蘭菲菲 梁杰 胡聽(tīng)聽(tīng) 陳延冰 杜麗 張彥 尹愛(ài)華

短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat, STR)是人類(lèi)重要的遺傳學(xué)標(biāo)記，由2～6個(gè)堿基組成核心序列，其串聯(lián)重復(fù)次數(shù)不同形成長(zhǎng)度不等的等位基因，構(gòu)成個(gè)體差異和遺傳多態(tài)性[1]。STR基因座具有分布廣泛、多個(gè)基因座聯(lián)合應(yīng)用有較高非父排除率及多態(tài)性高等特點(diǎn)[2]。由于其遵循孟德?tīng)栠z傳規(guī)律且檢測(cè)方便快捷，目前STR基因座的檢測(cè)分析廣泛應(yīng)用于親子鑒定或個(gè)體識(shí)別的科學(xué)研究及鑒定實(shí)踐中。鑒定的實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)STR基因座發(fā)生突變的情況較常見(jiàn)，且不同STR基因座的突變率有所不同[3]。有研究比較了國(guó)內(nèi)不同地區(qū)人群的突變率，發(fā)現(xiàn)個(gè)別STR基因座在不同人群中的突變率也存在一定差異[4-5]。在STR基因座的突變情況中，父源突變較常見(jiàn)，母源突變發(fā)生率相對(duì)較低，文獻(xiàn)報(bào)道的父源突變與母源突變比例平均約為3∶1[6-8]。由于母源性突變對(duì)鑒定結(jié)論及親權(quán)指數(shù)計(jì)算的影響較復(fù)雜，在鑒定實(shí)踐時(shí)應(yīng)多予以關(guān)注。本文采用PowerPlex?21試劑盒檢測(cè)20個(gè)常染色體STR基因座，觀察分析10 271例親子鑒定案例中STR基因座母源突變現(xiàn)象和特點(diǎn)，探討母源突變基因座親權(quán)指數(shù)計(jì)算方法，為法醫(yī)物證的鑒定實(shí)踐提供參考，豐富廣東省漢族人群STR基因座的母源突變數(shù)據(jù)。

資料與方法

一、資料

血液、頭發(fā)、羊水樣本來(lái)源于廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心司法鑒定所日常受理檢測(cè)的10 271例用于司法用途與個(gè)人了解的親子鑒定案例，被檢測(cè)對(duì)象為廣東省漢族人群，簽署知情同意書(shū)后采集受檢者外周血或頭發(fā)樣本，羊水樣本由醫(yī)學(xué)遺傳中心產(chǎn)前診斷醫(yī)生采集。

二、 實(shí)驗(yàn)方法

1.DNA提取：實(shí)驗(yàn)血液與羊水樣本應(yīng)用Chelex-100法提取基因組DNA。滅菌的1.5 mL的離心管中加入1 mL滅菌純凈水，每個(gè)樣本加入混合均勻的2 μL全血(羊水樣本則在1.5 mL離心管中直接加入1 000 μL吹打混合均勻的羊水混懸液)，在震蕩儀上劇烈震蕩30 s后室溫放置30 min。低溫離心機(jī)中12 000 rpm離心3 min，丟棄上清液收集沉淀細(xì)胞。每個(gè)樣本管中加入200 μL 5%的Chelex-100混懸溶液(頭發(fā)樣本將毛囊部位剪下浸泡于Chelex-100混懸溶液中)，劇烈震蕩15 s后瞬時(shí)離心，放入恒溫水浴箱中56℃孵育30 min后，移至100℃水浴中煮沸8 min，震蕩完畢放入低溫離心機(jī)中13 000 rpm離心3 min，吸取上清DNA約100 μL于新的1.5 mL滅菌離心管中保存于-20℃冰箱備用。

2.PCR復(fù)合擴(kuò)增20個(gè)STR基因座的等位基因：采用Powerplex?21擴(kuò)增試劑盒(美國(guó)Promega公司)，按照操作說(shuō)明書(shū)在一個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行20個(gè)常染色體(D1S1656、D2S1338、D3S1358等)和1個(gè)性染色體(Amelogenin)STR基因座多重等位基因位點(diǎn)的PCR復(fù)合擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為Master Mix 5 μL；Primer Pair Mix 5 μL；DNA模板1 μL；超純水14 μL。擴(kuò)增條件為96℃ 1 min；(94℃ 10 s—59℃ 1 min—72℃ 30 s)30 cycles; 60℃ 10 min。

3.STR基因座的等位基因分型：對(duì)擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，配制反應(yīng)體系為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL；甲酰胺9 μL ；Powerplex?21試劑盒內(nèi)標(biāo)0.5 μL。充分混合均勻后，95℃變性3 min，立即放在冰上冷卻3 min，用3500XL基因分析儀(美國(guó)AB公司)完成毛細(xì)管電泳。按照Powerplex?21試劑盒的操作說(shuō)明，利用GeneMapper?ID-X軟件(美國(guó)AB公司)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)給出的軟件參數(shù)設(shè)置，分析毛細(xì)管電泳數(shù)據(jù)，以Powerplex?21試劑盒中的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物(Allelic Ladder)作為分析參照，得到每個(gè)樣本21個(gè)STR基因座的等位基因分型。

4. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：分析母親與孩子是否存在親子關(guān)系，對(duì)于確定親子關(guān)系的案件(累積親權(quán)指數(shù)大于10 000)，孩子STR基因座的等位基因在母親STR基因座的等位基因中找不到來(lái)源的，不符合孟德?tīng)栠z傳定律時(shí)，則發(fā)生了母源突變，突變步數(shù)為STR基因座的核心重復(fù)序列增加或者減少的單位數(shù)量。統(tǒng)計(jì)發(fā)生突變基因座的數(shù)量及比例、突變步數(shù)、突變等位基因片段大小及其所占比例。

結(jié) 果

一、STR基因座母源突變情況分析

在Powerplex?21體系的20個(gè)STR常染色體基因座中，18個(gè)基因座發(fā)生了母源突變，D21S11發(fā)生突變的比例最高，占總突變數(shù)量的17.4%，其次是D12S391(15.1%)與PentaE(11.6%)，其他15個(gè)基因座突變數(shù)量小于10例(表1)，基因座的突變比例有所不同。

表1 18個(gè)母源性突變STR基因座的突變率與突變比例Table 1 Mutation rate and mutation ratio of 18 maternal mutant STR loci

如表2所示，在觀察到的86例突變中，大部分均為一步突變95.4%，兩步突變和三步突變各有2例，占比2.3%。在突變基因座的等位基因中，核心重復(fù)序列增加的有44例(51.2%)，減少的為28例(32.6%)，未能明確的有14例(16.3%)。其中兩步突變?cè)黾优c減少2個(gè)重復(fù)序列各有1例，三步突變的2例均為增加3個(gè)重復(fù)序列。在86例母源突變的STR基因座中，發(fā)生在短等位基因的2例(2.3%)，中等位基因的75例(87.2%)，長(zhǎng)等位基因9例(10.5%)(表2)。

二、增加STR基因座檢測(cè)對(duì)STR基因座母源突變親權(quán)指數(shù)的影響

如表3所見(jiàn)，本文中觀察到的一步突變均無(wú)需增加STR基因座檢測(cè)，包括計(jì)算的突變STR基因座親權(quán)指數(shù)在內(nèi)，即可達(dá)到結(jié)果判讀要求(累積親權(quán)指數(shù)大于10 000為支持親子關(guān)系；累積親權(quán)指數(shù)小于10 000為排除親子關(guān)系)[9]，其累積親權(quán)指數(shù)范圍為104～1011。兩步突變及三步突變對(duì)STR基因座親權(quán)指數(shù)數(shù)值影響較大，需增加STR基因座檢測(cè)數(shù)量以得到正確鑒定結(jié)果與結(jié)論。

表4中STR基因座突變案件中，包含突變STR基因座在內(nèi)的Powerplex?21體系20個(gè)常染色體STR基因座的累積親權(quán)指數(shù)未大于10 000，無(wú)法達(dá)到鑒定結(jié)果判讀條件，采用STR-typer10G(珠?？频巧锕こ逃邢薰?或MicroreaderTM23sp ID體系(蘇州閱微基因技術(shù)有限公司)增加STR基因座的擴(kuò)增檢測(cè)，經(jīng)過(guò)計(jì)算增加檢測(cè)后兩個(gè)體系的全部STR基因座累積親權(quán)指數(shù)，均能夠得出支持親子關(guān)系的鑒定結(jié)論。

表2 STR基因座母源突變的特點(diǎn)Table 2 Maternal mutation characteristics of STR loci

表3 54例母源性基因座突變情況及親權(quán)指數(shù)計(jì)算Table 3 Mutation of maternal loci and paternity index calculation in 54 cases

表3(續(xù))

表4 增加STR基因座檢測(cè)后鑒定結(jié)論明確的案件分析Table 4 Cases analysis of precise conclusion by adding STR loci detection

表4(續(xù))

三、突變基因座的親權(quán)指數(shù)計(jì)算

根據(jù)《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》[9]的要求，突變的STR基因座應(yīng)參與計(jì)算累積親權(quán)指數(shù)，因此，發(fā)生母源突變的STR基因座應(yīng)按照不同情形分別計(jì)算其親權(quán)指數(shù)，具體情形及計(jì)算公式可參見(jiàn)圖1。

圖1 母源突變STR基因座的親權(quán)指數(shù)計(jì)算Figure 1 Paternity index calculation of maternal mutant STR loci

討 論

STR基因座的突變?cè)诜ㄡt(yī)物證鑒定實(shí)踐中較常見(jiàn)，國(guó)內(nèi)外均有關(guān)于不同STR基因座的突變報(bào)道[10]。STR基因座的突變以逐步突變模式為主，目前普遍認(rèn)為其發(fā)生機(jī)制是由于DNA在復(fù)制過(guò)程中發(fā)生滑動(dòng)或者錯(cuò)配而導(dǎo)致STR基因座重復(fù)單位數(shù)目的變化，主要表現(xiàn)為增加或者減少一個(gè)重復(fù)單位的一步突變，約占突變現(xiàn)象的90%[11]。重復(fù)單位數(shù)目多的基因座片段長(zhǎng)度相對(duì)較大，觀察到的突變現(xiàn)象較多[12]。由于精子與卵細(xì)胞在分化過(guò)程中的細(xì)胞分裂次數(shù)不同，STR基因座突變中也存在突變來(lái)源的性別差異，精細(xì)胞發(fā)生的DNA復(fù)制多，發(fā)生滑動(dòng)或者錯(cuò)配的幾率相對(duì)較大，來(lái)自父親的父源性突變發(fā)生率較母源性突變高[13]。中國(guó)不同地區(qū)人群STR基因座等位基因頻率具有一定差異，因此，不同地區(qū)人群STR基因座突變率也有所不同，研究發(fā)現(xiàn)河南省漢族人群的Penta E、D6S1043及D12S391等基因座突變率與北方地區(qū)、廣東省、云南省人群有顯著性差異[14-15]。而在STR基因座突變相關(guān)的研究中，常染色體STR基因座母源性突變特點(diǎn)的分析及親權(quán)指數(shù)計(jì)算鮮有報(bào)道。

PowerPlex?21體系是親子鑒定案件應(yīng)用較廣泛的檢測(cè)試劑盒，包括20個(gè)常染色體STR位點(diǎn)和1個(gè)性染色體位點(diǎn)，目前對(duì)該試劑盒STR基因座母源性突變的專(zhuān)題報(bào)道較少見(jiàn)。本機(jī)構(gòu)自2013年開(kāi)始在鑒定實(shí)踐檢案中應(yīng)用PowerPlex?21試劑盒，在本文中觀察了10 271例親子鑒定案例突變情況，發(fā)現(xiàn)了86例STR基因座的突變來(lái)源于母親，突變率在0.003%～0.05%之間。其中82例為一步突變，兩步突變與三步突變各2例。

一、STR基因座突變的真實(shí)性分析在應(yīng)對(duì)母源性STR突變位點(diǎn)的作用

STR基因座突變的本質(zhì)是不符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律的現(xiàn)象，是在鑒定案件存在親子關(guān)系的考慮下，個(gè)別出現(xiàn)不符合遺傳規(guī)律的STR基因座。因此，真實(shí)發(fā)生的STR基因座突變與所用的檢測(cè)試劑盒無(wú)相關(guān)性，不同試劑盒檢測(cè)到的突變STR基因座等位基因分型應(yīng)相同，遇到STR基因座突變時(shí)條件允許可利用不同檢測(cè)體系進(jìn)行確認(rèn)。同時(shí)觀察分析突變STR基因座的峰高和峰面積，排除STR基因座發(fā)生了等位基因丟失現(xiàn)象[16]。

二、突變STR基因座的親權(quán)指數(shù)計(jì)算在應(yīng)對(duì)母源性STR突變位點(diǎn)的作用

親子鑒定的父權(quán)指數(shù)計(jì)算是基于母親為生物學(xué)母親的前提，母親如果存在不符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律的STR基因座等位基因，考慮可能存在以下兩種情況。

1.母親是生物學(xué)母親，不符合遺傳規(guī)律的STR基因座為母源性突變，可根據(jù)三聯(lián)體親子鑒定或二聯(lián)體親子鑒定進(jìn)行計(jì)算，具體為：(1)父母子三聯(lián)體的親子鑒定，要求鑒定是否為生物學(xué)父親時(shí)，母親STR基因座突變可以考慮先分析母親與孩子的親子關(guān)系，確定為生物學(xué)母親后，根據(jù)《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》[9]中三聯(lián)體不符合遺傳規(guī)律的親權(quán)指數(shù)計(jì)算方法計(jì)算突變STR基因座的父權(quán)指數(shù)。(2)只有母親與孩子參與的二聯(lián)體親子鑒定，突變基因座的親權(quán)指數(shù)按照《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》[9]中二聯(lián)體不符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律情形時(shí)的公式計(jì)算，分為幾種情況(以發(fā)生一步突變?yōu)榍疤?，即①母親與孩子均為雜合子，PI=μm/(8Pb) ；例如表3中D2S1338基因座，母親等位基因分型為20, 25，孩子為18, 19，PI=μ/(8P19)。②母親為純合子，孩子為雜合子或者母親為雜合孩子為純合，PI=μm/(4Pb)；例如表3中D5S818基因座，母親分型為9, 12，孩子分型為13，PI=μ/(4P13)。③母親與孩子均為純合子或母親是雜合孩子是純合且有兩種等位基因突變可能性，PI=μm/(2Pb)；例如表4中TPOX基因座母親分型為9，孩子分型為9，PI=μ/(2P9)。④母親與孩子均為雜合子，兩個(gè)等位基因均發(fā)生了突變，PI=μm(Pa+Pb) /(8PaPb)；例如表4中FGA基因座，母親分型為22, 24.2，孩子分型為21,23.2，PI=μ(P21+P23.2)/(8P21P23.2)。⑤母親為純合子，孩子為雜合子，且有兩種等位基因突變可能性，PI=μm(Pa+Pb) /(4PaPb)。⑥母親與孩子均為雜合子，但其中一個(gè)等位基因有兩種突變可能性，另一個(gè)等位基因有一種突變可能性，PI=μm(2Pa+Pb) /(8PaPb)。例如表4中D8S1179基因座，母親分型為15,17，孩子分型為14,16，PI=μ(2P14+P16)/(8P14P16)。Pa與Pb分別為孩子突變STR基因座等位基因a或b的頻率，μm為女性突變率，可取值0.0005[9]。

2.母親不是生物學(xué)母親，該情況可出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)STR基因座不符合遺傳規(guī)律。以下情形可能會(huì)導(dǎo)致該種情況的發(fā)生，例如委托人隱瞞真實(shí)情況，孩子是母親的近親；母親或孩子是嵌合體，體內(nèi)存在至少2種不同細(xì)胞系，外周血液基因型與身體其他器官基因型不相同，異源嵌合體案例及相關(guān)研究報(bào)道也是法醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)[17]。三聯(lián)體的親子鑒定案例，如果確定不是生物學(xué)母親，可按照雙親皆疑的方法計(jì)算父權(quán)指數(shù)[18]。二聯(lián)體親子鑒定案例可根據(jù)《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》[9]中二聯(lián)體不符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律情形時(shí)的公式計(jì)算親權(quán)指數(shù)。當(dāng)委托人隱瞞真實(shí)的情況下，鑒定結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)與肯定親子關(guān)系突變相類(lèi)似的結(jié)果，即只有個(gè)別基因座出現(xiàn)不符合遺傳規(guī)律現(xiàn)象，容易將實(shí)際是排除的基因座位點(diǎn)按照突變的方式處理，導(dǎo)致錯(cuò)誤的鑒定結(jié)論，可考慮加做STR基因座檢測(cè)位點(diǎn)以排除近親血緣關(guān)系的干擾，防止親子鑒定結(jié)果的誤判，得出正確的鑒定結(jié)論。

STR基因座母源性突變相對(duì)于父源突變具有發(fā)生率低、分析計(jì)算較復(fù)雜、易導(dǎo)致結(jié)果誤判等特點(diǎn)，本文在PowerPlex?21體系中觀察到廣東省人群發(fā)生的86例母源突變，涉及18個(gè)STR基因座，95.4%為一步突變，發(fā)生在中等位基因的突變較多(87.2%)，核心重復(fù)序列的增加導(dǎo)致的突變占多數(shù)51.2%。文中詳細(xì)分析了發(fā)生在不同情形時(shí)的母源突變STR基因座的親權(quán)指數(shù)計(jì)算，為應(yīng)對(duì)親子鑒定中母源突變STR基因座的鑒定案例提供參考，為豐富廣東省漢族人群母源STR突變數(shù)據(jù)庫(kù)提供遺傳信息支持。