楊花菊 劉思婷 徐峰 王亞飛 蘭小路 李澤瓊 王雅璇 曹鑫怡

偏頭痛是一種臨床常見的原發(fā)性頭痛，以反復(fù)發(fā)作的一側(cè)或雙側(cè)搏動性頭痛為臨床特征，常伴有惡心、嘔吐及畏光等表現(xiàn)[1]。偏頭痛的發(fā)病率呈上升趨勢[2]，反復(fù)發(fā)作、經(jīng)久難愈，給患者的生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重影響，世界衛(wèi)生組織將嚴(yán)重偏頭痛定為最致殘的慢性疾病之一[1]。

蜂毒是蜜蜂尾針中的主要物質(zhì)，經(jīng)多年臨床及實驗研究發(fā)現(xiàn)，蜂毒中含有多種活性物質(zhì)，主要具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗凝、抗腫瘤、降血壓等作用。蜂毒肽是蜂毒中主要成分，能夠提高疼痛閾值，具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用。蜂毒的臨床應(yīng)用多直接使用蜂針，而注射用蜂毒是經(jīng)提取后的蜂毒肽等有效成分，降低了蜂毒過敏的可能性，使用更加安全、方便。目前對于蜂毒及其制品的研究多集中在治療類風(fēng)濕等骨關(guān)節(jié)疾病及癌癥疼痛方面，關(guān)于治療偏頭痛以及相關(guān)機(jī)制的研究卻很少。對注射用蜂毒進(jìn)行偏頭痛方面的治療研究，能夠明確其使用劑量、治療機(jī)制，為臨床使用蜂毒治療偏頭痛提供相關(guān)依據(jù)。本研究將注射用蜂毒凍干粉(主要成分是蜂毒肽)以穴位注射的方式用于硝酸甘油所致急性偏頭痛大鼠，觀察其行為學(xué)變化，并測定血漿蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase-activating peptide，PACAP)及腦組織原癌基因c-Jun的變化，以探究蜂毒對急性偏頭痛的治療效果及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠48只,購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，動物合格證號：SCXK(京)2019-0010，體質(zhì)量(220±30)g。適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，實驗前禁食12小時(自由飲水)。

1.2 藥物和試劑

注射用蜂毒(華北制藥有限公司，規(guī)格：0.5 mg/支，批號：FFMG190301)；佐米曲普坦[萬特制藥(海南)有限公司，規(guī)格：2.5 mg/片，批號：20200402]；硝酸甘油注射液(北京益民藥業(yè)有限公司，規(guī)格：1 mL∶5 mg，批號：20200601)；蛋白激酶A(PKA)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司，批號：61472R2)；垂體腺苷酸環(huán)化酶(PACAP)ELISA試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司，批號：70626R2)；c-Jun兔抗(abcam，批號：Ab40766)。

1.3 動物分組、造模與給藥

將48只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，每組各8只，分別為正常對照組、偏頭痛模型組、佐米曲普坦組、蜂毒高劑量組、蜂毒中劑量組、蜂毒低劑量組。

正常對照組皮下注射生理鹽水10 mg/kg，其余各組大鼠采用后頸部皮下注射硝酸甘油注射液10 mg/kg的方法制備急性偏頭痛模型，以大鼠5分鐘內(nèi)出現(xiàn)雙耳變紅、前肢頻繁撓頭、爬籠次數(shù)增加為造模成功。5分鐘造模成功，然后立即開始給藥。

佐米曲普坦組于兩側(cè)太沖、合谷穴注射1 mg/kg生理鹽水，同時給予佐米曲普坦1 mg/kg灌胃。正常對照組與偏頭痛模型組分別于兩側(cè)太沖、合谷穴注射1 mg/kg生理鹽水，同時給予佐米曲普坦組同等容量的生理鹽水灌胃。蜂毒高、中、低劑量組分別于兩側(cè)太沖、合谷穴分別注射0.1 mg/kg、0.05 mg/kg、0.025 mg/kg蜂毒，同時給予佐米曲普坦組同等容量的生理鹽水灌胃。蜂毒劑量設(shè)計參考徐淑云《藥理實驗方法學(xué)》[3]，并結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果。

1.4 行為學(xué)觀察

注射硝酸甘油偏頭痛大鼠造模后觀察并記錄：(1)每組大鼠耳紅出現(xiàn)及消失時間；(2)每組大鼠爬籠、撓頭次數(shù)：以30分鐘為時間段，觀察并記錄0～30分鐘、30～60分鐘、60～90分鐘、90～120分鐘4個時間段大鼠爬籠、撓頭次數(shù)。

1.5 取材

分別在造模后的2小時、4小時兩個時間點，給各組大鼠腹部酒精消毒，腹腔注射10%水合氯醛溶液0.4 mL/100g麻醉，備皮切開腹部皮膚，尋找并分離腹主動脈。用一次性采血針從腹主動脈取全血5 mL，離心10分鐘(離心機(jī)設(shè)置為4℃，3 000 r/min)，取上清液(血漿)分裝保存于-80℃冰箱中備用。

在造模后的4小時，大鼠取血完成后將其斷頭處死，取出全腦，將腦組織放入0.9%生理鹽水洗去血漬，吸干多余水分，保存于-80℃冰箱中備用。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 ELISA試劑盒測定血漿PACAP、PKA水平 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；在待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL；然后每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL，空白孔除外；用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘，之后揭膜棄液甩干；再加洗滌液靜置30秒后棄去拍干，重復(fù)5次；然后加入顯色劑A、B混勻，37℃避光顯色15分鐘；每孔加終止液50 μL，在15分鐘內(nèi)，以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(optical density, OD)值。依據(jù)測得的各樣品OD值通過曲線回歸方程算出其濃度。

1.6.2 蛋白質(zhì)印跡法定量檢測c-Jun的表達(dá) 從冰箱取出腦組織，稱重、勻碎，加入蛋白裂解液4℃裂解30分鐘，離心15分鐘(離心機(jī)設(shè)置為4℃，13 000 r/min)，吸取上清液，利用二辛可酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白定量法對樣品蛋白含量進(jìn)行測定；配制十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，將樣品蛋白加入凝膠孔道中進(jìn)行蛋白電泳，至溴酚藍(lán)跑出為止；然后取出凝膠轉(zhuǎn)膜2小時，使蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上形成印跡；將膜置于封閉液中，室溫?fù)u動封閉2小時；將膜按蛋白印跡位置剪開，置于對應(yīng)一抗中，4℃搖動過夜，然后置于TBST溶液中漂洗5分鐘；再將膜置于對應(yīng)二抗中，室溫作用1.5小時，再次漂洗5分鐘；之后將膜置于顯色劑中30秒后立即曝光1分鐘，然后行顯影、定影。膠片用Tanon凝膠成像及分析系統(tǒng)進(jìn)行攝像、分析，每個樣品的c-Jun條帶亮度值與對應(yīng)β-actin(內(nèi)參)條帶亮度值的比值，得到校正后c-Jun 條帶亮度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 蜂毒對偏頭痛大鼠癥狀的影響

2.1.1 耳紅開始及消失時間 正常對照組大鼠未出現(xiàn)耳紅癥狀，其它各組大鼠在模型復(fù)制后3～5分鐘內(nèi)均出現(xiàn)耳紅。與偏頭痛模型組相比，各藥物干預(yù)組耳紅開始時間無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與偏頭痛模型組相比，佐米曲普坦組、蜂毒中、高劑量組耳紅消失時間均有顯著縮短(P<0.01)；蜂毒低劑量組相比上述3組耳紅消失時間縮短較少，但與模型組比仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與佐米曲普坦組相比，蜂毒低、中、高三個劑量組耳紅消失時間與之相比均有明顯延長，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見表1。

表1 各組偏頭痛大鼠耳紅開始及消失的時間分鐘)

2.1.2 撓頭次數(shù) 在0～120分鐘四個時間段內(nèi)，正常對照組撓頭次數(shù)變化不大，只有偶爾幾次；與正常對照組比較，偏頭痛模型組各個時間段的撓頭次數(shù)均明顯增加(P<0.01)。

在0～30分鐘與90～120分鐘兩個時間段內(nèi)，與偏頭痛模型組相比，佐米曲普坦組、蜂毒低、中、高劑量組的撓頭次數(shù)均有明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

在30～60分鐘與60～90分鐘兩個時間段內(nèi)，與偏頭痛模型組相比，佐米曲普坦組、蜂毒中、高劑量組撓頭次數(shù)顯著減少(P<0.01)；蜂毒低劑量組相對減少較少，但與模型組比較仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

與佐米曲普坦組相比，在0～30分鐘、30～60分鐘兩個時間段內(nèi)，蜂毒高劑量組的撓頭次數(shù)與之相比，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而在60～90分鐘、90～120分鐘兩個時間段內(nèi)，與佐米曲普坦組相比，蜂毒各劑量組的撓頭次數(shù)明顯增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組偏頭痛大鼠各時間段撓頭次數(shù)比較次)

2.1.2 爬籠次數(shù) 在0～120分鐘四個時間段內(nèi)，正常對照組爬籠次數(shù)變化不大，只有偶爾幾次；與正常對照組比較，偏頭痛模型組各個時間段的爬籠次數(shù)均明顯增加(P<0.01)。

在0～30分鐘時間段內(nèi)，與偏頭痛模型組相比，佐米曲普坦組、蜂毒低、中、高劑量組的爬籠次數(shù)均明顯減少(P<0.01)。其余三個時間段內(nèi)，與偏頭痛模型組相比較，佐米曲普坦組、蜂毒中、高劑量組爬籠次數(shù)顯著減少(P<0.01)。

與佐米曲普坦組相比，在30～60分鐘、60～90分鐘兩個時間段內(nèi)，蜂毒中、高劑量組爬籠次數(shù)差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；蜂毒低劑量組與之相比明顯增加(P<0.01)。在0～30分鐘、90～120分鐘兩個時間段內(nèi)，蜂毒各劑量組的爬籠次數(shù)與之相比均顯著增加(P<0.01)。結(jié)果見表3。

表3 各組偏頭痛大鼠各時間段爬籠次數(shù)比較次)

2.2 蜂毒對偏頭痛大鼠血漿PKA、PACAP及腦部c-Jun的影響

2.2.1 蜂毒對偏頭痛大鼠血漿PKA的影響 與正常對照組相比，偏頭痛模型組2小時與4小時的血漿PKA含量增高明顯(P<0.01)。與偏頭痛模型組相比，各給藥組2小時與4小時的血漿PKA含量明顯減少(P<0.01)。與佐米曲普坦組相比，蜂毒高劑量組2小時和4小時的血漿PKA含量差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；蜂毒中低劑量組與之相比明顯升高(P<0.01)。結(jié)果見表4。

表4 各組偏頭痛大鼠血漿PKA含量比較

2.2.2 蜂毒對偏頭痛大鼠血漿PACAP的影響 與正常對照組相比，偏頭痛模型組2小時與4小時的血漿PACAP含量增高明顯(P<0.01)。與偏頭痛模型組相比，佐米曲普坦組和蜂毒高劑量組2小時和4小時及蜂毒中劑量組2小時的血漿PACAP含量均有明顯減少(P<0.01)。與佐米曲普坦組相比，蜂毒高劑量組2小時的血漿PACAP含量變化不大，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。蜂毒中、低劑量組2小時、4小時和蜂毒高劑量組4小時的血漿PACAP含量明顯增多(P<0.01)。結(jié)果見表5。

表5 各組偏頭痛大鼠血漿PACAP含量比較

2.2.3 蜂毒對偏頭痛大鼠腦組織c-Jun表達(dá)的影響 與正常對照組比較，偏頭痛模型組c-Jun蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。與偏頭痛模型組比較，佐米曲普坦組、蜂毒中、高劑量組的c-Jun蛋白表達(dá)均明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與佐米曲普坦組相比，蜂毒低、中劑量組的c-Jun蛋白表達(dá)上升明顯，而蜂毒高劑量組的c-Jun蛋白表達(dá)下降明顯，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見表6、圖1。

表6 各組偏頭痛大鼠腦組織c-Jun蛋白表達(dá)情況比較

注：A 正常對照組；B 偏頭痛模型組； C 佐米曲普坦組；D 蜂毒低劑量組； E 蜂毒中劑量組；F 蜂毒高劑量組。

3 討論

硝酸甘油在體內(nèi)可以直接轉(zhuǎn)換為一氧化氮，而一氧化氮可以導(dǎo)致顱內(nèi)血管的擴(kuò)張，從而刺激三叉神經(jīng)系統(tǒng)釋放神經(jīng)肽類物質(zhì)，觸發(fā)神經(jīng)源性炎癥，參與偏頭痛的發(fā)生[4]。硝酸甘油偏頭痛模型的病理生理過程與人類偏頭痛發(fā)作時極為相似，其病理及生化數(shù)據(jù)穩(wěn)定，而且造模方法簡單、經(jīng)濟(jì)、適用性強，是經(jīng)典的偏頭痛實驗?zāi)Ｐ蚚5]。本次實驗結(jié)果可以看出，蜂毒能夠有效加快偏頭痛大鼠耳紅消失、減少撓頭和爬籠次數(shù)，從行為學(xué)上明顯減輕了大鼠偏頭痛發(fā)作時的疼痛。

穴位注射法[6]是以經(jīng)絡(luò)學(xué)說為依據(jù)，將針刺經(jīng)絡(luò)穴位和藥物有機(jī)結(jié)合，產(chǎn)生機(jī)械刺激和化學(xué)刺激，兼具速效和長效雙重作用，具有簡單、方便、效果顯著等特點。四關(guān)穴包括合谷穴和太沖穴，左右共4個穴位，是臨床經(jīng)常用到的治療疼痛疾病的對穴之一。合谷穴具有調(diào)和氣血、祛風(fēng)解表、通絡(luò)止痛等作用，對頭面五官諸疾均有良好療效。現(xiàn)代實驗研究也證實了針刺合谷穴有很好的鎮(zhèn)痛作用。有研究[7]顯示，針刺合谷穴可以提高體內(nèi)β-內(nèi)啡肽含量，降低P物質(zhì)含量，使二者之間保持平衡，從而起到鎮(zhèn)痛效果。太沖穴具有疏肝理氣、活血散瘀、通絡(luò)止痛等作用，主要治療頭痛、眩暈等肝膽以及神志相關(guān)疾病。楊宗保[8]通過針刺太沖透刺涌泉的方法，能夠有效地減輕偏頭痛發(fā)作時的疼痛及其它相關(guān)癥狀。合谷、太沖兩穴合用，具有祛風(fēng)解表、行氣活血、養(yǎng)陰平肝、通絡(luò)止痛等作用。有研究[9]表明，針刺四關(guān)穴可以明顯降低患者疼痛視覺模擬量表評分，減少偏頭痛發(fā)作次數(shù)。故而本次實驗選取四關(guān)穴作為注射穴位。

PACAP是一種神經(jīng)多效生物活性肽，廣泛分布在中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)中[10]，參與許多與偏頭痛相關(guān)的機(jī)制通路。PKA是環(huán)腺苷3′,5′-磷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)依賴性蛋白激酶的一種。cAMP是參與細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的第二信使，是細(xì)胞內(nèi)傳遞激素和遞質(zhì)的中介因子。cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-responsive element binding protein，CREB)是一種轉(zhuǎn)錄因子，存在于細(xì)胞核上，在腦內(nèi)所有細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)。CREB可以通過激活靶基因，如c-Fos、降鈣素基因相關(guān)肽等，促使中樞敏化，從而參與偏頭痛的發(fā)生[11]。c-Jun是與c-Fos相伴的一個原癌基因，是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。在一般情況下，c-Jun在體內(nèi)很少表達(dá)，但在接收到傷害性刺激信號后，可以立即啟動基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及表達(dá)。在痛覺的傳遞通道中，c-Jun對疼痛的調(diào)控有著非常重要的作用，凡是能夠引起痛覺的刺激均可以提高c-Jun的表達(dá)[12]。

PACAP可以通過G-蛋白耦聯(lián)受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，激活腺苷酸環(huán)化酶(adenyl cyclase, AC)[13]，AC的激活可以提高靶細(xì)胞cAMP的水平，從而激活cAMP依賴的PKA[14-15]，增加CREB在腦內(nèi)的表達(dá)，誘導(dǎo)c-Jun基因轉(zhuǎn)錄mRNA在胞漿內(nèi)翻譯合成Jun蛋白[16]。PACAP、PKA和c-Jun之間可以形成信號傳導(dǎo)通路：PACAP→AC→cAMP-PKA-CREB→c-Jun，所以選擇c-Jun作為本次研究的檢測指標(biāo)。

蜂毒肽皮下注射后，可以通過降低交感神經(jīng)的血管緊張度,減少脊骨內(nèi)PKA的激活，減輕痛覺增敏和機(jī)械超敏等反應(yīng)，從而起到鎮(zhèn)痛的作用[17]。蜂毒肽還能夠刺激垂體―腎上腺―下丘腦系統(tǒng)釋放更多的皮質(zhì)激素和抗炎因子等抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，同時降低c-Jun受體在脊髓中的含量，提高人體疼痛閾值，從而產(chǎn)生抗炎鎮(zhèn)痛作用，緩解偏頭痛發(fā)作癥狀[18]。本次實驗結(jié)果表明，蜂毒可以降低大鼠血漿中PKA、PACAP含量和腦組織c-Jun蛋白表達(dá)，尤以蜂毒高劑量組更為明顯。

曲坦類藥屬于高選擇性5-羥色胺受體激動劑，具有起效快、安全性高等特點[19]，在偏頭痛發(fā)作期越早應(yīng)用效果越好，是偏頭痛發(fā)作期治療的一線藥物。本次實驗中，高劑量的蜂毒與佐米曲普坦相比，在0～60分鐘的撓頭次數(shù)、30～90分鐘的爬籠次數(shù)、PACAP 2小時含量、PKA 2小時和4小時的含量差異不明顯，說明高劑量的蜂毒與佐米曲普坦療效具有可比性，而且高劑量的蜂毒較佐米曲普坦更能夠降低c-Jun含量。本次實驗結(jié)果表明，蜂毒治療偏頭痛療效明顯，且達(dá)到其劑量效應(yīng)后的效果并不弱于偏頭痛特異性治療藥物。

從本次研究結(jié)果推斷蜂毒治療偏頭痛可能是通過以下機(jī)制：蜂毒進(jìn)入大鼠體內(nèi)后，其中的多肽類成分能夠降低毛細(xì)血管的通透性，抑制了可能引起各種炎癥因子釋放的通道，使大鼠體內(nèi)的PACAP含量減少，則G蛋白偶聯(lián)受體活化減少，亦使AC活化減少，從而抑制cAMP的表達(dá)，降低PKA含量，再通過cAMP-PKA-CREB信號通路[20]，抑制c-Jun基因或蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)，從而減少了偏頭痛的誘發(fā)及刺激因素，降低偏頭痛的發(fā)生機(jī)率，緩解偏頭痛發(fā)作時的癥狀。

聲明本文章作者單位、本課題組所有成員承諾本研究不涉及利益沖突。