馬美榮，劉小改，李洪媛，周林艷，單 群，王小偉，張 坤

（北京紅星股份有限公司，北京 101400）

扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）屬于復(fù)膜孢酵母科（Saccharomycopsidaceae），復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis），又名擬內(nèi)孢霉，是一類能產(chǎn)生子囊孢子的二形態(tài)酵母[1]，其通過多極出芽、菌絲體形成來增殖，子囊為球狀，游離于體細(xì)胞或附著于菌絲尾部或壁上。每個(gè)子囊可形成兩個(gè)到四個(gè)帽狀子囊孢子，成熟時(shí)釋放[2]?？勰覐?fù)膜酵母可在各種淀粉基質(zhì)中存活，是白酒酒曲[3?5]、黃酒酒藥[6]、甜酒曲[7]、韓國(guó)酒曲Nuruk[8?10]、泰國(guó)酒曲Loog-pang[11]、食醋大曲[12?13]等酒曲中的重要菌種。

麩曲酒是以麩曲為糖化劑，加酵母（釀酒干酵母）為發(fā)酵劑，或以麩曲為糖化發(fā)酵劑釀制而成的白酒[14]。清香型麩曲白酒是以黑曲霉制備的麩曲為糖化劑，釀酒酵母為發(fā)酵劑釀制而成。由于該麩曲白酒發(fā)酵菌種較為單一，酒體辛辣，欠醇厚綿柔，后味短，限制了一部分消費(fèi)者對(duì)麩曲酒的喜愛。扣囊復(fù)膜酵母能夠產(chǎn)生一定的香氣，能產(chǎn)生多種甜味物質(zhì)，其應(yīng)用于清香型麩曲白酒發(fā)酵，能夠改善麩曲酒的醇甜感，提升原酒的品質(zhì)。

本文以優(yōu)選的兩株扣囊復(fù)膜酵母制備麩曲，對(duì)麩曲進(jìn)行感官評(píng)價(jià)、風(fēng)味成分分析，并對(duì)其產(chǎn)酸能力、糖化力、發(fā)酵力進(jìn)行分析研究。扣囊復(fù)膜酵母麩曲應(yīng)用于清香型麩曲白酒發(fā)酵，研究其對(duì)清香型麩曲白酒出酒率、原酒品質(zhì)的影響。通過酒樣風(fēng)味成分的分析，為扣囊復(fù)膜酵母提升原酒品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

扣囊復(fù)膜酵母T（Saccharomycopsis fibuligeraT，簡(jiǎn)稱NT）、扣囊復(fù)膜酵母L（Saccharomycopsis fibuligeraL，簡(jiǎn)稱NL）、釀酒酵母 HX006（Saccharomyces cerevisiaeHX006） 北京紅星股份有限公司分離保存；高粱、稻殼、釀酒麩曲 北京紅星股份有限公司釀造車間生產(chǎn)提供。

HP6890 氣相色譜儀 安捷倫公司；LA230S 電子天平 賽多利斯公司；LRH-250 生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DMA5000M 全自動(dòng)密度儀 安東帕公司；ICS-3000 離子色譜儀 美國(guó)Dionex公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備 扣囊復(fù)膜酵母種曲、淺盤麩曲培養(yǎng)基[15]：麩皮與水以1:1 比例拌勻，121 ℃滅菌30 min；扣囊復(fù)膜酵母發(fā)酵力培養(yǎng)基[16]：參考釀酒大曲發(fā)酵力分析方法，選用葡萄糖含量128 g/L 的玉米糖化液：1 kg 玉米面加入5 L 水，加入0.02%的液化酶在80 ℃保溫液化1 h，降溫至60 ℃加入0.3%的糖化酶保溫糖化2 h，棄去殘?jiān)?，清?21 ℃滅菌20 min；酵母液體種子培養(yǎng)基[17]：按照發(fā)酵力培養(yǎng)基制備方法制備玉米糖化液，根據(jù)原液的糖度降度到10oBrix，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 扣囊復(fù)膜酵母三角瓶種曲制備 根據(jù)1.2.1 配制扣囊復(fù)膜酵母種曲培養(yǎng)基，250 mL 三角瓶中裝入20 g 麩皮、20 mL 水，拌勻，121 ℃滅菌30 min。降溫至30 ℃左右，從扣囊復(fù)膜酵母斜面挑1～2 環(huán)菌接入培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 d。

1.2.3 扣囊復(fù)膜酵母淺盤麩曲制備 根據(jù)1.2.1 配制扣囊復(fù)膜酵母淺盤麩曲培養(yǎng)基，取1 kg 麩皮、1 L水，拌勻，121 ℃滅菌30 min。降溫至35 ℃左右，接入6～10 g 種曲，拌勻后裝入淺盤，在曲室內(nèi)培養(yǎng)，前期（0～24 h）品溫控制在32 ℃左右，后期（24～40 h）品溫控制在36 ℃左右。

培養(yǎng)好的麩曲置于陰涼、干燥、通風(fēng)處貯存，貯存時(shí)間不超過2 個(gè)月。

1.2.4 扣囊復(fù)膜酵母在清香型麩曲白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用

按照糖化發(fā)酵劑組成分為三個(gè)方案進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以不加扣囊復(fù)膜酵母麩曲為對(duì)照。

對(duì)照：釀酒麩曲8%、釀酒酵母4%；方案1：釀酒麩曲8%、釀酒酵母4%、NT 麩曲1%、NL 麩曲1%；方案2：釀酒麩曲8%、釀酒酵母4%、NT 麩曲2%；方案3：釀酒麩曲8%、釀酒酵母4%、NL 麩曲2%。

釀酒酵母斜面接種于裝有酵母液體種子培養(yǎng)基的液體試管中，28 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)好的液體試管種子液轉(zhuǎn)接于裝有酵母液體種子培養(yǎng)基的液體三角瓶中，28 ℃培養(yǎng)20～24 h。

操作要點(diǎn)：將高粱粉碎成粉狀，酒糟、高粱粉按照4:1 的配比混合均勻，加入稻殼、水，稻殼添加量為高粱粉質(zhì)量的25%，適當(dāng)加水調(diào)節(jié)醅料水分至55%左右，拌勻后悶料30 min，然后100 ℃蒸糧40 min，蒸糧完成后物料經(jīng)攤涼、降溫至30 ℃左右，按高粱粉質(zhì)量50 kg 加入相應(yīng)的麩曲、酵母，并再次翻拌均勻后入0.8 m3槽車發(fā)酵。自然發(fā)酵，發(fā)酵7 d。發(fā)酵完成后，將酒醅從槽車中取出，裝入甑鍋中蒸餾取酒，蒸酒后酒糟按20%比例作為丟糟棄用，剩余80%酒糟作為回糟再次配糧后進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵應(yīng)用。蒸餾后的酒樣進(jìn)行風(fēng)味成分分析和感官評(píng)價(jià)。

1.2.5 扣囊復(fù)膜酵母麩曲感官評(píng)價(jià) 取培養(yǎng)成熟的麩曲，由8 位具有專業(yè)知識(shí)的技術(shù)人員（年齡20～50歲，5 男3 女，高級(jí)釀酒師5 人，釀酒師3 人）觀察成曲顏色、表面及斷面生長(zhǎng)情況，并聞其香氣情況[18?19]。

成曲評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：顏色發(fā)白，表面及斷面皆有白點(diǎn)，結(jié)塊較密，無酸臭味、無雜菌感染現(xiàn)象。

1.2.6 氣相色譜分析風(fēng)味成分

1.2.6.1 樣品前處理 取10 g 絕干的麩曲樣品置于磨口三角瓶中，加入200 mL 70%voL 的乙醇溶液，室溫浸泡24 h，取清液備用。白酒樣品不需前處理。

1.2.6.2 色譜條件 DB-WAX UI 石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.5 μm）；氫火焰離子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID），檢測(cè)器溫度240 ℃；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：35 ℃保持4 min，以5 ℃/min 升至100 ℃，再以10 ℃/min 升至230 ℃，保持13 min；載氣為氮?dú)猓∟2）；吹掃流量為3 mL/min；分流比為1:30。載氣流速：氮?dú)?6.5 mL/min，氫氣40 mL/min，空氣400 mL/min。根據(jù)保留時(shí)間定性，采用內(nèi)標(biāo)法定量，內(nèi)標(biāo)物為叔戊醇（質(zhì)量濃度198.27 mg/L）、乙酸正戊酯（質(zhì)量濃度174.93 mg/L）和2-乙基丁酸（質(zhì)量濃度198.20 mg/L）。

1.2.7 多元醇分析

1.2.7.1 樣品前處理 取樣品2.00 g 及30 mL 蒸餾水，置于50 mL 離心管中，2000 r/min，15 min，取上清液備用。

1.2.7.2 色譜條件 CarboPac MA1 型分離柱（250 mm×4 mm）；流動(dòng)相：480 mmol/L NaOH 淋洗液；柱溫：30 ℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：25 μL；電化學(xué)檢測(cè)器和Chromeleon 6.80 色譜工作站[20]。根據(jù)保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。

1.2.8 扣囊復(fù)膜酵母麩曲酸度測(cè)定 稱取試樣10 g（精確至0.01 g），于250 mL 燒杯中，準(zhǔn)確加水100 mL，于室溫浸泡30 min（每隔10 min 攪拌1 次），用脫脂棉過濾后的清液進(jìn)行酸度測(cè)定[21]。

酸度定義：每100 g 曲消耗1 mmol 氫氧化鈉為1 度酸度。

1.2.9 扣囊復(fù)膜酵母麩曲糖化力測(cè)定 稱取5 g 麩曲樣品，加入90 mL 水和10 mL 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，攪勻。35 ℃水浴1 h，用脫脂棉過濾，棄去最初5 mL，接收其余澄清濾液進(jìn)行淀粉酶解糖測(cè)定，測(cè)定方法參照斐林定糖法[22]。

式中：V0表示加空白溶液后消耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的體積（mL）；V 表示加麩曲糖化液后消耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的體積（mL）；C 表示標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液濃度（g/mL）；糖化酶活力為U/g。

糖化酶活力單位：1.0 g 干曲在35 ℃、pH4.6 條件下，反應(yīng)1 h，將可溶性淀粉分解為葡萄糖1 mg 所需的酶量稱為1 個(gè)酶活力單位，符號(hào)為U。

1.2.10 扣囊復(fù)膜酵母麩曲發(fā)酵力測(cè)定 以葡萄糖含量128 g/L 的玉米糖化液為發(fā)酵培養(yǎng)基，按照釀酒大曲發(fā)酵力測(cè)定方法測(cè)定[16]。

發(fā)酵力活力單位：在30 ℃，72 h 內(nèi)0.5 g 麩曲利用可發(fā)酵糖類所產(chǎn)生的二氧化碳克數(shù)為一個(gè)單位，符號(hào)為U。

1.2.11 酒樣酒精度測(cè)定 樣品使用Anton Paar DMA 5000 M 全自動(dòng)密度儀進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)[23]。

1.2.12 原料出酒量、出酒率的測(cè)定 蒸餾后的酒樣稱重，測(cè)定原酒酒樣的酒精度，計(jì)算出酒量、原料出酒率。

出酒量（kg）=原酒酒樣酒精度折算為65%voL原酒的換算系數(shù)×原酒產(chǎn)量

原料出酒率（%）=折算為65%vol 原酒產(chǎn)量/原料用量×100[17]。

1.2.13 酒樣感官評(píng)價(jià) 根據(jù)GB/T 33404-2016 白酒感官品評(píng)導(dǎo)則進(jìn)行品評(píng)描述[24]。由10 位具有專業(yè)知識(shí)的技術(shù)人員（年齡20～40 歲，5 男5 女，國(guó)家品酒評(píng)委4 人，一級(jí)品酒師2 人，二級(jí)品酒師2 人，三級(jí)品酒師2 人）從原酒風(fēng)味方面進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有的試驗(yàn)結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Means 士SD）形式表示，n=5，以方差分析ANOVA 來檢測(cè)平均值之間的差異，以P<0.05 為差異顯著。統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS23. 0 統(tǒng)計(jì)分析軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 扣囊復(fù)膜酵母麩曲品質(zhì)和性質(zhì)

2.1.1 扣囊復(fù)膜酵母麩曲感官評(píng)價(jià) 以優(yōu)選的兩株扣囊復(fù)膜酵母NL、NT 制備麩曲，從外觀上觀察兩種麩曲，兩者都呈白色，從顏色上無法區(qū)分，但聞香差別較大，NL 麩曲呈奶油香、花香，花香較明顯，NT 麩曲呈奶油香、曲香，曲香較明顯（表1），這應(yīng)該與兩種麩曲在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的香味物質(zhì)種類與含量存在差異有關(guān)。

表1 扣囊復(fù)膜酵母麩曲感官評(píng)價(jià)Table 1 Sensory evaluation of Saccharomycopsis fibuligera fuqu

2.1.2 扣囊復(fù)膜酵母麩曲風(fēng)味物質(zhì)分析 扣囊復(fù)膜酵母麩曲70%vol 乙醇提取液的氣相色譜分析結(jié)果見表2，從兩種麩曲中共檢測(cè)到21 種物質(zhì)，其中酯類化合物7 種，醛類化合物2 種，酮類化合物2 種，酸類化合物5 種，醇類化合物5 種，大部分物質(zhì)呈現(xiàn)特殊的香氣，含量較高的物質(zhì)有乙縮醛、戊酸乙酯、亞油酸乙酯、乙醛、乙酸等，其中乙縮醛、戊酸乙酯和乙酸是清香型白酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)。麩曲中還含有可使酒具有甜感的2,3-丁二醇（左旋）、2,3-丁二醇（內(nèi)消旋）等物質(zhì)，但含量較低。NL 麩曲的酯類物質(zhì)、酮類物質(zhì)、酸類物質(zhì)的含量比NT 麩曲分別高6.56%、16.59%、32.28%，但其醛類物質(zhì)、醇類物質(zhì)的含量比NT 麩曲分別低5.67%、2.67%。

表2 扣囊復(fù)膜酵母麩曲提取液氣相色譜分析結(jié)果Table 2 GC analysis results of Saccharomycopsis fibuligera fuqu extraction liquid

由表3 可知，兩種麩曲中含有丙三醇和阿拉伯糖醇，丙三醇的含量遠(yuǎn)高于阿拉伯糖醇的含量。NT 麩曲多元醇的含量要高于NL 麩曲多元醇的含量，約高31.79%。多元醇是形成白酒中甜味的主要來源，甜度隨羥基數(shù)增多而增強(qiáng)。在酒精度較高的白酒中，微甜味能使酒體顯得綿柔醇厚[20]。

表3 扣囊復(fù)膜酵母麩曲多元醇分析結(jié)果Table 3 Polyhydric alcohols analysis results of Saccharomycopsis fibuligera fuqu

2.1.3 扣囊復(fù)膜酵母麩曲理化性能研究 對(duì)制備的扣囊復(fù)膜酵母麩曲進(jìn)行酸度、糖化力、發(fā)酵力測(cè)定，可見所應(yīng)用的扣囊復(fù)膜酵母具有一定的產(chǎn)酸能力、糖化能力、發(fā)酵能力。NT 的發(fā)酵力要高于NL，約高19.74%，但其酸度、糖化力要低于NL，且其糖化力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于NL，糖化力約低30.34%，酸度約低8.85%（表4）。

表4 扣囊復(fù)膜酵母麩曲理化指標(biāo)Table 4 Physicochemical indexes of Saccharomycopsis fibuligera fuqu

2.2 扣囊復(fù)膜酵母麩曲在清香型麩曲白酒中應(yīng)用

2.2.1 生產(chǎn)數(shù)據(jù)分析 從表5 可以看出，在不同實(shí)驗(yàn)條件下，與對(duì)照相比，各方案的平均出酒率都高于對(duì)照，其中方案1 的平均出酒率最高，約比對(duì)照高2.10%，相對(duì)提高了4.62%。應(yīng)用扣囊復(fù)膜酵母后，平均出酒率提高，這可能與菌種具有同化淀粉能力、發(fā)酵產(chǎn)乙醇能力有關(guān)。

表5 不同實(shí)驗(yàn)方案的生產(chǎn)數(shù)據(jù)Table 5 The production data of different experimental schemes

2.2.2 實(shí)驗(yàn)酒樣風(fēng)味物質(zhì)分析 通過氣相色譜分析，從酒樣中共檢測(cè)到41 種物質(zhì)，其中酯類化合物13 種，醛類化合物5 種，醇類化合物14 種，酮類化合物2 種，酸類化合物7 種，含量較高的物質(zhì)有乙酸乙酯、異戊醇、異丁醇、乙酸、正丙醇、活性戊醇、乙縮醛、乙醛等。在清香型麩曲白酒的酯類化合物中，乙酸乙酯作為主體香味物質(zhì)，是產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的重要指標(biāo)，幾個(gè)實(shí)驗(yàn)方案的乙酸乙酯含量都高于對(duì)照，方案1 最高，比對(duì)照相對(duì)提高了14.40%。在含量較高的醛類化合物中，幾種實(shí)驗(yàn)方案的乙醛、乙縮醛含量都比對(duì)照高，方案3 最高，其乙醛含量比對(duì)照提高了51.84%，其乙縮醛含量比對(duì)照提高了47.72%。在醇類化合物中，一般關(guān)注高級(jí)醇（正丙醇、異丁醇、活性戊醇、異戊醇）含量變化情況，幾種實(shí)驗(yàn)方案的高級(jí)醇含量都高于對(duì)照，方案1 含量最高，約比對(duì)照提高了14.73%。幾種實(shí)驗(yàn)方案的酮類化合物含量都比對(duì)照高，方案3 含量最高，約比對(duì)照提高了70.80%。在酸類化合物中，乙酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他酸類，幾種實(shí)驗(yàn)方案的乙酸含量都比對(duì)照高，方案2 含量最高，約比對(duì)照提高了20.56%。

從表6 可以看出，酒樣中含有可使酒具有甜感的2,3-丁二醇和1,2-丙二醇，幾種實(shí)驗(yàn)方案的二醇物質(zhì)含量要高于對(duì)照，方案1 最高，比對(duì)照提高了51.89%。由表7 可知，對(duì)照只檢測(cè)到丙三醇一種多元醇，幾個(gè)實(shí)驗(yàn)方案均可檢測(cè)到丙三醇和赤蘚糖醇兩種多元醇，且方案1 的丙三醇含量高于對(duì)照，約提高了11.62%。

表6 實(shí)驗(yàn)酒樣氣相色譜分析結(jié)果（mg/L）Table 6 GC analysis results of experimental baijiu samples(mg/L)

表7 實(shí)驗(yàn)酒樣多元醇分析結(jié)果Table 7 Polyhydric alcohols analysis results of experimental baijiu samples

從酒樣風(fēng)味物質(zhì)分析來看，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組、以及各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)之間風(fēng)味成分的差異，一是與菌種本身特性有關(guān)，二是受發(fā)酵條件及微生物之間的相互作用影響。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)酒樣品評(píng) 如圖1、表8 所示，從酒樣品嘗結(jié)果來看，實(shí)驗(yàn)酒樣均比對(duì)照酒樣增加了不同程度的綿甜感，改善了原酒的口感，提升了原酒品質(zhì)。從香氣、口感、諧調(diào)性等多方面評(píng)價(jià)，方案1 酒樣的感官評(píng)價(jià)最好。從出酒率、理化指標(biāo)、感官評(píng)價(jià)等方面綜合考慮，方案1（使用兩種扣囊復(fù)膜酵母麩曲）效果最好，具有推廣應(yīng)用價(jià)值。

圖1 酒樣品評(píng)風(fēng)味輪Fig.1 Baijiu sample tasting wheel

表8 酒樣感官品評(píng)結(jié)果Table 8 Results of sensory evaluation of baijiu samples

3 結(jié)論

扣囊復(fù)膜酵母T 和扣囊復(fù)膜酵母L 的麩曲都具有一定的產(chǎn)酸能力、糖化能力、發(fā)酵能力，兩種酵母具有產(chǎn)丙三醇和阿拉伯糖醇的能力?？勰覐?fù)膜酵母應(yīng)用于清香型麩曲酒發(fā)酵，能夠提高原料淀粉利用率，使麩曲酒的出酒率提高，增加風(fēng)味物質(zhì)的種類及含量，使得原酒的綿甜感有不同程度的增強(qiáng)，改善了原酒的口感，提升了原酒品質(zhì)。

在今后的研究中，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)扣囊復(fù)膜酵母在白酒釀造生產(chǎn)中作用機(jī)理研究，優(yōu)選扣囊復(fù)膜酵母應(yīng)用于釀造生產(chǎn)，為消費(fèi)者提供飲后更舒適的美酒，滿足消費(fèi)者對(duì)美好生活的向往。