郭德鎮(zhèn) 黃傲 張勢(shì)域 成劍文 王宇鵬 閆加艷 黃曉武 樊嘉 楊欣榮 周儉

肝癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的癌癥之一，作為構(gòu)成全球癌癥相關(guān)死亡的第二大因素［1?2］，肝癌的總體5年生存率低于20%，在乙型病毒性肝炎流行的地區(qū)，5年生存率甚至僅為7%～9%［3］。盡管目前肝癌的診斷和監(jiān)測(cè)能力逐步提升，但仍然只有不到30%的初診患者有機(jī)會(huì)接受根治性手術(shù)切除。肝癌的根治性手術(shù)切除主要包括肝切除術(shù)和同種異體原位肝移植術(shù)。理論上，肝移植術(shù)是治療有肝硬化背景肝癌患者更徹底、更有效的手段，不僅能完全切除腫瘤和病變肝臟，還能有效治療潛在的肝硬化等基礎(chǔ)肝病。此外，肝移植術(shù)相比肝切除術(shù)還顯著降低了腫瘤的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，并改善患者的總體預(yù)后［4?5］。然而，盡管肝移植術(shù)顯著降低了復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，但即使按照最為嚴(yán)格的米蘭標(biāo)準(zhǔn)，也有4.3%的肝移植患者在5年內(nèi)復(fù)發(fā)［6］。隨著肝癌肝移植標(biāo)準(zhǔn)的放寬，術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率進(jìn)一步升高，達(dá)20.0%～57.8%［7］，這使患者在肝移植術(shù)后的長(zhǎng)期生存受到限制［8］。肝移植術(shù)后的腫瘤復(fù)發(fā)可能起源于潛伏在體內(nèi)的原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞，也可能來(lái)源于移植肝的新生腫瘤，鑒別復(fù)發(fā)腫瘤的來(lái)源能更好地指導(dǎo)后續(xù)治療選擇。

短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR），也被稱為微衛(wèi)星或簡(jiǎn)單重復(fù)序列，是由2～6個(gè)堿基構(gòu)成的核心序列經(jīng)串聯(lián)重復(fù)排列形成的一個(gè)核苷酸序列。STR廣泛存在于包括人類在內(nèi)的原核生物和真核生物中。在人類基因組中，大約有70萬(wàn)個(gè)STR位點(diǎn)，約占整個(gè)基因組的3%，其中大多數(shù)位于非編碼區(qū)，只有約8%位于編碼區(qū)［9?10］。由于核心序列的重復(fù)數(shù)目不同，STR在不同種族、不同人群之間的分布具有很大差異性。基于此產(chǎn)生的遺傳多態(tài)性，使STR分析被廣泛應(yīng)用于親子鑒定、細(xì)胞鑒定及法醫(yī)學(xué)鑒定等領(lǐng)域中［11］。本研究應(yīng)用STR分型鑒定技術(shù)，對(duì)1例肝癌肝移植術(shù)后超晚期復(fù)發(fā)的患者原發(fā)及復(fù)發(fā)腫瘤進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)估STR分型在鑒定肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)腫瘤來(lái)源中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器

QIAampDNA FFPE Tissue Kit試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司、GlobalFiler? PCR擴(kuò)增試劑盒、9700型聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增儀及3500XL型測(cè)序儀均購(gòu)自美國(guó)AB公司、NanoDrop 1000微量紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Nanodrop公司。

1.2 樣本處理及DNA提取

組織樣本來(lái)自復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院行同種異體原位肝移植術(shù)的肝細(xì)胞癌合并乙肝肝硬化的1例患者，移植術(shù)后11年發(fā)現(xiàn)肝臟右后葉膈頂復(fù)發(fā)病灶并行手術(shù)切除。原發(fā)灶和復(fù)發(fā)灶的福爾馬林固定?石蠟包埋（formalin?fixed paraffin?embedded，F(xiàn)FPE）組織均取自復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科保存的病理蠟塊，切片厚度為5 μm。每組取2片樣品置于離心管中，各加入1 mL二甲苯振蕩混勻30 min，離心后棄上清液。然后再加入1mL無(wú)水乙醇后振蕩混勻，離心后棄去上清液。重復(fù)上述無(wú)水乙醇洗滌步驟1次。將沉淀置于室溫中揮發(fā)備用。

采用QIAGEN法提取樣本DNA，提取步驟嚴(yán)格按照產(chǎn)品操作手冊(cè)進(jìn)行。所獲得的DNA樣品經(jīng)過(guò)NanoDrop 1000微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量及純度分析。將濃度過(guò)高的樣品DNA進(jìn)行稀釋并測(cè)量稀釋后的濃度。

1.3 STR基因座檢測(cè)及分析

使用GlobalFilerTMPCR擴(kuò)增試劑盒對(duì)獲得的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)體系，在9700型聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增儀上進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用3500XL型測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳。用GeneMapperID?X軟件對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析。所檢測(cè)的基因座包括21個(gè)常染色體STR基因座（D3S1358、vWA、CSF1PO、TPOX、D8S1179、D21S11、D18S51、D2S441、D19S433、TH01、FGA、D22S1045、D5S818、D13S317、D7S820、SE33、D10S1248、D1S1656、D12S391、D2S1338、D16S539）和1個(gè)Y染色體STR基因座（DYS391）。

2 結(jié)果

2.1 患者病史摘要

患者，男性，68歲，1975年患急性乙型病毒性肝炎，對(duì)癥治療后病情好轉(zhuǎn)，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶恢復(fù)正常?；颊咭?guī)律隨訪至1992年，超聲提示肝占位，同時(shí)甲胎蛋白（alpha?fetoprotein，AFP）水平升高至219.0 ng/mL；CT檢查發(fā)現(xiàn)肝右葉兩處占位，直徑分別為2 cm和3 cm。結(jié)合病史考慮“原發(fā)性肝癌”，于1992年12月行肝右葉部分切除術(shù)，病理證實(shí)為中分化肝細(xì)胞癌。術(shù)后定期隨訪至2003年后發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，行6次經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞術(shù)（transarterial chemoembolization，TACE）控制腫瘤，并于2004年10月接受同種異體原位肝移植術(shù)，術(shù)后病理示肝細(xì)胞癌。

肝移植術(shù)后口服他克莫司抗排異，采用拉米夫定聯(lián)合乙肝免疫球蛋白抗病毒，并行數(shù)次系統(tǒng)化療預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。2014年12月，常規(guī)隨訪發(fā)現(xiàn)AFP異常升高（30.6 ng/mL）、肝功能正常，CT和MRI檢查未發(fā)現(xiàn)肝占位病灶（圖1A）。4個(gè)月后隨訪AFP升高至82.0 ng/mL，肝功能仍然正常，胃鏡和腸鏡檢查未見(jiàn)異常；MRI檢查提示肝右葉包膜下有一結(jié)節(jié)病灶（圖1B）。為了鑒別該病灶的良惡性，同時(shí)尋找其他潛在病灶，進(jìn)一步行PET?CT，病灶未出現(xiàn)氟脫氧葡萄糖（F?deoxyglucose，F(xiàn)DG）濃聚，其余肝臟和肝外器官也未發(fā)現(xiàn)FDG異常濃聚。基于此建議患者行腹腔鏡下肝部分切除術(shù)，但患者選擇繼續(xù)隨訪觀察。2個(gè)月后，患者AFP升高至141.6 ng/mL，肝內(nèi)病灶較前增大（圖1C），遂接受手術(shù)治療，術(shù)中探查腫瘤位于右膈肌與肝包膜間，包膜完整，大小約2 cm×1.5 cm×1.5 cm，術(shù)后病理證實(shí)為肝細(xì)胞癌。術(shù)后2周復(fù)查發(fā)現(xiàn)AFP水平明顯下降（26.1 ng/mL），術(shù)后1個(gè)月復(fù)查AFP水平為2.9 ng/mL，其余所有實(shí)驗(yàn)室檢查和影像學(xué)檢查結(jié)果均正常（圖1D）?；颊唠S訪至今，未發(fā)現(xiàn)AFP異常升高或其他復(fù)發(fā)跡象。考慮患者發(fā)現(xiàn)肝外轉(zhuǎn)移時(shí)肝內(nèi)未見(jiàn)明顯腫瘤病灶，因此認(rèn)為該轉(zhuǎn)移灶來(lái)源于移植肝新發(fā)病灶的可能性較小，同時(shí)病理形態(tài)也證實(shí)與2004年肝移植術(shù)后的病理組織形態(tài)相符，因此考慮該轉(zhuǎn)移灶來(lái)源于原發(fā)腫瘤播散定植的腫瘤細(xì)胞。

圖1 患者不同時(shí)期的上腹部影像學(xué)表現(xiàn)Fig.1 Imaging findings at different stages of disease course

2.2 原發(fā)灶和復(fù)發(fā)灶的STR分型對(duì)比

本例患者的特征雖然極大程度上排除了復(fù)發(fā)灶源自移植物新發(fā)（de novo）腫瘤的可能性，但是原發(fā)腫瘤播散出去的腫瘤細(xì)胞在休眠11年后再次復(fù)發(fā)也較為罕見(jiàn)。為了確定該復(fù)發(fā)病灶的來(lái)源，本研究進(jìn)一步對(duì)復(fù)發(fā)灶和原發(fā)灶的腫瘤組織進(jìn)行DNA提取和STR基因座分型檢測(cè)。對(duì)前述STR基因座進(jìn)行檢測(cè)，分型圖譜上1個(gè)位點(diǎn)顯示1個(gè)峰時(shí)，表示該基因座為純合子基因型；若顯示2個(gè)峰，表示該基因座為雜合子基因型。

原發(fā)灶和復(fù)發(fā)灶的STR分型結(jié)果顯示，兩者檢出的15個(gè)染色體 STR 基因座（D3S1358、vWA、D8S1179、D21S11、D18S51、D2S441、D19S433、TH01、FGA、D22S1045、D5S818、D13S317、D10S1248、D1S1656、D12S391）的基因型均完全一致（表1、圖2）。另有7個(gè)STR基因座出現(xiàn)丟失，可能由FFPE樣本的DNA降解所致。由此計(jì)算出2例樣本為同一來(lái)源的似然率為2.28×1018。依據(jù)該結(jié)果，支持原發(fā)灶和復(fù)發(fā)灶為同一人來(lái)源，即該復(fù)發(fā)灶來(lái)源于原發(fā)灶的播散腫瘤細(xì)胞，而不是起源于移植肝的新發(fā)病灶。STR分型的結(jié)果與臨床推斷結(jié)論相一致，提示STR分型或可作為臨床中鑒別肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移腫瘤起源的有效方法。

圖2 典型位點(diǎn)STR分型結(jié)果Fig.2 Representatives of STR analysis results

3 討論

肝癌肝移植術(shù)后約20%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，導(dǎo)致病情難以控制，生存時(shí)間大大縮短［12］。而術(shù)后復(fù)發(fā)最常見(jiàn)的類型為早期復(fù)發(fā)（肝移植術(shù)后1年內(nèi)），主要起源于原發(fā)腫瘤病灶術(shù)前及術(shù)中釋放出的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，此類復(fù)發(fā)病灶與原發(fā)灶有相同的遺傳背景，同時(shí)預(yù)示患者預(yù)后較差［13］。與早期復(fù)發(fā)相反，晚期復(fù)發(fā)（肝移植術(shù)1年后）較為少見(jiàn)，可能的機(jī)制一是移植肝在乙型肝炎病毒（HBV）感染背景下出現(xiàn)新發(fā)腫瘤；二是原腫瘤播散出的腫瘤細(xì)胞在長(zhǎng)期休眠后被激活導(dǎo)致復(fù)發(fā)［14］。研究表明，肝移植患者發(fā)生晚期復(fù)發(fā)后，仍然能獲得良好的預(yù)后［15?16］。據(jù)報(bào)道，早期復(fù)發(fā)和晚期復(fù)發(fā)的患者有相似的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和病理學(xué)特征［17］，因此除非做基因檢測(cè)對(duì)比復(fù)發(fā)灶和原發(fā)腫瘤的表型，否則幾乎不可能判斷復(fù)發(fā)來(lái)源。

目前，對(duì)肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)的治療仍存在爭(zhēng)議，理論上，治療原發(fā)性肝癌的所有手段都可以用于治療復(fù)發(fā)患者。盡管適合再次手術(shù)切除的患者比例不高，但是手術(shù)切除仍然是單復(fù)發(fā)腫瘤患者可行的治療手段［18］，在晚期復(fù)發(fā)患者中也可能獲得較好的預(yù)后［15，19］。本例患者血清AFP水平在手術(shù)切除復(fù)發(fā)灶后短期內(nèi)很快下降至正常水平，術(shù)后長(zhǎng)期隨訪未發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展。因此，原則上對(duì)于病灶可切除的患者，建議行手術(shù)切除，且手術(shù)切除與系統(tǒng)化療相結(jié)合可進(jìn)一步延長(zhǎng)復(fù)發(fā)患者的生存時(shí)間，即使是對(duì)于多器官轉(zhuǎn)移的復(fù)發(fā)患者仍有一定效果［20］。還有研究報(bào)道，局部治療，例如射頻消融、放療和TACE等都可以作為肝移植術(shù)后肝內(nèi)復(fù)發(fā)患者的治療選擇，但僅限于沒(méi)有嚴(yán)重并發(fā)癥的患者［21］。索拉非尼既往也被應(yīng)用于肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)患者的治療，但其療效存在爭(zhēng)議［22?23］，而且大部分患者因出現(xiàn)毒副反應(yīng)，致使減少劑量甚至停藥［24］。靶向治療可以根據(jù)腫瘤的分子通路設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，進(jìn)行個(gè)體化治療，也是一種有前景的治療手段［25］。因此，鑒別復(fù)發(fā)腫瘤的來(lái)源對(duì)選擇有效的藥物治療十分關(guān)鍵。

肝移植術(shù)后晚期復(fù)發(fā)較少見(jiàn)，手術(shù)10年后超晚期復(fù)發(fā)更是極為罕見(jiàn)。復(fù)習(xí)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，PECCHI［26］在165例肝癌患者中發(fā)現(xiàn)3例晚期復(fù)發(fā)患者，CHOK等［27］報(bào)道的晚期復(fù)發(fā)率約為5%（7/139）。與之相反，在SCHLITT等［28］的研究中，20%的患者在接受肝移植術(shù)3年后發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)。CHEN等［29］報(bào)道了1例罕見(jiàn)病例，患者接受肝移植術(shù)后第3年出現(xiàn)肺和腎上腺異位復(fù)發(fā)。GOLDARACENA等［30］也記錄了1例特殊病例，患者在術(shù)后第36個(gè)月時(shí)發(fā)生肝細(xì)胞癌的口腔異位復(fù)發(fā)。SCHREIBMAN等［31］發(fā)現(xiàn)1例肝移植術(shù)6.5年后復(fù)發(fā)病例，患者伴有丙肝相關(guān)肝硬化，最后確認(rèn)復(fù)發(fā)腫瘤來(lái)源于原發(fā)腫瘤。CASTROAGUDíN等［32］報(bào)道了3例晚期復(fù)發(fā)患者，分別復(fù)發(fā)于術(shù)后7年，9年和10年；通過(guò)對(duì)比原發(fā)腫瘤和復(fù)發(fā)灶的遺傳表型，PIARDI等［33］確認(rèn)該患者為肝移植術(shù)8年后原發(fā)腫瘤復(fù)發(fā)。BHOORI等［25］報(bào)道1例肝移植術(shù)11年后出現(xiàn)肝內(nèi)和肝外復(fù)發(fā)病例，STR分型證實(shí)復(fù)發(fā)灶來(lái)源于原發(fā)腫瘤。NAVARRO BURGOS 等［34］記錄了1例肝移植術(shù)后9個(gè)月復(fù)發(fā)肝癌，同時(shí)發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移病例，通過(guò)熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)示腫瘤細(xì)胞來(lái)自原發(fā)腫瘤。在TAMè等［35］觀察的病例中，第1例患者在移植術(shù)后5年復(fù)發(fā)，STR檢測(cè)提示為供體來(lái)源；第2例患者因繼發(fā)性硬化性膽管炎行移植術(shù)，術(shù)后6年腫瘤復(fù)發(fā)，經(jīng)STR和熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)顯示為受體來(lái)源。SAAB等［36］報(bào)道1例因丙型病毒性肝炎肝硬化行肝移植的病例，患者在術(shù)后19年出現(xiàn)肝癌復(fù)發(fā)，這也是目前為止報(bào)道的肝移植術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)時(shí)間最晚的病例。

肝移植患者在術(shù)后發(fā)生晚期復(fù)發(fā)的原因尚不清楚。盡管有研究表明，相比其他高危因素，乙型病毒性肝炎相關(guān)的肝癌患者在肝移植術(shù)后更容易出現(xiàn)晚期腫瘤復(fù)發(fā)［37］，但本文報(bào)道的患者進(jìn)行了長(zhǎng)期的抗病毒治療，其HBV DNA指標(biāo)在病程中一直為陰性。此外，基因表型已經(jīng)證明復(fù)發(fā)灶來(lái)源于原發(fā)腫瘤，進(jìn)一步排除了移植肝新發(fā)腫瘤的可能。肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)可能是由于原發(fā)腫瘤微轉(zhuǎn)移灶增殖或循環(huán)腫瘤細(xì)胞再定植［38］。有研究報(bào)道，肝移植前接受TACE會(huì)增加腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)［39］。然而，本例患者在接受肝移植術(shù)前多次行TACE并有效地控制了腫瘤進(jìn)展，病理檢查也未見(jiàn)肝內(nèi)腫瘤細(xì)胞存活灶，且該患者也未發(fā)生早期復(fù)發(fā)，與其他文獻(xiàn)報(bào)道一致［40］。因此，推測(cè)本例患者超晚期復(fù)發(fā)的腫瘤起源于釋放至外周血的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，且這些循環(huán)細(xì)胞在局部定植后處于休眠狀態(tài)直至形成影像可見(jiàn)病灶。然而，這些播散出來(lái)的腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間保持休眠狀態(tài)，而隨后又出現(xiàn)活性并形成復(fù)發(fā)的原因有待進(jìn)一步探究。

本研究采用STR分型對(duì)肝癌肝移植術(shù)后超晚期復(fù)發(fā)灶的來(lái)源進(jìn)行鑒定，能夠有效區(qū)分復(fù)發(fā)灶的克隆起源，證實(shí)STR分型是有效鑒定肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)灶來(lái)源的方法。同時(shí)也表明肝癌肝移植患者存在術(shù)后超晚期腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的可能，而對(duì)單一復(fù)發(fā)病灶行手術(shù)切除仍能取得較理想的效果，凸顯了肝移植術(shù)后長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)和及時(shí)干預(yù)的必要性，也為肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的個(gè)體化治療提供了思路。