楊坤 吳坤瑾 沙煥臣 張曉剛 劉昌 曲凱

原發(fā)性肝癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的癌癥之一，全球每年約有一半的新發(fā)肝癌發(fā)生在中國(guó)，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計(jì)，到2030年全球?qū)⒂谐^(guò)100 萬(wàn)人死于肝癌［1?2］。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌，其治療及預(yù)后常因所處的疾病階段不同而差異較大，其中只有約三分之一的患者有機(jī)會(huì)進(jìn)行根治性治療，而大部分患者確診時(shí)已經(jīng)是晚期，只能接受姑息治療。目前作為晚期肝癌一線治療的索拉非尼因?yàn)轭l繁出現(xiàn)耐藥性，治療后的生存獲益也有限［3］。在過(guò)去十多年里，免疫治療極大地改變了腫瘤治療領(lǐng)域［4］。其中，免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）是免疫治療的重要治療策略之一，其通過(guò)重新激活免疫系統(tǒng)的抗腫瘤免疫反應(yīng)發(fā)揮作用［5］。ICIs在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤治療中取得的成功極大地推動(dòng)了免疫治療在包括HCC在內(nèi)的多種腫瘤中的應(yīng)用［6］。在HCC中，納武利尤單抗（Nivolumab）和帕博利珠單抗（Pembrolizumab）兩種針對(duì)程序性細(xì)胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD?1）的單克隆抗體，以及納武利尤單抗聯(lián)合伊匹木單抗（Ipilimumab）的治療策略已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于晚期HCC治療［7］。臨床實(shí)踐表明，ICIs在HCC患者中的總體反應(yīng)率僅為15%～20%［8］。而且，ICIs所帶來(lái)的免疫相關(guān)性不良反應(yīng)也嚴(yán)重影響患者預(yù)后。因此，迫切需要篩選出對(duì)ICIs敏感的HCC亞群。既往研究報(bào)道低分化腫瘤常表達(dá)更高的PD?1/PD?L1［9?10］，因此可能對(duì)免疫治療更敏感，但目前尚缺少低分化HCC免疫治療的研究。本研究旨在探討不同分化程度HCC的預(yù)后差異，以及免疫治療對(duì)低分化HCC的療效。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集SEER數(shù)據(jù)庫(kù)中于2004—2015年被確診為HCC的患者臨床、病理及隨訪資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴經(jīng)2010版WHO病理診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為肝細(xì)胞肝癌（ICD?O?3：8170?8175）；⑵診斷由陽(yáng)性組織學(xué)確定；⑶Grade分級(jí)明確；⑷甲胎蛋白（AFP）及肝纖維化評(píng)分信息明確；⑸AJCC第6版TNM分期信息完整；⑹有完整的生存時(shí)間及隨訪信息。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴種族信息未知。⑵病例來(lái)源為尸檢獲取及只有死亡報(bào)告的病例。最終，4 114例患者被納入本研究。

收集2003—2020年于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院行肝癌切除術(shù)的HCC患者的臨床、病理及隨訪資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴年齡大于18歲；⑵根據(jù)AJCC第8版TNM分期系統(tǒng)評(píng)估為Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ期；⑶術(shù)前未進(jìn)行任何抗癌治療；⑷接受肝癌根治性切除術(shù)；⑸經(jīng)病理學(xué)診斷為HCC。共納入1 752例患者，電話隨訪自2012年1月至2021年5月，主要隨訪內(nèi)容為生存狀態(tài)、死亡時(shí)間、死亡原因等。排除失訪或臨床數(shù)據(jù)不完整的患者1 162例。最終，590例患者被納入本研究。

1.2 臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

采用SEER*Stat（Version 8.3.9.2）收集數(shù)據(jù)，IBM SPSS Statistics 26軟件用于數(shù)據(jù)整理及分析。使用Prism 8.0軟件繪制Kaplan?Meier生存曲線，預(yù)后指標(biāo)為總生存期（overall survival，OS）及生存狀態(tài)，并以Log?rank法進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)。SEER數(shù)據(jù)庫(kù)基線變量（性別、年齡、種族、AFP、TNM分期、腫瘤大小、分化程度、肝纖維化Ishak評(píng)分、有無(wú)放/化療及手術(shù)）和單中心數(shù)據(jù)基線變量（性別、年齡、HBsAg、AntiHCV、AFP、TNM分期、分化程度、NLR、肝纖維化ARPI評(píng)分、肝纖維化FIB4評(píng)分、手術(shù)方式）用IBM SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行多因素Cox回歸分析，得到校正P值（Pa值）和校正HR及95%CI。當(dāng)P＜0.05則認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 肝癌測(cè)序數(shù)據(jù)及基因篩選

數(shù)據(jù)來(lái)源于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，從XENA項(xiàng)目網(wǎng)站（https：//xena.ucsc.edu/）分別下載肝癌患者的臨床特征數(shù)據(jù)（survival/LIHC_survival.txt）和 RNAseq數(shù)據(jù)（TCGA.LIHC.sampleMap/HiSeqV2）。將基因樣本分為腫瘤組與癌旁組，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（P＜0.05）和FC（LogFC＞1或＜-1）初步篩選出腫瘤與癌旁組織有顯著差異的基因。通過(guò)Cox回歸分析篩選出影響肝癌患者預(yù)后的基因，將兩組基因進(jìn)行匹配，篩選出影響HCC預(yù)后的基因（P＜0.05）。

1.4 WGCNA和通路富集分析

通過(guò)R?Studio（version 1.4.1717）中的WGCNA包進(jìn)行加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted correlation net?work analysis，WGCNA），分析候選基因的表達(dá)和臨床數(shù)據(jù)。通過(guò)計(jì)算基因?qū)χg的Pearson相關(guān)性，模塊特征基因與性狀（包括性別、年齡、病理分級(jí)、生存狀態(tài)、生存時(shí)間）的相關(guān)性，確定與腫瘤分化、生存結(jié)局以及生存時(shí)間相關(guān)的基因模塊。使用在線分析網(wǎng)站Metascape（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）進(jìn)行富集分析。

1.5 免疫浸潤(rùn)分析

使用在線分析網(wǎng)站TIMER（https：//cistrome.shin?yapps.io/timer/）和 TIMER2.0（http：//timer.cistrome.org/），基于TIMER算法全面分析候選基因表達(dá)和不同免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平之間的Spearman相關(guān)性和顯著性?；赥CGA數(shù)據(jù)庫(kù)將腫瘤分為高?中分化組與低分化組，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組的免疫細(xì)胞及PD?1/PDL?1表達(dá)情況。

1.6 PD?1免疫熒光染色

肝癌組織在10%福爾馬林緩沖液中固定24 h以上，石蠟包埋后切片得到石蠟白片。首先，對(duì)石蠟切片白片進(jìn)行脫蠟處理，順序依次為二甲苯Ⅰ（15 min），二甲苯Ⅱ（15 min），100% 乙醇Ⅰ（5 min），100% 乙醇Ⅱ（5 min），90% 乙醇（5 min），80% 乙醇（5 min），70%乙醇（5 min），60% 乙醇（5 min）。脫蠟完成后浸泡在PBS溶液清洗5 min，然后將切片放在95℃的檸檬酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH=6.0）中抗原修復(fù) 10 min，自然冷卻至室溫。接著在5%Triton?X中透化10 min后，PBS清洗10 min×3次。在避光條件下用3%過(guò)氧化氫孵育10 min。待PBS清洗完成后，用5%BSA封閉30 min。封閉完成后，加PD?1一抗（1∶200），4℃孵育過(guò)夜后，經(jīng)PBST清洗、熒光二抗孵育（AlexaFluor 546標(biāo)記驢抗兔抗體 1∶500，Hochest 33342 1∶1 000）2 h、PBST清洗后用90%甘油進(jìn)行封片，然后立即在激光共聚焦顯微鏡594 nm波長(zhǎng)下觀察染色情況，采集圖像并分析。

2 結(jié)果

2.1 不同分化程度直接影響HCC患者的預(yù)后

2.1.1 SEER數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果 SEER數(shù)據(jù)庫(kù)納入的4 114例HCC患者，對(duì)納入的變量進(jìn)行Cox多因素回歸分析，結(jié)果顯示，除性別外，年齡、AFP水平、腫瘤大小、分化程度、肝纖維化Ishak評(píng)分均是預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；放療、化療、手術(shù)均是預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素，見(jiàn)圖1。

圖1 SEER數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC患者預(yù)后因素森林圖Fig.1 Forest of prognostic factors of HCC patients in the SEER dataset

亞組分析顯示，HCC患者預(yù)后與分化程度密切相關(guān)。其中，高分化HCC患者的中位生存時(shí)間為46個(gè)月，中分化患者為40個(gè)月，低分化患者為22個(gè)月，未分化HCC患者為15個(gè)月。將患者分為高、中、低、未分化4組進(jìn)行生存分析，Log?rank檢驗(yàn)結(jié)果與多因素Cox結(jié)果一致，分化程度是影響HCC預(yù)后的因素（P＜0.001），但高分化組與中分化組的預(yù)后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.420），低分化組與未分化組的預(yù)后差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.272），見(jiàn)圖2A。因此重新將患者分為高?中分化和低?未分化兩組進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示高?中分化組的總體預(yù)后優(yōu)于低?未分化組患者（P＜0.001），見(jiàn)圖2B。

圖2 基于SEER數(shù)據(jù)庫(kù)分析不同分化程度HCC患者的預(yù)后Fig.2 Analysis of the prognosis of HCC patients with different histological grades in SEER dataset

進(jìn)一步分析不同TNM分期患者的分化程度與的預(yù)后關(guān)系，結(jié)果顯示，在TNM的4個(gè)不同分期中，低?未分化HCC患者的預(yù)后均較高?中分化患者差（P＜0.05），見(jiàn)圖3。再次證明HCC分化程度是影響患者預(yù)后的重要因素。

圖3 基于SEER數(shù)據(jù)庫(kù)分析不同TNM分期中分化程度對(duì)患者預(yù)后的影響Fig.3 The prognosis effects of histological grades in HCC patients with different TNM stage in SEER dataset

2.1.2 XJTU隊(duì)列數(shù)據(jù)分析結(jié)果 為了驗(yàn)證上述SEER數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果，進(jìn)一步納入于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院診治的590例HCC患者（XJTU隊(duì)列）進(jìn)行分析，基線資料見(jiàn)表1。由于590例HCC患者的病理類型中缺乏“未分化”類型，因此將患者分為高、中、低分化3組進(jìn)行生存分析。其中高分化HCC患者的中位生存時(shí)間為64個(gè)月，中分化患者為77個(gè)月，低分化患者為25個(gè)月；Log?rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示分化程度是影響HCC患者預(yù)后的因素（P＜0.001），見(jiàn)圖4A，但高分化組與中分化組預(yù)后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.494），因此進(jìn)一步分為高?中分化和低分化兩組進(jìn)行分析，結(jié)果與SEER數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果一致，高?中分化和低分化HCC患者的預(yù)后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見(jiàn)圖4B，即分化程度越差，HCC患者預(yù)后越差。

表1 590例HCC患者的臨床資料Tab.1 Clinical charactersitics of 590 patients with HCC

圖4 基于XJTU隊(duì)列分析不同分化程度HCC患者的預(yù)后Fig.4 Analysis of the prognosis of HCC patients with different histological grades in XJTU cohort

2.2 低分化HCC中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及PD?1/PD?L1表達(dá)分析

利用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）比較低分化HCC與高?中分化HCC的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況，結(jié)果顯示，與高?中分化HCC組織比較，低分化HCC組織中存在更多的CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)（P＜0.05），具有更高的PD?1表達(dá)（P＜0.05），見(jiàn)圖5。這一結(jié)果提示，低分化HCC組織中具有與高中分化HCC不同的免疫微環(huán)境特點(diǎn)。

圖5 低分化HCC組織中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及PD?1/PD?L1的表達(dá)情況Fig.5 The immunocytes infiltration and PD?1/PD?L1 expression in poorly differentiated HCC

2.3 E2F1作為核心基因參與調(diào)控低分化HCC的免疫微環(huán)境

本研究利用肝癌測(cè)序數(shù)據(jù)（TCGA?LIHCseq），使用WGCNA方法篩選出與腫瘤分化、生存結(jié)局及無(wú)瘤生存期相關(guān)的基因模塊，結(jié)果顯示，MEblue模塊的基因與腫瘤分化程度顯著相關(guān)（P＜0.001），也均與生存結(jié)局（P＜0.05）及總生存期（overall survival，OS）（P＜0.001）相關(guān)，見(jiàn)圖6A。推測(cè)MEblue模塊內(nèi)的基因可能與低分化HCC不良預(yù)后有關(guān)，因此進(jìn)一步將MEblue模塊基因進(jìn)行TRUSST通路富集分析，結(jié)果顯示，該類基因主要受E2F1調(diào)控（Pa＜0.001），見(jiàn)圖6B。此外，E2F家族成員E2F4（Pa＜0.001）、E2F3（Pa＜0.05）也參與調(diào)控MEblue模塊基因。

圖6 肝癌分化相關(guān)基因篩選及其調(diào)控相關(guān)分子預(yù)測(cè)Fig.6 Identification of the hubgenes that associated with tumor histological grades

本研究利用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)肝癌組織中E2F1與免疫浸潤(rùn)的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，E2F1表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈顯著相關(guān)性，見(jiàn)圖7。其中，與E2F1表達(dá)關(guān)系最密切的免疫細(xì)胞為樹突狀細(xì)胞（r=0.405，P＜0.001），B細(xì)胞（r=0.406，P＜0.001）和CD8+T細(xì)胞（r=0.307，P＜0.001）。上述結(jié)果提示，E2F1與HCC分化及預(yù)后有關(guān)，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控HCC免疫微環(huán)境而實(shí)現(xiàn)。

圖7 肝癌組織中E2F1表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性Fig.7 The correlation between E2F1 expression and immunocyte infiltration in HCC tissue

2.4 低分化HCC聯(lián)合免疫治療病例分析

患者，男性，40歲，于2020年4月8日入院，入院診斷：原發(fā)性肝癌，乙肝肝硬化。于本院行肝癌切除術(shù)，術(shù)中可見(jiàn)肝臟左外葉外側(cè)2個(gè)質(zhì)軟灰白色結(jié)節(jié)，腫瘤質(zhì)地柔軟，爛魚肉狀，術(shù)后病理示：肝臟低分化肝細(xì)胞癌伴微血管內(nèi)癌栓及大片壞死，浸及局部肝被膜；微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）：M2?？紤]為腫瘤復(fù)發(fā)高危人群，術(shù)后給予口服酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKI）索拉非尼治療。術(shù)后4個(gè)月出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，先后接受兩次經(jīng)肝動(dòng)脈化療 栓塞術(shù)（transcatheter arterial chemoembolization，TACE），效果不佳。于術(shù)后第7個(gè)月接受TKI聯(lián)合免疫治療。聯(lián)合免疫治療后AFP水平逐漸降低至正常水平，見(jiàn)圖8A。聯(lián)合免疫治療3個(gè)月后復(fù)查上腹部增強(qiáng)CT，提示腫瘤完全緩解（complete response，CR），見(jiàn)圖8B。將患者術(shù)中切除的肝癌組織進(jìn)行PD?1免疫熒光染色（紅色），結(jié)果顯示其腫瘤周圍存在較多PD?1陽(yáng)性細(xì)胞，見(jiàn)圖9。進(jìn)一步驗(yàn)證低分化HCC組織中存在較多PD?1陽(yáng)性T細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖8 聯(lián)合免疫治療前后患者的AFP水平及影像學(xué)改變Fig.8 AFP and imaging changes before and after immunotherapy

圖9 1例低分化HCC患者肝癌組織的PD?1免疫熒光染色Fig.9 Immunofluorescence staining of PD?1 in a patient with poorly differentiated HCC

3 討論

臨床上大部分HCC患者發(fā)現(xiàn)時(shí)即為晚期，索拉非尼是晚期HCC的一線治療藥物，但由于索拉非尼的低應(yīng)答率和高毒性等缺點(diǎn)，亟需開發(fā)新的治療方法作為替代。在這些新的療法中，免疫療法可能是最有希望的療法之一［11］。目前，免疫治療已經(jīng)在黑色素瘤、肺癌、腎癌和膀胱癌等多種腫瘤的臨床治療中表現(xiàn)出顯著的臨床效果［12?13］。但免疫治療在HCC患者中的總體反應(yīng)率僅為15%～20%，從而限制了其在臨床上的應(yīng)用［8］，因此篩選對(duì)免疫治療敏感的HCC亞型至關(guān)重要。

HCC作為一種炎癥相關(guān)腫瘤，其免疫微環(huán)境可通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤免疫耐受和逃逸，免疫抑制作用的強(qiáng)弱也與HCC患者預(yù)后密切相關(guān)［14］。PD?1/PD?L1軸是一條重要的與腫瘤免疫耐受和逃逸相關(guān)的通路［15］，PD?1在腫瘤免疫浸潤(rùn)細(xì)胞尤其是在T細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，低分化HCC中存在以PD?1+CD8+T細(xì)胞高度浸潤(rùn)為特點(diǎn)的免疫微環(huán)境。近年來(lái)，研究人員陸續(xù)在具有非酒精性脂肪性肝炎（non?alcoholic steatohepatitis，NASH）或乙型肝炎病毒感染背景的HCC中發(fā)現(xiàn)以PD?1+CD8+T細(xì)胞富集為特點(diǎn)的免疫微環(huán)境［17?18］。PD?1作為關(guān)鍵的免疫檢查點(diǎn)分子［19］，在肝癌、肺腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤的研究中被發(fā)現(xiàn)與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)，即腫瘤分化程度越差，免疫細(xì)胞PD?1或PD?1 mRNA表達(dá)水平越高［3，20?22］。而PD?1+CD8+T細(xì)胞富集往往意味著體內(nèi)存在免疫抑制狀態(tài)，使用PD?1抗體可恢復(fù)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。本研究提供的1例典型病例也證實(shí)乙肝肝硬化背景下的低分化HCC，因?yàn)榇嬖赑D?1高表達(dá)，對(duì)免疫治療表現(xiàn)出高度敏感性。由此推測(cè)低分化HCC很可能是免疫治療的潛在受益人群。然而，最近發(fā)表的研究表明［17?18］，NASH 背景下的HCC對(duì)免疫治療效果不佳。那么，NASH背景下的低分化HCC能否從免疫治療中獲益，目前仍不清楚。因此，針對(duì)不同病因背景下低分化HCC對(duì)免疫治療的敏感性仍有待進(jìn)一步研究。

既往研究報(bào)道，E2F家族成員，尤其是E2F1高表達(dá)與腫瘤免疫微環(huán)境中CD8+T淋巴細(xì)胞高度浸潤(rùn)相關(guān)，E2F1通路可能具有調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的作用［23?24］。本研究關(guān)于HCC免疫浸潤(rùn)分析結(jié)果也顯示，在HCC中E2F1表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)具有一定相關(guān)性，推測(cè)低分化HCC中E2F1通路可能參與調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境，導(dǎo)致腫瘤組織中PD?1+CD8+T淋巴細(xì)胞高度浸潤(rùn)，進(jìn)而對(duì)免疫治療表現(xiàn)出高度敏感性，這一結(jié)果為低分化HCC免疫微環(huán)境及免疫治療的機(jī)制研究提供了新的思路。

目前關(guān)于腫瘤免疫治療的相關(guān)臨床研究主要集中在晚期或?qū)ζ渌委煵幻舾械哪[瘤上，在一系列臨床研究的基礎(chǔ)上，多種ICIs被批準(zhǔn)用于治療黑色素瘤、肺癌、尿路上皮癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌和晚期肝癌等腫瘤［25］。但關(guān)于免疫治療的腫瘤亞型尤其是腫瘤分化類型的選擇未有明確報(bào)道。本研究從腫瘤分化角度出發(fā)，試圖探索低分化HCC的免疫微環(huán)境特征及其對(duì)免疫治療的療效，這一結(jié)果將對(duì)肝癌免疫治療篩選具有借鑒意義。但本研究結(jié)果主要基于回顧性數(shù)據(jù)分析和生物信息學(xué)方法，缺乏大樣本的前瞻性臨床數(shù)據(jù)，也未深入探索具體的分子機(jī)制，因此研究結(jié)果具有一定局限性，后續(xù)仍需開展大樣本的前瞻性臨床試驗(yàn)證實(shí)。此外，無(wú)論是SEER數(shù)據(jù)庫(kù)還是筆者所在的中心數(shù)據(jù)均顯示低分化HCC與高?中分化HCC患者預(yù)后差異顯著，而中分化與高分化患者的預(yù)后無(wú)明顯差異，其具體機(jī)制也有待深入探討。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)低分化HCC較高?中分化HCC預(yù)后更差，其中低分化HCC中存在PD?1+CD8+T細(xì)胞富集的免疫微環(huán)境特征，而其高表達(dá)的E2F1可能參與調(diào)節(jié)這種免疫微環(huán)境。因此，低分化HCC患者很可能是免疫治療的潛在受益人群，值得后續(xù)深入探討。