王若帆，侯 茂，謝夢(mèng)憶，游 川，李敬東,*

（1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，四川南充 637200；2.川北醫(yī)學(xué)院肝膽胰腸疾病研究所，四川南充 637200；3.宜賓學(xué)院固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000）

除中草藥外，傳統(tǒng)發(fā)酵食品正在成為一些生理活性物質(zhì)的重要來(lái)源[1]，特別是一些采用自然混菌固態(tài)發(fā)酵方式加工的食品[2]。以濃香型白酒為例，其實(shí)質(zhì)為窖池連續(xù)發(fā)酵容器，在涵養(yǎng)了大量微生物的發(fā)酵糟醅中不斷補(bǔ)充新原料、新微生物（糧食、大曲），取出發(fā)酵產(chǎn)物（白酒）的混菌固態(tài)連續(xù)培養(yǎng)體系，經(jīng)多輪次生產(chǎn)，這一獨(dú)特的連續(xù)培養(yǎng)體系（酒糟）中匯集了多種復(fù)雜代謝產(chǎn)物[3?6]。其中容易揮發(fā)的微生物代謝產(chǎn)物傾向于通過(guò)蒸餾進(jìn)入餾出液（白酒）中，難揮發(fā)的多肽、多糖等活性成分則更容易殘留在酒糟中，這些物質(zhì)可能具有一定的生理活性。

近年來(lái)由于人們飲食結(jié)構(gòu)的變化，肝臟承受了遠(yuǎn)超過(guò)去的解毒壓力，肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）已成為導(dǎo)致死亡的第二大癌癥[7]，具有保肝護(hù)肝作用的保健食品開(kāi)發(fā)一直是功能食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，現(xiàn)有研究主要通過(guò)這些天然產(chǎn)物對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用來(lái)評(píng)價(jià)其護(hù)肝效果。人肝癌細(xì)胞HepG2 細(xì)胞易于培養(yǎng)，是肝癌研究中使用最廣泛的細(xì)胞系，此類(lèi)研究多集中于天然產(chǎn)物對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的抑制作用、對(duì)HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響及細(xì)胞凋亡的影響等方面，但同時(shí)開(kāi)展上述研究的報(bào)道較少。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)多種食源性天然產(chǎn)物具有護(hù)肝作用[8]，包括藍(lán)莓、懷槐、獼猴桃、金銀花、松花粉、葛根、余甘子、小麥胚芽等，一些植物經(jīng)發(fā)酵后還會(huì)產(chǎn)生新的護(hù)肝活性成分[9]。對(duì)食品而言，當(dāng)前的研究主要是在揭示護(hù)肝活性成分及藥理的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)一些新的護(hù)肝原料，并提取其活性成分或直接以原料配伍，開(kāi)發(fā)風(fēng)味及護(hù)肝效果均較好的護(hù)肝食品。酒糟作為谷物發(fā)酵產(chǎn)物，其毒副作用相對(duì)較低[10]，具有作為保健食品原料的潛力，但迄今為止對(duì)固態(tài)發(fā)酵的糧食酒糟中活性成分的研究還很少。本研究在初步測(cè)定酒糟粗提物的成分的基礎(chǔ)上，探究其對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用及其相關(guān)機(jī)制，不僅可為各白酒產(chǎn)區(qū)酒糟資源的深度開(kāi)發(fā)提供參考，減少生產(chǎn)旺季因酒糟積壓而造成的環(huán)境壓力，也可為護(hù)肝功能食品的開(kāi)發(fā)提供一些新的思路，提高白酒產(chǎn)業(yè)副產(chǎn)物酒糟的綜合利用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

HepG2 細(xì)胞 由美國(guó)愛(ài)因斯坦醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)；酒糟粗提物 提取自五糧液股份有限公司提供的出窖糟；DMEM 高糖培養(yǎng)基（生化試劑） Thermo Scientific；胎牛血清、0.25%胰酶（2500 U/mL）、鏈霉素/青霉素雙抗液（生化試劑） Gibco；DMSO、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（生化試劑） 碧云天；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TRIZOL、SYBR-GREEN（生化試劑）Takara；所有抗體（生化試劑） CST；PCR 96 孔板Roche；10 cm 及4 cm 培養(yǎng)皿 康寧公司；RTCA 增殖板 艾森生物公司；所用引物（生化試劑） 上海生工，見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

6530Accurate-Mass Q-TOF 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 Agilent；xCElligence RTCA DP 實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析儀、 NovoCyte 流式細(xì)胞儀 ACEA；NanoDrop One 微量分光光度計(jì)、GeneAmp 9700 PCR 儀 Thermo Scientific；LightCycler96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀 Roche；Fusion Solo 化學(xué)發(fā)光成像儀VILBER。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酒糟粗提物的制備及活性成分測(cè)定 100 g 出甑酒糟加入95%乙醇1200 mL，75 ℃回流提取2 h后，75 ℃、200 mbar 旋蒸濃縮至100 mL，取10 mL經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，分裝入2 mL 樣品瓶，采用液質(zhì)聯(lián)用色譜儀檢測(cè)其組分，其余繼續(xù)濃縮至近干，取出，50 ℃烘干至恒重。

色譜條件[11]：hermo-C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為0.1 %甲酸溶液（A）和甲醇（B），流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，ESI 離子源掃描范圍50～1000 m/z，干燥溫度350 ℃，干燥氣流速8.0 L/min，噴霧壓力40 psig。采用面積歸一化法進(jìn)行相對(duì)定量，采用Agilent 公司TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索對(duì)離子進(jìn)行定性。

1.2.2 樣品溶液的制備 將酒糟粗提物稱(chēng)重0.2 g，并將其溶于1 mL DMSO 溶液中混勻，再用DMEM培養(yǎng)基加至40 mL，配成濃度為5 mg/mL 的酒糟粗提物樣品溶液。在超凈工作臺(tái)里，用0.22 μm 濾器過(guò)濾后放4 ℃冰箱保存并取少量進(jìn)行無(wú)菌測(cè)試。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將HepG2 細(xì)胞從液氮中取出置于10 mL 離心管中，37 ℃恒溫水浴鍋中融化復(fù)蘇，與6 mL DMEM 培養(yǎng)基（1% 雙抗液和10% 胎牛血清）混勻后，以1200 r/min 常溫離心5 min，丟棄上清液，加入6 mL DMEM 培養(yǎng)基，輕吹制成細(xì)胞懸液后將其轉(zhuǎn)移至10 cm 培養(yǎng)皿中，放在恒溫孵箱（37 ℃、5% CO2）中培養(yǎng)1～2 d，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)皿表面積的90%以上進(jìn)行傳代。加入300 μL 濃度為0.25%、酶活為10000 U/mL 的胰酶消化離心獲得細(xì)胞混懸液，將細(xì)胞接分盤(pán)接種到2～3 個(gè)培養(yǎng)皿中，完成傳代培養(yǎng)。

1.2.4 酒糟粗提物對(duì)細(xì)胞增殖的影響 首先將加入60 μL/孔完全培養(yǎng)基的16 孔增殖板放入實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀（RTCA）中測(cè)量基線(xiàn)，再將HepG2 細(xì)胞以6000 個(gè)/孔接種到16 孔增殖板中，放入孵箱培養(yǎng)至細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，在每孔中加入不同濃度的酒糟粗提物并設(shè)置無(wú)藥物的對(duì)照組，再次將加完藥物的16 孔板放回孵箱中，設(shè)定程序每10 min 進(jìn)行一次阻抗值讀數(shù)，48 h 后獲得完整的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)[12]，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 酒糟粗提物對(duì)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)：取2 mL 密度為1.5×105個(gè)/mL 的HepG2 接種到6 孔板中，使用不同濃度的酒糟粗提物分別刺激肝癌HepG2 細(xì)胞24 h，再收集細(xì)胞于流式管中，加入4 mL PBS 清洗細(xì)胞兩次，離心棄上清液，逐滴加入預(yù)冷的75%乙醇，4 ℃避光過(guò)夜后離心棄上清液，先后用PBS 和染液清洗細(xì)胞，除去乙醇，最后將PI/RNase 染液0.5 mL 重懸清洗后的細(xì)胞，室溫孵育15 min 后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)[13]。

細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：使用預(yù)冷的PBS 溶液清洗不同濃度酒糟粗提物處理后的HepG2 細(xì)胞2 次，再將不含EDTA 的胰酶500 mL 滴入培養(yǎng)皿，37 ℃消化細(xì)胞90 s 并轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫1500 r/min 離心5 min，再用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞1 次，用400 μL 1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞，再加5 μL Annexin VFITC 混勻后避光室溫孵育15 min，上機(jī)前5 min 再加5 μL PI 染色，并在上機(jī)前補(bǔ)加200 μL 1×Binding Buffer[14]，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.6 酒糟粗提物對(duì)HepG2 細(xì)胞CyclinA、CDK2、Bax、Bcl-2 基因表達(dá)的影響 采用TRIZOL 法提取使用不同濃度的酒糟粗提物分別刺激肝癌HepG2細(xì)胞24 h 的細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA 純度及濃度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)一步合成20 μL 體系的cDNA，采用TRIZOL 法 PCR Master Mix 10 μL、上下引物各0.5 μL、ddH2O 7 μL 以及cDNA 2 μL 構(gòu)成20 μL 的反應(yīng)體系，為減少誤差，每個(gè)樣本設(shè)置三個(gè)復(fù)孔。將96 孔板放入PCR 儀進(jìn)行反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性2 min，三步擴(kuò)增共39 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s），95 ℃溶解10 s、65 ℃退火60 s、97 ℃解鏈1 s，37 ℃冷卻30 s[15]。引物表見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.7 酒糟粗提物對(duì)HepG2 細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響 使用PBS 清洗3 次不同濃度酒糟粗提物刺激24 h 后的細(xì)胞，收集并轉(zhuǎn)移至1.5 mL 的離心管中，加入300 μL RIPA 裂解液，充分混勻，放置在水平搖床上冰浴反應(yīng)30 min（適時(shí)加入蛋白酶抑制劑PMSF）。上述蛋白液與BCA 試劑盒中的適量A、B 液混勻，放入酶標(biāo)儀中測(cè)量并計(jì)算濃度確定上樣量后，另取上述蛋白液加入1/4 蛋白液體積的5×蛋白上樣緩沖液，水浴煮沸10 min 后采用SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，PVDF 轉(zhuǎn)膜2 h，后用含5%脫脂奶粉的TBST 室溫封閉PVDF 膜大于1 h，TBST 洗膜3 次（每次10 min），PVDF 膜孵育一抗過(guò)夜，清洗后加入二抗孵育2 h，最后向PVDF 膜滴加ECL 超敏發(fā)光液A、B 各300 μL 進(jìn)行顯影，使用軟件Image J 進(jìn)行灰度分析[16]，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS Statistics 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD 法），P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 LC-MS 檢測(cè)酒糟粗提物的組成成分

酒糟粗提物中含有43 種物質(zhì)，由表2 可知，其中包括多種曾被報(bào)道具有護(hù)肝作用的活性物質(zhì)或其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，如相對(duì)含量最高（4.670%）的氟代木犀草素，其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物木犀草素對(duì)5-氟尿嘧啶抗肝癌具有增敏作用[17]，相對(duì)含量為0.207%的環(huán)小葉黃楊堿，其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物黃楊堿可調(diào)節(jié)肝癌周期[18]。小檗紅堿具有多種抗癌活性[19]，雷藤三萜內(nèi)酯A、呋喃甲酰胺、異葉烏頭堿、榛仁球蛋白、植醇、異葉烏頭堿、加拿大麻醇甙、ζ-胡蘿卜素等8 種成分也體現(xiàn)出抗肝癌或其他癌細(xì)胞的作用[20?24]。

表2 酒糟粗提物的主要活性成分Table 2 Components of abstract from distillers' grains

2.2 酒糟粗提物對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的抑制作用

不同濃度的酒糟粗提物處理HepG2 細(xì)胞后2 d 內(nèi)每10 min 連續(xù)讀取HepG2 細(xì)胞的NCI 值（Normalized Cell Index），結(jié)果見(jiàn)圖1。從添加酒糟提取物后12、24、36 及48 h 的不同濃度的NCI 值可以看出，隨著作用時(shí)間的增加，24 h 后酒糟提取物抑制HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)的作用開(kāi)始顯現(xiàn)，這與多種中藥提取物的作用時(shí)間接近[25]。24 h 后，酒糟提取物對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的抑制作用與酒糟提取物濃度有關(guān)，與0 μg/mL 相比，酒糟粗提物在濃度20 μg/mL時(shí)對(duì)HepG2 細(xì)胞NCI 值影響不大，但從濃度60 μg/mL 開(kāi)始能夠顯著降低NCI 值（即抑制HepG2細(xì)胞的增殖）（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)RTCA 2.1 軟件計(jì)算得到酒糟粗提物在12 h 的IC50=110 μg/mL。

圖1 酒糟粗提物對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibition on proliferation of HepG2 cells of crude extraction from distillers' grains

2.3 酒糟粗提物對(duì)HepG2 細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析顯示，HepG2 細(xì)胞在S 期的比例明顯高于對(duì)照組（P<0.05），推測(cè)酒糟提取物可能導(dǎo)致HepG2 細(xì)胞阻滯在S 期，當(dāng)酒糟粗提物的濃度升高S 期占比逐漸升高，見(jiàn)圖2A。Real-time PCR 結(jié)果表明，添加濃度為78.9 μg/mL 和98.0 μg/mL的酒糟粗提物后，Cyclin A 和CDK2 蛋白的mRNA表達(dá)量顯著低于對(duì)照（P<0.05），見(jiàn)圖2B、C，可能是由于酒糟提取物抑制了Cyclin A 及CDK2 的生成，Western-Blot 證實(shí)，S 期的周期蛋白CyclinA 及其激酶CDK2 表達(dá)量顯著低于對(duì)照（P<0.05），見(jiàn)圖2D、E、F，表明酒糟粗提物使HepG2 細(xì)胞周期被阻滯在S 期的機(jī)制主要在于DNA 合成期相關(guān)的周期蛋白CyclinA 及其激酶CDK2 的mRNA 和蛋白的表達(dá)量隨酒糟粗提物濃度的增加而降低，使肝癌HepG2細(xì)胞不能通過(guò)S 期的檢查點(diǎn)，無(wú)法進(jìn)入G2/M 期，從而抑制了其增殖[26?29]。

圖2 酒糟粗提物對(duì)HepG2 細(xì)胞周期的影響Fig.2 Effects of crude extraction from distillers' grains on HepG2 cell cycle

2.4 酒糟粗提物對(duì)HepG2 細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2 細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示藥物處理組的細(xì)胞凋亡要顯著多于對(duì)照組0 μg/mL 且與酒糟粗提物的濃度成正相關(guān)（P<0.05），見(jiàn)圖3A。Real-time PCR 結(jié)果表明，與對(duì)照組0 μg/mL相比，隨著酒糟粗提物濃度的增加，Bcl-2 的mRNA表達(dá)量逐漸降低，49.5、78.9 和98.0 μg/mL 這3 組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而B(niǎo)ax的mRNA 表達(dá)量逐漸升高，78.9 和98.0 μg/mL 這兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖3B、C。Western Blot 進(jìn)一步驗(yàn)證表明，酒糟粗提物刺激后的肝癌HepG2 細(xì)胞的Bcl-2 的表達(dá)量隨濃度升高而顯著降低，Bax 的表達(dá)量隨濃度升高而顯著升高（P<0.001），見(jiàn)圖3D。這表明酒糟提取物誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡與細(xì)胞內(nèi)決定細(xì)胞凋亡敏感性起重要作用的Bcl-2 與Bax[30?31]相對(duì)表達(dá)量有關(guān)，其誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制在于通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2 和Bax 的相對(duì)表達(dá)量，從而誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞發(fā)生凋亡，該機(jī)制類(lèi)似于5-FU、順鉑、喜樹(shù)堿等[32]抗癌藥物。

圖3 酒糟粗提物對(duì)HepG2 細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effects of crude extraction from distillers' grains on apoptosis of HepG2 cells

2.5 酒糟粗提物對(duì)介導(dǎo)凋亡的線(xiàn)粒體通路的影響

Western Blot 檢測(cè)表明，經(jīng)藥物刺激后的肝癌HepG2 細(xì)胞，CYTC、Cleaved-Caspase-9 及Cleaved-Caspase-3 的表達(dá)量顯著升高（P<0.05），Caspase-9 及Caspase-3 的表達(dá)量顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖4，這表明在Bcl-2、Bax 介導(dǎo)凋亡的三條通路（線(xiàn)粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和死亡受體通路）中，酒糟粗提物促進(jìn)肝癌HepG2 細(xì)胞發(fā)生凋亡可能和凋亡的線(xiàn)粒體途徑被激活相關(guān)。

圖4 酒糟粗提物對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響Fig.4 Effects of crude extraction from distillers' grains on the protein levels of apoptosis-related proteins

3 討論與結(jié)論

本研究主要針對(duì)酒糟中的生理活性物質(zhì)開(kāi)展研究，采用中藥數(shù)據(jù)庫(kù)從濃香型白酒糟中鑒定出氟代木犀草素、環(huán)小葉黃楊堿、榛仁球蛋白、植醇、異葉烏頭堿、加拿大麻醇甙、ζ-胡蘿卜素、吐葉醇、小檗紅堿等多種具有抗癌活性的成分。體外實(shí)驗(yàn)表明，酒糟粗提物可抑制HepG2 細(xì)胞的增殖，并通過(guò)激活介導(dǎo)凋亡的線(xiàn)粒體通路誘導(dǎo)肝癌HepG2 細(xì)胞發(fā)生凋亡。

與來(lái)源于藥物或昂貴天然產(chǎn)物不同，酒糟提取物來(lái)源于糧食發(fā)酵后的副產(chǎn)物，具有廉價(jià)、無(wú)害的屬性，這不僅為綠色保健食品的開(kāi)發(fā)提出了新的思路，也在酒糟現(xiàn)有利用途徑（飼料、肥料、燃料等）的基礎(chǔ)上，為酒糟資源的深度綜合開(kāi)發(fā)提供了新的視角。但與活性成分含量相對(duì)較高的中藥相比，酒糟活性成分的提取還存在活性成分濃度相對(duì)較低、雜質(zhì)干擾等問(wèn)題，后續(xù)將進(jìn)一步優(yōu)化提取純化方法，同時(shí)采用代謝組學(xué)方法進(jìn)一步分離酒糟粗提物，聚焦其中的抗癌活性成分，解析其分子結(jié)構(gòu)，為相關(guān)抗癌藥物的研發(fā)提供新的思路。