賴家駿 周新棟 胡志偉 何盛泉 李定云 翁偉明 曾德強 朱曉峰 張濤 龍飛

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球第三大常見癌癥，也是第二大癌癥相關(guān)死亡原因［1］。據(jù)估計，我國2015年CRC的發(fā)病例數(shù)約為38.8萬例，死亡約為18.7萬例，均居全部惡性腫瘤前列［2］。因此，深入探討CRC發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找CRC早期診斷和復發(fā)轉(zhuǎn)移靶點具有重要意義。環(huán)狀RNAs（circular RNAs，circRNAs）是一類不具有5′末端帽子和3′末端多聚A尾巴，并以共價鍵形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNAs分子。circRNAs是一類新的內(nèi)源性RNAs，大量研究［3?5］顯示，circRNAs與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其在CRC中的作用也日益受到關(guān)注。本課題組前期從GEO數(shù)據(jù)庫的CRC circRNA芯片數(shù)據(jù)（GSE126094）［6］篩選出了237個在CRC組織中顯著上調(diào)的circRNAs（log2FC≥2，P＜0.05），其中包括circUGGT2（circBase ID為hsa_circ_0008274）。但是，circUGGT2對CRC生物學行為的影響尚未知。本研究在CRC組織和細胞系中檢測circUGGT2的表達，并探討其對CRC細胞增殖、遷移和侵襲的影響，以期為CRC診斷和治療尋找新的靶點。

1 材料和方法

1.1 組織標本、細胞系及主要試劑

收集2018年9月至2019年3月在粵北人民醫(yī)院胃腸外科接受手術(shù)治療的45例CRC患者的CRC組織和癌旁組織（距癌灶邊緣5 cm以上的結(jié)直腸黏膜組織）標本。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療等抗腫瘤治療。本研究通過粵北人民醫(yī)院倫理委員會審批，患者知情同意。

人正常結(jié)腸上皮細胞株NCM460和4種CRC細胞株HT29、HCT116、SW480、SW620均購自南京凱基生物技術(shù)股份有限公司。胎牛血清購自以色列Biologi?cal Industries公司；RPMI?1640培養(yǎng)基、McCoy′s 5A培養(yǎng)基、L15培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；TRIzol試劑、LipofectamineTM3000試劑均購自美國Invitrogen公司；核酶（RNase R）購自廣州吉賽生物科技股份有限公司；放線菌素D（Act.D）購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國Corning公司；引物均由北京擎科生物科技有限公司（長沙合成部）設計合成；特異性的小干擾RNA（si?circUGGT2）和相應的陰性對照（si?NC）均由蘇州吉瑪基因股份有限公司設計并合成。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

NCM460細胞在含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的RPMI?1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)；HT29和HCT116細胞在含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的McCoy′s 5A培養(yǎng)基中培養(yǎng)；SW480和SW620細胞在含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的L15培養(yǎng)基中培養(yǎng)。上述細胞均經(jīng)過STR鑒定，并置于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

選取處于對數(shù)生長期的SW480細胞接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染前予以正常換液，保證細胞狀態(tài)良好。待細胞密度約為70%時，按照LipofectamineTM3000試劑說明書的操作步驟，將si?circUGGT2和si?NC分別轉(zhuǎn)染到SW480細胞，孵育48 h后進行敲減效率驗證和后續(xù)的功能實驗。

1.3 qRT?PCR檢測circUGGT2和UGGT2mRNA的表達

使用TRIzol試劑提取組織和細胞中的總RNA，按照ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Re?mover試劑說明書的操作步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，再按照KOD SYBR?qPCR Mix試劑說明書的操作步驟進行qRT?PCR擴增。 PCR反應體系（20 μL/孔）：KOD SYBR?qPCR Mix 10 μL，正向引物和反向引物各 1 μL，ddH2O 6 μL，cDNA 模板 2 μL。PCR 反應條件：98℃預變性2 min；98℃變性10 s；60℃退火10 s；68℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用“相對定量法（2-△Ct）”計算相對表達量，采用2-△△Ct法計算倍數(shù)變化值（fold change，F(xiàn)C）。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 The sequences of the primers

1.4 核酶消化實驗和放線菌素D實驗

用3 U/μg的核酶處理SW480細胞的RNA，于37℃孵育15 min后等體積逆轉(zhuǎn)錄，再采用qRT?PCR分別檢測circUGGT2和UGGT2 mRNA的相對表達量。另將 SW480細胞接種在含放線菌素 D（5 μg/mL）的L15培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)0 h、4 h、8 h、12 h或24 h以抑制RNA的生成，然后在各個時間點分別提取細胞中的總RNA，采用qRT?PCR檢測circUGGT2和UGGT2 mRNA的相對剩余量（%）。qRT?PCR擴增方法同步驟1.3。

1.5 CCK?8實驗檢測細胞的增殖能力

將SW480細胞接種至96孔板中常規(guī)培養(yǎng)，每組設置5個復孔。分別于培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h時，向每孔加入濃度為10%的CCK?8試劑，于37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h后，使用多功能酶標儀檢測450 nm波長處的光密度（OD）值。

1.6 平板克隆形成實驗檢測細胞的增殖能力

將SW480細胞接種至6孔板（約1 000/孔）中，每組設置3個生物學重復。加入2 mL新鮮完全培養(yǎng)基，置于37℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3～4 d更換1次新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)10～12 d后，當孔中出現(xiàn)肉眼可見的細胞克隆球時，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，再用ddH2O洗去染色液，室溫下自然干燥。拍照并計數(shù)各孔中的克隆球（＞50細胞）數(shù)目。

1.7 劃痕實驗檢測細胞的遷移能力

將SW480細胞接種至6孔板（約7×105/孔）中，培養(yǎng)過夜。待其融合密度達到90%～100%時，用10 μL槍頭在細胞表面劃痕，保證每條劃痕粗細均勻一致。用PBS清洗3次，去除脫落的細胞，加入不含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于0 h、24 h和48 h進行拍照，觀察劃痕愈合的情況。

1.8 Transwell小室實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力

使用Transwell小室進行細胞遷移和侵襲實驗。對于侵襲實驗，預先在Transwell小室上室鋪被基質(zhì)膠。將SW480細胞接種至Transwell小室上室（約1×105/孔），培養(yǎng)基體積為200 μL，不含血清；下室加入600 μL含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基。37℃孵育36 h后取出小室，用4%多聚甲醛固定30 min，用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，再用濕棉簽輕輕拭去小室內(nèi)表面細胞。在Olymbus倒置顯微鏡下觀察并計算5個隨機視野中的遷移或侵襲細胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，Graph?Pad Prism 8.0軟件進行繪圖。計量資料采用均數(shù)±標準差表示；癌組織與癌旁組織中circUGGT2表達水平的比較采用配對樣本t檢驗，非配對設計兩組間均數(shù)比較則采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計學意義，則采用Dunnett′s檢驗進行多重比較；重復測量數(shù)據(jù)采用重復測量方差分析；分類資料比較采用χ2檢驗。以雙側(cè)P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 circUGGT2的鑒定

采用qRT?PCR對circUGGT2進行成環(huán)驗證和穩(wěn)定性檢測。從SW480細胞中提取其基因組DNA（gDNA）后，分別用circUGGT2的特異性擴增環(huán)狀RNA引物（divergent primers）和特異性擴增線性RNA引物（convergent primers）進行擴增，結(jié)果只有convergent primers能擴增出特異性產(chǎn)物，表明circUGGT2可能是UGGT2基因轉(zhuǎn)錄后通過反向剪接生成的circRNA，見圖1A。核酶消化實驗和放線菌素D實驗結(jié)果顯示，circUGGT2很耐核酶消化，而UGGT2 mRNA則幾乎被完全降解，見圖1B；且circUGGT2的降解速度明顯慢于UGGT2 mRNA（F=2133.00，P＜0.001），見圖1C。以上實驗結(jié)果表明，circUGGT2是一個典型的circRNA，且具有高度的穩(wěn)定性。

圖1 circUGGT2的鑒定Fig.1 Identification of circUGGT2

2.2 circUGGT2在CRC組織中的表達及其診斷效能

用qRT?PCR檢測45對CRC組織和癌旁組織中circUGGT2的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)circUGGT2在CRC組織中的表達水平明顯高于癌旁組織（t=4.13，P＜0.001），見圖2A。臨床病理分析結(jié)果顯示，circUGGT2的表達水平與CRC患者的腫瘤大小（χ2=5.15，P=0.023）、浸潤深度（χ2=4.08，P=0.044）和TNM分期（χ2=6.42，P=0.011）均有關(guān)，見表2。根據(jù)circUGGT2在45對CRC組織和癌旁組織中的檢測數(shù)據(jù)繪制ROC曲線，AUC為0.702（95%CI：0.595～0.809，P=0.001），提示circUGGT2具有較好的診斷效能，見圖2B。

圖2 circUGGT2在45對CRC組織及癌旁組織中的表達差異和診斷效能Fig.2 The expression differences and diagnostic efficiency of circUGGT2 in 45 pairs of CRC tissues and corresponding paracancerous tissues

表2 circUGGT2表達與CRC患者臨床病理特征的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis of circUGGT2 expression and clinico?pathological characteristics of CRC patients

2.3 沉默circUGGT2對CRC細胞增殖、遷移和侵襲的影響

用qRT?PCR檢測circUGGT2在人正常結(jié)腸上皮細胞株NCM460和4種CRC細胞HT29、HCT116、SW480、SW620中的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)circUGGT2在4種CRC細胞中的表達水平均高于NCM460細胞（t=32.63，P＜0.001；t=8.09，P＜0.001；t=67.61，P＜0.001；t=45.88，P＜0.001），尤其在SW480細胞中的表達水平最高，因此選擇SW480細胞進行后續(xù)的缺失功能實驗，見圖3A。

qRT?PCR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si?circUGGT2后，SW480細胞中circUGGT2的表達水平低于si?NC組（t=14.70，P＜0.001），提示circUGGT2敲減成功，見圖3B。CCK?8和平板克隆形成實驗結(jié)果顯示，沉默circUGGT2后SW480細胞增殖速率明顯降低（t24h=5.48，P＜0.001；t48h=8.98，P＜0.001；t72h=15.56，P＜0.001），平板克隆形成數(shù)目也明顯減少（t=9.72，P＜0.001），提示沉默circUGGT2可抑制CRC細胞增殖，見圖3C～D。劃痕實驗顯示，沉默circUGGT2后SW480細胞的劃痕愈合速率明顯降低（t24h=9.38，P＜0.001；t48h=8.24，P=0.001），見圖3E。Transwell小室實驗也顯示，沉默circUGGT2后SW480細胞的遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均明顯減少（t=23.07，P＜0.001；t=7.57，P=0.002），提示沉默circUGGT2抑制了CRC細胞的遷移和侵襲，見圖3F。

3 討論

通過高通量RNA測序或circRNA芯片檢測，同時結(jié)合生物信息學分析，研究者們篩選出成百上千個在CRC中異常表達的circRNAs，其中一些已經(jīng)被證實參與了CRC的發(fā)生發(fā)展［7?12］。例如，circRNA_001569在CRC組織中顯著上調(diào)，且可通過抑制miR?145上調(diào)E2F5、BAG4和FMNL2的表達，進而增強CRC細胞的增殖能力和侵襲能力［13］；hsa_circ_0020397能促進miR?138的靶基因TERT和PD?L1的表達，進而調(diào)節(jié)CRC細胞的活力、凋亡和侵襲［14］。根據(jù)circBase數(shù)據(jù)庫可知，circUGGT2屬于外顯子來源的circRNA，由UGGT2 mRNA的37和38號外顯子通過反向剪接生成，長度為244 bp。本研究采用qRT?PCR對circUGGT2進行成環(huán)驗證和穩(wěn)定性檢測，進一步證實circUGGT2是一個典型的circRNA，且具有高度的穩(wěn)定性。YE等［15］利用circRNA芯片篩選發(fā)現(xiàn)circUGGT2在CRC患者血漿中顯著上調(diào)。但目前circUGGT2在CRC中的作用尚未見報道。

circUGGT2與腫瘤作用的研究最先在甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）［16］中被報道。該研究發(fā)現(xiàn)circUGGT2在PTC組織中顯著上調(diào)，且與PTC患者的TNM分期與淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)；同時細胞功能實驗發(fā)現(xiàn)circUGGT2可通過激活AMPK/mTOR信號通路促進PTC細胞的增殖和侵襲。MA等［17］也發(fā)現(xiàn)circUGGT2在PTC中呈高表達，且與PTC患者的不良預后密切相關(guān)；circUGGT2可通過吸附miR?154?3p促進SLC7A11的表達，進而增強PTC細胞的惡性表型和皮下成瘤能力。此外，KONG等［18］發(fā)現(xiàn)circUGGT2在肝細胞癌中也呈高表達，并可通過調(diào)控miR?526b?5p/RAB1A軸促進肝細胞癌的發(fā)展。LIANG等［19］發(fā)現(xiàn)circUGGT2在肺腺癌中呈低表達，同時還在肺腺癌中構(gòu)建了基于circUGGT2的circRNA?miRNA?mRNA調(diào)控網(wǎng)絡?？梢姡琧ircUGGT2的表達和功能可能具有腫瘤異質(zhì)性。本研究通過對CRC的circRNA芯片數(shù)據(jù)（GSE126094）中的10對CRC組織及其癌旁組織中circRNAs的表達譜進行分析，發(fā)現(xiàn)circUGGT2在CRC組織中顯著上調(diào)，臨床組織樣本和體外細胞實驗亦證實circUGGT2在CRC中高表達，且高表達circUGGT2的CRC患者腫瘤更大、浸潤更深、TNM分期更晚；同時，circUGGT2對CRC還具有較好的診斷效能，可能是CRC潛在的診斷和治療新靶點。為研究circUGGT2在CRC中的作用，本研究進一步構(gòu)建沉默circUGGT2的CRC細胞模型，探討circUGGT2對CRC惡性生物學行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默circUGGT2可抑制CRC細胞增殖、遷移和侵襲，提示circUGGT2可能在CRC中發(fā)揮促癌作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明circUGGT2在CRC中高表達，沉默circUGGT2可抑制CRC細胞增殖、遷移和侵襲，有望成為CRC潛在的診斷和治療新靶點。但circUGGT2在正常組織、癌前病變和CRC組織，以及健康者血清、CRC患者術(shù)前和術(shù)后血清中的表達水平變化仍需擴大樣本進行驗證，同時circUGGT2在CRC中發(fā)揮生物學功能的分子機制也有待深入研究。