范阿慧 張瑞 周金池 何陽菘 樊代明 趙曉迪 盧瑗瑗

肝癌是全球第六大惡性腫瘤，也是第四大癌癥相關(guān)死亡原因［1］。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）約占原發(fā)性肝癌的90%，盡管近年來HCC的治療手段有了顯著改善，但發(fā)病率和死亡率仍較高［2］。因此，HCC患者的早期診斷和預(yù)后預(yù)測至關(guān)重要。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為增強(qiáng)子通過招募轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄水平。最近發(fā)現(xiàn)大多數(shù)活性增強(qiáng)子可以轉(zhuǎn)錄為eRNA，并在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用［3］。研究表明eRNA異常表達(dá)與癌基因［4］、腫瘤抑制基因［5］失調(diào)以及細(xì)胞對外部信號的異常反應(yīng)有關(guān)，如激素［6］、炎癥［7］、缺氧［8］，因此 eRNA有可能是潛在的診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。本研究根據(jù)HCC患者預(yù)后信息以及與預(yù)測靶基因表達(dá)相關(guān)性篩選出的eRNA構(gòu)建預(yù)后模型，同時對預(yù)后相關(guān)eRNA進(jìn)行臨床參數(shù)相關(guān)性分析和富集分析，以期為HCC的診斷和預(yù)后評估提供新的方向。

1 資材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

利用PreSTIGE算法，獲得eRNA以及預(yù)測靶基因列表［9?10］，并使用 EnsemblBioMart將轉(zhuǎn)錄本 ID 轉(zhuǎn)化為基因 Symbol。從 TCGA 數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.cancer.gov）收集374例HCC患者的基因序列和臨床數(shù)據(jù)。

1.2 篩選與HCC預(yù)后相關(guān)的eRNA

使用交互式網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器TANRIC（癌癥中非編碼RNA圖譜）對TCGA數(shù)據(jù)庫中的HCC隊(duì)列中eRNA的水平及其與臨床的相關(guān)性進(jìn)行研究。使用中位數(shù)法將TCGA數(shù)據(jù)庫中的HCC患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。使用TANRIC共表達(dá)數(shù)據(jù)評估eRNA水平與其預(yù)測目標(biāo)基因之間的相關(guān)性。與總生存期（overall survival，OS）（Log?rankP＜0.05）及其靶基因水平（r＞0.5，P＜0.001）相關(guān)的 eRNA，被認(rèn)為是HCC中的候選關(guān)鍵eRNA。

1.3 預(yù)后模型的構(gòu)建與評價

通過Lasso回歸分析獲得候選eRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)。采用多因素Cox回歸分析構(gòu)建eRNA的預(yù)后風(fēng)險評分模型。采用時間依賴性受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估模型的區(qū)分度。此外，為了預(yù)測患者1年、3年和5年的生存概率，采用R語言rms軟件包建立列線圖模型，并繪制校準(zhǔn)曲線，以評估模型預(yù)測值與實(shí)際觀測值之間的一致性。

1.4 HCC患者組織標(biāo)本獲取

選取2019年8月—2019年12月在空軍軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院肝膽胰外科收治的15例經(jīng)術(shù)后病理診斷為HCC患者的腫瘤組織及其癌旁組織，并提取RNA。本研究樣本的使用已通過本院倫理審核。

1.5 反轉(zhuǎn)錄及RT?qPCR

用TRIzol試劑盒提取上述細(xì)胞的總RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用SYBR Green Master mix試劑盒和C1000熱循環(huán)儀進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，選取GAPDH作為內(nèi)參。引物序列如下：DCP1A上游為5′-TCTGGACACAAGCATCTGACG-3′，下游為 5′-GGGTGGTGATTTCAGGCTGG-3′；GADPH上游為 5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游為5′-GAAGACTGTGGATGGCCCCT-3′。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 12 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共45個循環(huán)。所有檢測均在96孔板進(jìn)行，每個樣本設(shè)3個平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用2-△△Ct法對目的基因進(jìn)行表達(dá)量相對定量分析。

1.6 富集分析

應(yīng)用R軟件中的DOSE、ggplot2、cluster、GOplot等數(shù)據(jù)包來執(zhí)行GO分析和KEGG富集分析，并設(shè)置|log2（倍數(shù)變化）|＞0.5和P＜0.05作為納入標(biāo)準(zhǔn)。采用富集分析探索DCP1A的潛在分子機(jī)制和通路。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析探討DCP1A表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，采用Bonferroni檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均在IBM SPSS Statistics 25或R 3.6.3軟件（https：//www.r?project.org/）語言包中進(jìn)行。雙側(cè)P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 與HCC患者預(yù)后相關(guān)的eRNA的篩選

使用PreSTIGE算法，共鑒定出2 695個eRNA以及2 303個預(yù)測靶基因。該轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)集用于識別eRNA及其靶基因。為了便于TANRIC中的數(shù)據(jù)探索，使用Ensembl BioMart將轉(zhuǎn)錄本ID轉(zhuǎn)換為基因symbol。最后，根據(jù)TANRIC數(shù)據(jù)庫提供的374例TCGA中的HCC患者的RNA測序數(shù)據(jù)，患者基本情況見表1，并確定了與OS相關(guān)（Log?rankP＜0.05）的124個eRNA。其中27個eRNA同時與其預(yù)測的靶基因的mRNA水平呈正相關(guān)（r＞0.5，P＜0.001），見表2。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫HCC患者的臨床參數(shù)統(tǒng)計(jì)*Tab.1 Basic clinicopathologic features of the HCC patients in TCGA*

表2 關(guān)鍵eRNA列表Tab.2 List of key lncRNAs derived from enhancer

2.2 基于eRNAs預(yù)后模型的建立及驗(yàn)證

通過Lasso?Cox回歸分析保留10個eRNA用于構(gòu)建預(yù)后預(yù)測模型，見圖1A～C。其風(fēng)險評分公式如下：Risk score=0.090×DCP1A+0.231×SLC2A1?AS1+0.36×SLC25A24P1+0.888×SPRY4AS1+0.220×AP003469.2+0.221×SLC16A1?AS1+（-0.232）×AC093607.1+0.017×AL137803.1+0.015×LINC01184+（-0.081）×LINC00671。

繪制時間依賴性ROC曲線評估預(yù)測效能，結(jié)果顯示1年、3年和5年AUC分別為0.73、0.66、0.67（圖1D）。此外，本研究還構(gòu)建了列線圖模型（圖1E），并采用校準(zhǔn)曲線評估其一致性，結(jié)果顯示校正曲線接近對角線，表明預(yù)測值與實(shí)際觀測值之間具有良好的一致性（圖1F）。

圖1 基于eRNAs預(yù)后模型的建立及評估Fig.1 Development and evaluation of prognostic model based on eRNAs

2.3 DCP1A在HCC中的功能

在HCC患者中，DCP1A低表達(dá)組OS優(yōu)于高表達(dá)組（Log?rankP＜0.001），見圖2A。此外，DCP1A和靶基因 PRKCD（r=0.52，P＜0.001）、RFT1（r=0.51，P＜0.001）的mRNA水平呈正相關(guān)，見圖2B。為驗(yàn)證DCP1A在HCC患者中的表達(dá)，使用qPR?PCR檢測15例HCC患者中DCP1A的表達(dá)，與正常組織相比，癌組織中的DCP1A表達(dá)水平顯著升高（P=0.002），見圖2C。

圖2 DCP1A是HCC的關(guān)鍵eRNAFig.2 Impact of DCP1A on HCC

為進(jìn)一步評估DCP1A在HCC中的作用，本研究分析了DCP1A表達(dá)水平與臨床參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示，DCP1A表達(dá)水平與腫瘤狀態(tài)、病理學(xué)分級、臨床分期有關(guān)，其中癌組織中DCP1A表達(dá)水平高于正常組織（P=0.009），G3分級的癌組織中DCP1A表達(dá)水平高于G1級（P=0.001）和G2級（P=0.002），臨床分期為Ⅲ期的癌組織中DCP1A表達(dá)水平較Ⅰ期（P=0.003）和Ⅱ期（P=0.039）高，T3期癌組織中DCP1A表達(dá)水平高于T1期（P=0.014），見圖2D。提示DCP1A在HCC中可能發(fā)揮促癌功能。

2.4 GO和KEGG富集分析

采用GO分析預(yù)測DCP1A在生物過程（biological process，BP），細(xì)胞組分（cell component，CC）和分子功能（molecular function，MF）的富集情況。結(jié)果顯示，BP富集于染色質(zhì)的共價修飾、組蛋白修飾和DNA復(fù)制等；CC富集于核斑點(diǎn)、染色體區(qū)域及紡錘體等；MF富集于解旋酶活性、泛素化和組蛋白集合等，見圖3A。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，DCP1A主要富集在癌癥相關(guān)通路，如病毒致癌作用、癌癥中的蛋白多糖、細(xì)胞周期等，見圖3B。提示DCP1A可能通過發(fā)揮解旋酶、泛素化等活性，參與染色質(zhì)修飾等生物學(xué)過程，調(diào)控HCC的發(fā)生發(fā)展。

圖3 GO和KEGG富集分析Fig.3 GO and KEGG enrichment analysis

3 討論

eRNA是從轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子區(qū)域由RNApollⅡ轉(zhuǎn)錄的順式作用元件，屬于lncRNA的一種［3］。越來越多的研究證實(shí)了eRNA在癌癥診斷和預(yù)后預(yù)測中的可行性和有效性。近期一項(xiàng)大規(guī)模的臨床研究表明組織特異的eRNA通過t分布隨機(jī)鄰近嵌入（t?SNE）可準(zhǔn)確分辨癌癥類型，且eRNA不僅與患者生存率相關(guān)，還與臨床特征顯著相關(guān)，如亞型、分期、分級等［11］。相對于大規(guī)模的臨床研究而言，單一eRNA的臨床研究探索逐漸增多，但目前在HCC中尚未見eRNA相關(guān)報(bào)道。本研究主要結(jié)合eRNA和TCGA數(shù)據(jù)庫的基因序列和臨床數(shù)據(jù)探索eRNA與HCC之間的關(guān)系，首先將與HCC患者預(yù)后相關(guān)及與靶基因顯著相關(guān)作為篩選條件，最終選出27個關(guān)鍵eRNA；再通過Lasso回歸篩選出10個eRNA并構(gòu)建風(fēng)險模型預(yù)測HCC患者的預(yù)后，最后通過時間依賴性ROC曲線、校準(zhǔn)曲線評估預(yù)測模型的效能，證實(shí)了該模型在臨床中具有潛在應(yīng)用價值。同時還發(fā)現(xiàn)功能尚未注釋的eRNA?DCP1A與患者預(yù)后及靶基因顯著相關(guān)，進(jìn)一步分析DCP1A表達(dá)水平與HCC患者臨床參數(shù)的相關(guān)性，并進(jìn)行GO和KEGG富集分析，以探索DCP1A發(fā)揮作用的潛在分子機(jī)制和靶點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DCP1A表達(dá)水平與HCC患者腫瘤狀態(tài)、病理分級及臨床分期相關(guān)，提示DCP1A可能在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮促進(jìn)作用。GO分析結(jié)果顯示DCP1A主要位于細(xì)胞核內(nèi)，且可能通過與染色質(zhì)和組蛋白相互作用發(fā)揮功能，并影響DNA復(fù)制以及修復(fù)過程。KEGG分析提示DCP1A與多種癌癥相關(guān)通路有關(guān)，如病毒致癌作用、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、癌癥中的蛋白多糖、細(xì)胞周期等，進(jìn)而影響HCC的發(fā)生發(fā)展。

本研究仍尚存局限性，如本研究構(gòu)建的模型尚未在獨(dú)立于TCGA的驗(yàn)證集中進(jìn)一步驗(yàn)證，此外因DCP1A功能未被注釋，其表達(dá)水平、具體作用機(jī)制仍需在獨(dú)立驗(yàn)證集中驗(yàn)證，并在細(xì)胞以及動物層面探索DCP1A在HCC發(fā)生發(fā)展中的功能及其機(jī)制。

綜上所述，本研究確定了與HCC患者生存高度相關(guān)且與靶基因顯著相關(guān)的10個關(guān)鍵eRNA并構(gòu)建預(yù)后模型，同時驗(yàn)證了模型的可行性；其中eRNA?DCP1A與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性最顯著。DCP1A及本研究構(gòu)建的模型有望為HCC診斷和治療提供新的思路。