體、IκBα抗體、p-IκBα抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔(美國Affinity公司，鼠源，批號AF0199、AF7003、AF7018、DF7356、AF5006、AF2002、AF2002、S0001)；MTT試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號905W0989)；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)染液、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染液、2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽探針(2 ′, 7′-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA)(英國Abcam公司，批號ab188286、ab228550、ab113852)。其余試劑均為分析純；水為超純水。

1.4 細胞及動物 小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞，購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。清潔級雄性昆明小鼠 60只，體質(zhì)量22～26 g，購于西安交通大學(xué)，動物使用許可證號SYXK(陜)2014-003。

2 方法

2.1 藏紫草醇提物制備 稱取藥材500.00 g，75%乙醇加熱回流提取2次(料液比1∶10)，每次2 h，抽濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，浸膏冷凍干燥，即得(92.85 g，提取率為18.57%)，置于-20 ℃冰箱中保存，備用。

2.2 ELISA法檢測小鼠急性腹膜炎腹腔灌洗液中炎癥因子水平 60只小鼠隨機分為空白組、LPS組、地塞米松組及藏紫草醇提物低、中、高劑量組(0.39、0.78、1.17 g/kg)，每組10只，藏紫草醇提取組灌胃給予藏草醇提物(蒸餾水溶解)，其余組大鼠灌胃給予0.9%生理鹽水，每天2次，連續(xù)7 d。禁食過夜后，地塞米松組小鼠腹腔注射地塞米松(0.5 mg/kg)，1 h后除空白組外的小鼠腹腔注射1 mg/kg LPS，4 h后處死小鼠，打開腹腔，用含肝素(25 U/mL)的無菌磷酸鹽緩沖液沖洗，無菌注射器收集腹腔灌洗液。按ELISA說明書方法測定腹腔洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

2.3 RAW264.7細胞培養(yǎng) 將小鼠巨噬細胞(RAW264.7)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL)的DMEM高糖培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中溫育生長融合到80%～90%時進行傳代。

2.4 MTT法檢測藏紫草醇提物的細胞毒性 將對數(shù)生長期的RAW264.7細胞以1×105/mL接種于96孔板中，過夜，藏紫草醇提物(100、200、300、400、800 μg/mL)孵育24 h后，每孔加入50 μL MTT(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h，吸棄孔內(nèi)的培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲亞砜，振蕩至板底的紫色結(jié)晶完全溶解，酶標儀于450 nm波長處測定光密度(OD)值，以空白組為100%，計算細胞存活率，公式為細胞存活率=OD給藥/OD空白×100%

2.5 ELISA法檢測RAW264.7細胞上清液的炎癥因子水平 將對數(shù)生長期的RAW264.7細胞以5×104/mL接種于24孔板中，過夜，按“2.4”項下方法分組給藥，其中藏紫草醇提物100、200、300、400 μg/mL為“2.4”項下篩選出無細胞毒性的質(zhì)量濃度，除空白組外其余各組加入1 μg/mL LPS。18 h后，取各組細胞培養(yǎng)上清液，采用Griess試劑檢測各組細胞上清液NO水平，按照ELISA說明書測定TNF-α、IL-6、PGE2水平。

2.6 Western blot法檢測RAW264.7細胞中iNOS、COX-2蛋白表達 將對數(shù)生長期的RAW264.7以1×105/mL接種于6孔板中，過夜，分為空白組、LPS組(1 μg/mL)、藏紫草醇提物(100、200、300、400 μg/mL)組，每組設(shè)3個復(fù)孔，給藥24 h后，除空白組外其余各組加入1 μg/mL LPS，置于培養(yǎng)箱中孵育18 h。總蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，BCA法檢測其濃度，取30 μg加入上樣緩沖液充分變性后，進行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法將膠中蛋白轉(zhuǎn)到NC膜上，含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，含3%脫脂奶粉的TBST稀釋相應(yīng)一抗(iNOS、COX-2和β-actin)后孵育1.5 h，TBST洗膜，加入含1%脫脂奶粉TBST稀釋的HRP二抗孵育1 h，ECL試劑顯影，采用化學(xué)發(fā)光成像儀分析。通過Gel-Pro Analyzer軟件對蛋白條帶灰度進行定量分析，以目標條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值之比表示目標蛋白表達。

2.7 Western blot法檢測RAW264.7細胞中NF-κB通路相關(guān)蛋白表達 細胞造模及給藥方法同“2.6”項，收集細胞，按照核蛋白提取試劑盒說明書分別提取細胞漿蛋白及細胞核蛋白。BCA測定蛋白濃度后，按“2.6”項下方法檢測細胞漿中的IκBα、p-IκBα及細胞核中的p65蛋白表達，并進行定量分析。

2.8 免疫熒光法檢測RAW264.7細胞中p65的核易位 細胞造模及給藥方法同“2.6”項，吸棄培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液洗3次，4%多聚甲醛在室溫固定20 min，0.1% Triton ×100 孵育10 min，1% FBS脫脂奶粉封閉30 min，p65一抗(1∶200)孵育過夜，PBS沖洗，F(xiàn)ITC標記的二抗(1∶2 000)避光孵育1 h，PBS洗3次，DAPI(0.5 mg/mL)孵育5 min，PBS洗3次，將細胞爬片取出，封片，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

3 結(jié)果

3.1 藏紫草醇提物對LPS誘導(dǎo)小鼠急性腹膜炎的作用 與空白組比較，LPS組小鼠腹腔灌洗液中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平均升高(P<0.01)；與LPS組比較，藏紫草醇提物組及地塞米松組小鼠腹腔灌洗液中炎癥因子水平均降低(P<0.05，P<0.01)，見表1。

表1 藏紫草醇提物對小鼠腹腔灌洗液中炎癥因子水平的影響

3.2 藏紫草醇提物對細胞活性的影響 如圖1所示，當藏紫草醇提物質(zhì)量濃度在100～400 μg/mL范圍內(nèi)時，對RAW264.7的細胞活性無明顯影響(P>0.05)；在800 μg/mL時，細胞存活率降低(P<0.05)，故本實驗選擇100～400 μg/mL。

注：與空白組比較，*P<0.05。

3.3 藏紫草醇提物對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞炎癥的作用 如表2所示，與空白組比較，LPS組細胞上清液NO、TNF-α、IL-6及PGE2水平升高(P<0.01)；與LPS組比較，藏紫草醇提物組細胞上清液上述炎癥因子水平降低(P<0.05，P<0.01)。

表2 藏紫草醇提物對細胞中炎癥因子表達的影響

3.4 藏紫草醇提物對細胞中iNOS和COX-2表達的影響 如圖2、表3所示，與空白組比較，LPS組細胞iNOS、COX-2表達升高(P<0.01)；與LPS組比較，藏紫草醇提物組iNOS、COX-2表達降低(P<0.05，P<0.01)。

圖2 藏紫草醇提物對細胞中iNOS、COX-2表達的影響

表3 各組iNOS、COX-2蛋白表達

3.5 藏紫草醇提物對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞中NF-κB活化的作用 如圖3、表4所示，與空白組比較，LPS組NF-κB(p65)表達升高(P<0.01)；與LPS組比較，藏紫草醇提物組p65表達降低(P<0.05，P<0.01)。與空白組比較，LPS組p-IκBα表達升高，IκBα的表達降低，p-IκBα與IκBα比值升高(P<0.01)；與LPS組比較，藏紫草醇提物組能抑制p-IκBα表達，促進IκBα表達，p-IκBα與IκBα比值呈劑量依賴性降低(P<0.05，P<0.01)。如圖4所示，與空白組比較，LPS組p65表達升高；與LPS組比較，藏紫草醇提物組p65表達降低。

圖3 藏紫草醇提物對巨噬細胞中NF-κB活化的影響

表4 各組細胞NF-κB蛋白表達

注：綠色為p65陽性染色，藍色為DAPI細胞核陽性染色。

4 討論

炎癥反應(yīng)是一種重要的機體防御過程，涉及機體活動的多個環(huán)節(jié)，其中免疫細胞激活是炎癥反應(yīng)的啟動環(huán)節(jié)。巨噬細胞作為機體內(nèi)重要的非特異性免疫細胞，是機體抵抗外界侵染的重要防線[5]。

LPS水平的升高可以刺激巨噬細胞中iNOS和COX-2蛋白表達增加。其中iNOS催化L-精氨酸產(chǎn)生NO，COX-2則能催化花生四烯酸代謝轉(zhuǎn)化為前列腺素產(chǎn)物如PGE2，參與炎癥反應(yīng)[6-8]。實驗結(jié)果表明，藏紫草醇提物能夠抑制體內(nèi)外炎癥因子PGE2、TNF-α和IL-6等的異常上升，同時可以抑制巨噬細胞中炎iNOS和COX-2的蛋白過表達。

此外，LPS還能激活巨噬細胞中的NF-κB信號通路[9-10]。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在機體的免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)中具有十分重要的地位[11-12]。在靜息狀態(tài)下，NF-κB(p65)與 IκBα 結(jié)合，以無活性的復(fù)合物形式存在于細胞漿中；當細胞受到LPS等刺激時，IκBα就會磷酸化降解，使NF-κB與其解離后由細胞漿轉(zhuǎn)移到細胞核中，與κB位點結(jié)合，調(diào)控下游炎癥基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致多種細胞因子及趨化因子的表達，進而加重炎癥[13-14]。實驗結(jié)果顯示，藏紫草醇提物能夠濃度依賴性的抑制細胞核中p65和胞漿中p-IκBα的表達，促進胞漿中IκBα的表達。說明藏紫草醇提物能夠抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞中NF-κB的異?；罨?/p>

綜上所述，本課題組研究發(fā)現(xiàn)藏紫草醇提物可有效抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞炎癥以及小鼠急性腹膜炎，驗證了藏紫草的體內(nèi)外抗炎效果，并發(fā)現(xiàn)其機制可能是通過抑制NF-κB信號通路異?；罨M而發(fā)揮抗炎活性。此研究為藏紫草保護作用提供了理論依據(jù)，為綜合開發(fā)利用藏紫草資源奠定了基礎(chǔ)。