李藝垚，馬少丹，苑述剛

（福建中醫(yī)藥大學，福建 福州 350122）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是臨床常見疑難病，其發(fā)病期和緩解期交替發(fā)作，主要表現(xiàn)為腹痛腹瀉、黏液膿血便，或伴有腹脹、乏力、發(fā)熱等[1]。根據(jù)其臨床癥狀分析，該病應(yīng)屬中醫(yī)“泄瀉”“痢疾”“腹痛”等范疇。本課題組主要致力于研究久瀉寧顆粒對潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用及機理研究，久瀉寧顆粒是原福建中醫(yī)學院院長、全國著名中醫(yī)藥專家俞長榮教授治療慢性泄瀉的經(jīng)驗方，由參苓白術(shù)散與痛瀉要方加減化裁而來，以健脾滲濕、調(diào)氣止瀉為法，臨床治療脾虛濕盛肝郁證UC療效確切。建立合適的動物模型是研究疾病規(guī)律與藥物療效的基礎(chǔ)，目前常見的UC中醫(yī)證候模型有肝郁脾虛證[2]、脾虛濕困證[3]、濕熱蘊結(jié)證[4]等。在前期相關(guān)研究中，課題組常采用三硝基苯磺酸（TNBS）-乙醇法或免疫復(fù)合物聯(lián)合法制備UC大鼠模型，雖可體現(xiàn)UC的病理特點，但未考慮中醫(yī)證候特點，且存在模型不穩(wěn)定易自愈或造模周期長等缺陷。故本實驗欲采用DSS溶液定量灌胃反復(fù)誘導的同時結(jié)合飲食、環(huán)境等因素干預(yù)希望建立與本課題研究對象相似的脾虛濕盛肝郁證UC模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物7周齡SPF級SD大鼠45只，雌雄各半，體質(zhì)量（170±20）g，由浙江省實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（浙）2014-0001。實驗動物在福建中醫(yī)藥大學動物實驗中心飼養(yǎng)和管理，環(huán)境設(shè)施合格證號：SYXZ（閩）2014-0005。所有實驗研究均符合中國倫理委員會有關(guān)動物研究指導原則，通過福建中醫(yī)藥大學倫理委員會審定，實驗倫理批號：[2019]福中醫(yī)倫理審字第（022）號。

1.2 藥物與試劑葡聚糖硫酸鈉（DSS，大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：S0808A）；豬油（天津聚龍糧油有限公司，批號：20180912C）；0.9%氯化鈉注射液（江西科倫藥業(yè)有限公司，批號：B18120702）；IL-2試劑盒（批號：201909）、TNF-α試劑盒（批號：201903）（江蘇酶免實驗有限公司）。

1.3 主要儀器電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；Thermo Fisher Heraeus Multifuge X1R臺式離心機（Thermo Electron LED GmbH）；Multiskan FC型酶標儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；ZT-14S1型生物組織自動脫水機（亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；YJ-BMC型生物組織石蠟包埋機（湖北錦源醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；Leica RM2235型輪轉(zhuǎn)切片機（德國Leica公司）；YT-7FB型攤烤片機（孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；DM4000B型研究級生物顯微鏡（德國Leica公司）。

1.4 造模與分組45只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組（n=10）、葡聚糖硫酸鈉（DSS）組（n=10）、病證結(jié)合組（n=10）、模型組（n=15）。參照相關(guān)文獻方法[5-7]并加以改進，制備UC大鼠模型：正常對照組予正常飼養(yǎng)，每日予生理鹽水灌胃2次，2 mL/次，連續(xù)19 d。DSS組大鼠每日灌胃10%DSS溶液20 mL/kg，2次/d，連續(xù)7 d，建立急性潰瘍性結(jié)腸炎模型，予正常飼養(yǎng)5 d，第13天再次灌胃10%DSS溶液20 mL/kg，2次/d，連續(xù)7 d，誘導復(fù)發(fā)。病證結(jié)合組大鼠予單日禁食，并4℃冰水灌胃，1次/d，2mL/次；雙日正常飲食，并予豬油灌胃1次，2 mL/次，每日用紗布包裹長尾夾夾住大鼠尾部，30 min/次，使其暴怒，強迫大鼠站立在2 cm深的水中至少8 h，連續(xù)19 d。模型組大鼠采用DSS組結(jié)合病證結(jié)合組造模方法。造模完成后，正常對照組、DSS組、病證結(jié)合組、模型組各取10只大鼠第20天禁食不禁水24 h，取材進行病理觀察。模型組剩余5只大鼠繼續(xù)正常飼養(yǎng)14 d，取材進行病理觀察。

1.5 觀察指標

1.5.1 一般情況 造模期間觀察各組大鼠一般情況，包括體質(zhì)量、精神狀態(tài)、動作行為、毛發(fā)光澤度、糞便性狀等，并按UC疾病活動指數(shù)（DAI）評分標準[8]進行評分。（見表1）

表1 DAI評分標準

1.5.2 大鼠血清中IL-2及TNF-α含量 實驗第21天，大鼠用20%烏拉坦（5 mL/kg）麻醉，腹主動脈取血，4℃，3 000 r/min，離心10 min，提取血漿上清液，-80℃保存待測。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）測定血清IL-2及TNF-α含量，嚴格按試劑盒說明書操作。

1.5.3 大鼠結(jié)腸組織病理學改變 從肛門向上截取大鼠結(jié)腸組織，沿結(jié)腸腸系膜緣縱向剪開，用生理鹽水沖洗干凈，平鋪于濾紙上，肉眼觀察結(jié)腸組織形態(tài)學改變，根據(jù)結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）評分標準[9]進行評分，見表2。取病變最明顯處結(jié)腸組織，選取約1 cm×1 cm結(jié)腸組織，置于4%多聚甲醛固定后編號，酒精梯度脫水，二甲苯透化，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度4 μm，蘇木精-伊紅染色（HE染色），中性樹膠封片后，光鏡下觀察結(jié)腸病理變化。造模完成后第15天，上述方法取模型組剩余5只大鼠結(jié)腸組織，肉眼觀察結(jié)腸組織形態(tài)學改變，固定、包埋、切片、染色后鏡下觀察結(jié)腸病理改變。

1.6 模型評定

1.6.1 脾虛濕盛肝郁證模型評定標準 根據(jù)參考文獻[10-12]擬定，主癥：（1）倦怠疲乏，懶動扎堆；（2）精神萎靡，毛色光澤度下降、晦暗枯槁、稀疏易脫落；（3）便軟或溏，肛周污穢，排便時肛門紅腫，甚至脫肛；（4）行動緩慢，甚至斜行。兼癥：（1）體質(zhì)量不增或增長緩慢，甚至降低；（2）飲食量減少；（3）胃腸明顯脹氣。以上癥狀出現(xiàn)3項主癥或2項主癥加上2項兼癥即可認為脾虛濕盛肝郁證模型復(fù)制成功。

1.6.2 UC模型評定標準 根據(jù)參考文獻[13-14]擬定，（1）DAI評分初步了解動物病癥發(fā)展的嚴重程度；（2）肉眼觀察結(jié)腸組織可見結(jié)腸充血水腫、腸壁增厚，嚴重者尚可見散落的潰瘍點；（3）病理學觀察一般表現(xiàn)為大量淋巴細胞、單核細胞及中性粒細胞等炎癥細胞浸潤，腺體呈現(xiàn)杯狀細胞減少或消失，有隱窩膿腫和潰瘍形成；（4）血清中白細胞介素-2（IL-2）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量變化。確定UC動物模型成立與否，主要取決于上述結(jié)腸組織病理學的改變。

1.7 統(tǒng)計學方法采用統(tǒng)計軟件SPSS 23進行結(jié)果分析，計量資料以（±s）表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)的兩兩比較采用最小顯著差數(shù)LSD法，重復(fù)測量計量資料采用重復(fù)測量方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況比較DSS組大鼠造模第20天死亡1只，其肛周有大量血性污穢，考慮DSS藥物不耐受，不計入血清指標檢測數(shù)據(jù)統(tǒng)計，其余大鼠均正常。正常對照組大鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈活，飲食量正常，皮毛光澤順滑，糞便呈橢圓狀；模型組大鼠出現(xiàn)精神萎靡，蜷臥懶動，扎堆嗜睡，抓取時暴躁易怒，體質(zhì)量明顯下降，大便偏稀，呈月牙狀，有白色偶可見血色膿性分泌物附著，肛周污穢等癥狀；DSS組大鼠出現(xiàn)精神不振懶動扎堆，大便軟或溏，肛周污穢等癥狀，皮毛變化不明顯。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量比較造模第1天，各組大鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；第12、19天，模型組、病證結(jié)合組大鼠體質(zhì)量均明顯低于正常對照組（P＜0.01）。第7、12、19天，模型組、病證結(jié)合組大鼠體質(zhì)量明顯低于DSS組（P＜0.01或P＜0.05）。造模期間各組大鼠體質(zhì)量的分組主效應(yīng)（F=7.894）、時間主效應(yīng)（F=25.526）和分組與時間的交互效應(yīng)（F=30.392）均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（見表3、圖1）

表3 各組大鼠造模后體質(zhì)量比較（±s，g）

表3 各組大鼠造模后體質(zhì)量比較（±s，g）

注：F時間主效應(yīng)=25.526，P時間主效應(yīng)=0.000；F分組主效應(yīng)=7.984，P分組主效應(yīng)=0.000；F交互效應(yīng)=30.392，P交互效應(yīng)=0.000；與正常對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與DSS組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

組別 動物數(shù)（只） 第1天 第7天 第12天 第19天 F P正常對照組 10 203.80±7.20 249.68±13.89 284.08±20.44 313.57±19.20 0.427 0.514 DSS組 10 204.00±7.40 235.82±11.69 272.98±12.64 246.00±15.49a 30.567 0.000病證結(jié)合組 10 200.70±5.49 193.99±6.55ad 201.58±11.47bd 203.48±12.55bc 35.752 0.000模型組 15 201.20±6.80 191.38±7.90ad 201.94±9.39bd 196.66±9.30bc 32.454 0.000 F 0.065 7.990 9.899 13.943 P 0.978 0.000 0.000 0.000

圖1 體質(zhì)量交互效應(yīng)輪廓圖

2.3 各組大鼠DAI評分比較第7、12、19天，模型組、DSS組、病證結(jié)合組DAI評分均明顯高于正常對照組（P＜0.01）。第7、12、19天，模型組DAI評分明顯高于DSS組（P＜0.01）。第7、19天，模型組DAI評分明顯高于病證結(jié)合組（P＜0.01）。造模期間各組大鼠DAI評分的分組主效應(yīng)（F=39.652）、時間主效應(yīng)（F=97.117）和分組與時間的交互效應(yīng)（F=17.343）均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（見表4、圖2）

表4 各組大鼠DAI評分比較（±s，分）

表4 各組大鼠DAI評分比較（±s，分）

注：F時間主效應(yīng)=97.117，P時間主效應(yīng)=0.000；F分組主效應(yīng)=39.652，P分組主效應(yīng)=0.000；F交互效應(yīng)=17.343，P交互效應(yīng)=0.000；與正常對照組比較，aP＜0.01；與DSS組比較，bP＜0.01；與病證結(jié)合組比較，cP＜0.01

組別 動物數(shù)（只）第1天 第7天 第12天 第19天 F P正常對照組 10 0 0 0 0 - -DSS組 10 0 0.56±0.13a 0.57±0.10a 1.30±0.16a 12.168 0.000病證結(jié)合組 10 0 0.71±0.08a 0.75±0.07a 1.10±0.13a 27.746 0.000模型組 15 0 1.17±0.17abc 0.90±0.10ab 1.82±0.17abc 7.493 0.006 F 18.981 27.341 35.187 P 0.000 0.000 0.000

圖2 DAI評分交互效應(yīng)輪廓圖

2.4 大鼠結(jié)腸黏膜病理改變比較正常對照組大鼠結(jié)腸紋理清晰，無損傷，組織結(jié)構(gòu)完整，腺體排列整齊，間質(zhì)未見水腫、充血、潰瘍；DSS組大鼠結(jié)腸黏膜表面輕度充血、水腫，糜爛較局限，偶可見針尖樣潰瘍，腺體排列紊亂，部分結(jié)構(gòu)破壞，杯狀細胞消失，黏膜層局部破壞，潰瘍邊緣大量炎癥細胞浸潤，間質(zhì)充血、水腫；病證結(jié)合組大鼠結(jié)腸紋理較清晰，黏膜表面偶可見充血，未見明顯潰爛，腺體排列較整齊，結(jié)構(gòu)基本完整，少量炎癥細胞浸潤，間質(zhì)水腫；模型組結(jié)腸黏膜充血、水腫，糜爛不同程度加重，且潰瘍點較多。模型組大鼠CMDI評分明顯高于正常對照組（P＜0.01），黏膜層潰瘍嚴重，腺體結(jié)構(gòu)完全破壞，杯狀細胞消失，大量炎癥細胞浸潤，間質(zhì)水腫、充血明顯且有炎癥細胞浸潤，提示造模成功。模型組CMDI評分明顯高于DSS組和病證結(jié)合組（P＜0.01）。造模完成后第15天后取模型組大鼠結(jié)腸組織，肉眼觀察結(jié)腸黏膜表面仍存在充血、水腫，可見針尖樣散在潰瘍點，黏膜層仍有缺損，腺體排列不規(guī)整，部分結(jié)構(gòu)破壞，杯狀細胞減少，大量炎癥細胞浸潤，間質(zhì)水腫、充血，少量炎癥細胞浸潤。（見表5、圖3）

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)改變（HE，×200）

表5 各組大鼠CMDI評分（±s，分）

表5 各組大鼠CMDI評分（±s，分）

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與DSS組比較，bP＜0.01；與病證結(jié)合組比較，cP＜0.01

組別 動物數(shù)（只） CMDI評分正常對照組 10 0 DSS組 10 1.53±0.13a病證結(jié)合組 10 0.60±0.10a模型組 10 2.25±0.14a b c

2.5 各組大鼠血清IL-2及TNF-α含量比較模型組與DSS組大鼠血清IL-2水平明顯低于正常對照組（P＜0.01），血清TNF-α濃度明顯高于正常對照組（P＜0.01）；模型組大鼠血清IL-2水平明顯低于病證結(jié)合組（P＜0.01），血清TNF-α水平明顯高于病證結(jié)合組（P＜0.01）；模型組大鼠血清IL-2水平明顯低于DSS組（P＜0.05）。（見表6）

表6 各組大鼠血清IL-2及TNF-α含量比較（±s，pg/mL）

表6 各組大鼠血清IL-2及TNF-α含量比較（±s，pg/mL）

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與病證結(jié)合組比較，bP＜0.01；與DSS組比較，cP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） IL-2 TNF-α正常對照組 10 33.60±1.64 1.06±0.14 DSS組 9 25.39±0.56a 4.30±0.44a病證結(jié)合組 10 30.40±1.45 1.12±0.22模型組 10 23.24±0.55a b c 5.50±0.50a b

3 討 論

中醫(yī)學認為，泄瀉發(fā)病的根本在于“脾虛”與“濕”，《素問·臟氣法時論篇》曰：“脾病者，……虛則腹?jié)M腸鳴，飧泄食不化?！薄端貑枴り庩枒?yīng)象大論篇》曰：“濕勝則濡瀉”，治療以健脾利濕為原則。久瀉寧顆粒治療以脾虛濕盛肝郁為主的慢性泄瀉，UC中醫(yī)常見分型中并無脾虛濕盛肝郁證，這類患者多是由肝郁脾虛證泄瀉發(fā)展而來，情志過極，肝失疏泄，克犯脾土，脾失健運而致泄瀉，久而久之脾虛生濕，濕困脾土，更不能運化濕邪而加重泄瀉，或是久居濕地或飲食不節(jié)，脾土本虛，肝木乘脾，致脾更虛，清濁不分，混雜而瀉，時止時瀉，遷延不愈，此時則會表現(xiàn)為以脾虛濕困為主兼有肝郁的泄瀉，故久瀉寧顆粒以健脾化濕為主，調(diào)氣止瀉為輔對這類患者進行治療。此類患者常有UC病史，其病勢呈急慢性交替發(fā)作，慢性緩解期時伴有便溏不爽，身倦體重，腹脹，食少納差，脈弦等癥狀[15]，此時處于肝郁脾虛濕蘊的病理狀態(tài)。

目前常用的UC造模方法有化學刺激法、免疫因素刺激法、復(fù)合法[16]，同時在此基礎(chǔ)上進行飲食、環(huán)境等因素干預(yù)可復(fù)制出相應(yīng)的UC中醫(yī)證候模型。DSS作為常用誘導UC模型制劑，其使用方法簡單，容易復(fù)制，且模型接近人類發(fā)病病因而被廣泛采用。DSS常采用自由飲用的方法，一般在造模第3~4天可出現(xiàn)腹瀉、膿血便等癥狀。但因動物個體差異，自由飲用會造成藥物攝入量、攝入時間長短不一，使模型癥狀出現(xiàn)時間、癥狀表現(xiàn)程度、結(jié)腸損傷程度不均一，不利于后續(xù)給予藥物后療效的判斷及新藥治療效果的研究。有研究[15]發(fā)現(xiàn)定量灌胃DSS溶液誘導的UC模型在潰瘍出現(xiàn)的時間、程度、位置比自由飲用均一性顯著提高。故本實驗選擇定量灌胃DSS方法誘導UC模型，控制誘導次數(shù)使模型產(chǎn)生急性與緩解期交替癥狀，復(fù)制UC發(fā)病周期規(guī)律。

實驗結(jié)果顯示單純使用DSS誘導的UC模型，造模后出現(xiàn)便稀，結(jié)腸黏膜充血水腫，血清IL-2及TNF-α水平明顯變化等符合UC病理特點，但飲食量、皮毛光澤度等一般情況未見明顯變化，缺乏中醫(yī)證候特點。單純采用中醫(yī)內(nèi)外因干預(yù)方法造模誘導的模型，在體征上出現(xiàn)蜷臥懶動、不欲飲食、皮毛稀疏伴光澤度下降等中醫(yī)證候特點，但血清IL-2、TNF-α含量水平及結(jié)腸病理變化不明顯，與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義，考慮造模時間較短，尚未達到UC診斷標準。采用DSS定量灌胃反復(fù)誘導方法結(jié)合內(nèi)外環(huán)境干預(yù)，在結(jié)腸潰瘍性病變的同時使模型出現(xiàn)精神萎靡、倦怠懶動、嗜睡、不欲飲食、毛色枯槁變硬、毛發(fā)稀疏等脾虛濕盛肝郁證癥狀；結(jié)腸黏膜病理改變出現(xiàn)水腫、充血、糜爛，光鏡下觀察其改變符合UC診斷，最終形成脾虛濕盛肝郁證UC大鼠模型。造模后14 d模型大鼠仍有精神倦怠、懶動、不欲飲食等癥狀，鏡下觀察結(jié)腸組織仍存在水腫、充血及不同程度缺損，證明該方法制備的UC模型具有一定的穩(wěn)定性。

本實驗?zāi)Ｐ鸵讖?fù)制、穩(wěn)定性較好，并且符合UC病變機制和病程變化，避免免疫復(fù)合物模型制備過程繁瑣、制備周期長等缺點，且無TNBS-乙醇模型或DSS模型的單純細胞免疫反應(yīng)、維持時間短等不足，定量灌胃還可規(guī)避因大鼠個體差異自由飲用DSS溶液導致模型結(jié)腸病變程度不同的缺陷，為較理想的UC中醫(yī)證型動物模型。