孫嫘 韓敏娟 李娜 劉娟 喬海法

肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一種神經(jīng)退行性疾病，以上、下運動神經(jīng)元選擇性損害為特征，平均生存率為3.5年[1]。調(diào)查顯示，中國ALS患病率約為3.1/10萬人[2]。目前，僅利魯唑?qū)LS有暫時緩解作用[3]。ALS患者相關(guān)基因突變或通路異常表達，動態(tài)平衡破壞而導(dǎo)致體內(nèi)氧自由基累積，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致ALS運動神經(jīng)元的進行性損傷及丟失。肌萎縮側(cè)索硬化SOD1 G93A轉(zhuǎn)基因小鼠(SOD1 G93A transgenic mice，SOD1G93A)與人類ALS 發(fā)病特點極為相似，該鼠從胚胎發(fā)育后期已出現(xiàn)神經(jīng)退行性變[4]，同時客觀反映了氧化應(yīng)激對運動神經(jīng)元的損傷機制，為研究提供可靠的動物模型[5]。故本研究采用 SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠為實驗對象，通過電針干預(yù)雙側(cè)足三里穴、曲池穴，觀察小鼠體質(zhì)量、轉(zhuǎn)棒實驗潛伏期的改變，檢測脊髓組織銅鋅超氧化物歧化酶(Cu, Zn-Superoxide dismutase，SOD1)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)的含量，以及B淋巴細(xì)胞瘤基因-2相關(guān)X蛋白(BCL2-Associated X，Bax)和B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2, Bcl2)的表達，探討電針干預(yù)調(diào)控脊髓抗氧化酶水平以及抗細(xì)胞凋亡水平，從而保護神經(jīng)元，改善ALS運動功能及癥狀，提高存活率的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠24只，同窩陰性小鼠12只，12周齡，體質(zhì)量(20±3) g，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，合格證編號：SCXK(蘇)2016-0010。動物實驗過程嚴(yán)格遵守國家實驗動物管理條例規(guī)定，所有SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠均飼養(yǎng)于明暗交替(12小時/12小時)、恒溫(25±2)℃、恒濕(50%～70%)、無特定病原菌(specific pathogen free, SPF)環(huán)境中，以滅菌的SPF級顆粒型鼠類飼料和無菌水飼養(yǎng)。

1.2 實驗試劑與儀器

一次性無菌針灸針(0.30 mm×15 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；SDZ-Ⅱ型電子針療儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司) ；小鼠固定器(眾實科技，批號：1056714)。SOD1測定試劑盒(南京建成，批號：A001-2-2)；GSH-Px試劑盒(南京建成，批號：A005-1-1)；Anti-Bcl-2 (北京博奧森，批號：bs-4563R)；Anti-Bax(北京博奧森，批號：bs-0127M)；山羊抗鼠IgG(北京鼎國昌盛，批號：SH-0011)。PVDF轉(zhuǎn)印膜(美國Thermo Fisher公司)；石蠟切片機(德國SLEE公司)；顯微鏡(日本OLTMPUS公司) ；電子天平(上海精密儀器儀表有限公司)。

1.3 分組與干預(yù)方法

SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠24只按照對照隨機數(shù)字表法分為電針組、模型組，每組12只，同窩陰性小鼠12只作為空白組。根據(jù)《常見實驗動物穴位圖譜》足三里穴定位：在膝關(guān)節(jié)外側(cè)、腓骨小頭下3.5 mm，直刺2 mm；曲池穴定位：位于橈骨近端的關(guān)節(jié)外側(cè)前方的凹陷中，直刺2毫米。電針組針刺雙側(cè)足三里穴、曲池穴后，采用1 mA，2 Hz斷續(xù)波，持續(xù)刺激1分鐘，后留針15分鐘，不作任何手法；空白組及模型組采取同樣抓取手法并固定15分鐘。三組均于每日上午干預(yù)1次，每周5次，周六、周日不予針刺，連續(xù)干預(yù)4周。

1.4 觀測指標(biāo)及檢測方法

1.4.1 體質(zhì)量 SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠早期體質(zhì)量下降主要是由于運動神經(jīng)元的丟失導(dǎo)致肌肉萎縮而致。3組小鼠分別于干預(yù)前1天及干預(yù)1周、2周、3周、4周末干預(yù)結(jié)束后進行體質(zhì)量測量，每只測量3次，取平均值[6]。

1.4.2 轉(zhuǎn)棒實驗 也稱潛伏期，主要觀察小鼠在轉(zhuǎn)棒儀器上停留時間，用于評定小鼠協(xié)調(diào)性及肌力。轉(zhuǎn)棒儀轉(zhuǎn)速為15 r/min，超過200秒按照200秒記錄，不足200秒則按照實際時長記錄。實驗前對小鼠進行1周適應(yīng)性訓(xùn)練。測試時間為干預(yù)前1天及干預(yù)1周、2周、3周、4周末干預(yù)結(jié)束后，記錄小鼠每次潛伏期的時間，每只小鼠重復(fù)測量3次，每次間隔15分鐘，取平均值。

1.4.3 取材與檢測 三組小鼠完成最后1次干預(yù)、測量體質(zhì)量，并禁食24小時(正常飲水)后，每組隨機取6只使用冰PBS和4%多聚甲醛進行小鼠全身固定灌流，取脊髓腰4～5節(jié)段組織置于4%多聚甲醛后固定。采用免疫組化法，觀察SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓組織Bax、Bcl2陽性細(xì)胞表達。每組剩余6只小鼠予10%水合氯醛(3.5 mL/kg) 腹腔注射麻醉，斷頭處死，于冰塊上迅速剪取脊髓腰4～5節(jié)段組織，放入凍存管中，并保存于-80℃的冰箱備用。利用比色法，檢測SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓組織 SOD1、GSH-Px的含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 電針干預(yù)對ALS小鼠體質(zhì)量的影響

干預(yù)期間，空白組體質(zhì)量呈增加趨勢；電針組較模型組減輕幅度小，但均較空白組體質(zhì)量明顯減輕，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明電針干預(yù)后，SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠體質(zhì)量得到了一定的保持或增加，因運動神經(jīng)元的丟失而導(dǎo)致的肌肉萎縮得到了一定的改善。見表1。

表1 各組ALS小鼠電針干預(yù)前后體質(zhì)量比較

2.2 電針干預(yù)對ALS小鼠潛伏期的影響

模型組、電針組較空白組潛伏期均縮短(P<0.05)；電針組較模型組停留時間長，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明電針干預(yù)后，SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠運動功能得到一定的改善。見表2。

表2 各組ALS小鼠電針干預(yù)前后轉(zhuǎn)棒實驗潛伏期比較

2.3 電針干預(yù)對ALS小鼠脊髓組織SOD1、GSH-Px含量的影響

與模型組相比，電針組SOD1、GSH-Px表達明顯升高(P<0.05)，但仍顯著低于空白組(P<0.05)。表明電針干預(yù)可能通過增加SOD1、GSH-Px的表達，抗氧化應(yīng)激，抑制神經(jīng)元進一步損傷，進而改善SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠疾病的狀態(tài)。見表3。

表3 各組ALS小鼠電針干預(yù)前后脊髓組織SOD1、GSH-Px含量的比較

2.4 電針干預(yù)對ALS小鼠脊髓組織Bax、Bcl-2表達的影響

干預(yù)結(jié)束后，Bax 在各組小鼠脊髓中均有表達。與空白組相比，模型組與電針組Bax陽性細(xì)胞計數(shù)均明顯升高，平均灰度值降低 (P<0.05)，表明SOD1G93A小鼠脊髓腰4～5節(jié)段中細(xì)胞凋亡相關(guān)酶增多。與模型組相比，電針組脊髓中Bax 陽性表達降低，平均灰度值增高(P<0.05)。同時，電針干預(yù)4周后出現(xiàn)脊髓中抗細(xì)胞凋亡基因Bcl-2 增加的現(xiàn)象(如圖2)，表明各組小鼠Bcl-2 在脊髓中均有表達。與空白組相比，模型組與電針組Bcl-2 陽性細(xì)胞計數(shù)均明顯降低，平均灰度值升高(P<0.05)，表明SOD1G93A小鼠抗細(xì)胞凋亡基因減少。與模型組相比，電針組Bcl-2 陽性表達增高，平均灰度值降低(P<0.05)，表明電針干預(yù)可能通過降低Bax的表達，升高Bcl-2的表達，抑制細(xì)胞凋亡，改善SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠疾病的狀態(tài)。(見圖1、圖2)

3 討論

中醫(yī)古籍無ALS的相關(guān)記載，大多數(shù)醫(yī)家以其進行性的肌無力、肌萎縮等主要臨床表現(xiàn)，將其歸入“痿病”的范疇?！端貑枴ゐ粽撈?“論言治痿者，獨取陽明何也?”《靈樞·根結(jié)》曰:“太陽為開，陽明為闔，少陽為樞……故痿疾者，取之陽明。”張介賓云：“陽明虛則血氣少，不能潤養(yǎng)宗筋……故足痿為用，此所以當(dāng)治陽明也?！笨梢姟爸勿舄毴￡柮鳌崩碚撌轻樉闹委燄糇C的核心內(nèi)容之一。歷代醫(yī)家無不以此為治療痿證之理論，遣方用針之臨床指南。在此理論基礎(chǔ)之上，應(yīng)用針灸方法治療運動神經(jīng)元病，如ALS等，取得了一定的臨床療效。臨床實踐證明，針刺以陽明經(jīng)足三里、曲池為主穴，具有通經(jīng)絡(luò)、益脾胃、強筋骨、潤肌肉之功效[7-9]。本實驗即以“治痿獨取陽明”為理論基礎(chǔ)，取雙側(cè)足三里穴、曲池穴，以電針代替人工手法操作，減少人為操作的誤差。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為ALS的發(fā)病與多種因素有關(guān)，而氧化應(yīng)激是主要發(fā)病因素之一。在ALS患者尸檢中發(fā)現(xiàn)脊髓和大腦運動皮層中羰基衍生物水平明顯升高，提示ALS患者神經(jīng)系統(tǒng)中存在氨基酸的直接氧化[10]。正常人體內(nèi)會不斷產(chǎn)生和消除各類活性氧基團，而ALS患者由于基因突變等因素導(dǎo)致體內(nèi)自由基過度積累，同時抗氧化系統(tǒng)清除能力下降，從而引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[11]。中樞系統(tǒng)所含抗氧化物總量相對不足，耗氧量高，細(xì)胞膜含有大量不飽和脂肪酸及具有氧化還原活性金屬離子，在發(fā)生氧化應(yīng)激時，神經(jīng)細(xì)胞易首先受到損傷，從而引起ALS的各種癥狀[12]。SOD1占SOD總量的86%，是生物內(nèi)源性抗氧化劑，可通過歧化作用清除體內(nèi)超氧陰離子自由基， 減輕細(xì)胞損傷， 在維持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能中起著十分關(guān)鍵的作用[13-14]。而GSH-Px作為活性過氧化氫的清除劑，可加強SOD1保護細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[15]。實驗結(jié)果表明，與空白組相比，模型組小鼠體質(zhì)量明顯降低，潛伏期也明顯縮短，同時脊髓組織中抗氧化酶SOD、GSH-Px的表達明顯偏低，說明SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠隨著發(fā)病時間的進展，體內(nèi)確實存在氧化應(yīng)激。電針干預(yù)可顯著提高SOD1、GSH-Px的含量，使失衡的氧化/抗氧化酶系統(tǒng)趨于正常，從而減輕氧化損傷，保護神經(jīng)元。Bax、Bcl-2是一對凋亡與抗凋亡的基因表達的蛋白，共屬Bac-2基因家族。Bcl-2與Bax蛋白水平的高低與凋亡調(diào)控直接相關(guān)，Bcl-2是細(xì)胞凋亡的抑制基因，而Bax拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用，且具有促進細(xì)胞凋亡的功能。Bax與Bcl-2共存于線粒體，Bcl-2與Bax蛋白可形成同二聚體，也可相互作用形成異二聚體。其中，Bax自身可組成同二聚體，而Bcl-2必須結(jié)合Bax形成異二聚體，從而阻抑凋亡[16]。Bcl-2基因所編碼的蛋白質(zhì)屬于胞內(nèi)膜整合蛋白，它對大多數(shù)因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有拮抗作用。而Bcl-2蛋白能夠影響活性氧水平，可有效清除氧自由基，減輕細(xì)胞的損傷[17-18]。同時Bcl-2能促進谷胱甘肽進入核內(nèi)，改變核內(nèi)氧化還原狀態(tài)，從而抑制凋亡[19-20]。電針干預(yù)足三里穴和曲池穴可使Bax表達降低、Bcl-2表達升高，提高了脊髓組織抗細(xì)胞凋亡能力，從而減少神經(jīng)元的凋亡。

注：A 空白組;B 模型組;C 電針組

注：A 空白組;B 模型組;C 電針組

綜上所述，電針干預(yù)足三里穴和曲池穴可改善SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的運動功能，提高脊髓組織對活性氧誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，抑制神經(jīng)元的凋亡，從而有效發(fā)揮對神經(jīng)元的保護作用，減少神經(jīng)元損傷，起到早期治療ALS的效果，對ALS早期臨床防治具有重要意義。