姚俊朝, 張祥, 王壘壘, 金治賓, 張艷艷

腦膠質瘤(glioma)起源于神經(jīng)上皮細胞,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤,其發(fā)病率約占顱內中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的45%[1]。目前腦膠質瘤的治療方法以手術切除為主,結合術后化療、放療等輔助治療。然而由于腦膠質瘤具有侵襲性強、易復發(fā)等特點,手術切除難以徹底清除腫瘤,總體治療效果不佳,且預后較差[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切。研究表明,反義LncRNA(Antisense LncRNA)可通過轉錄及轉錄后修飾等多層面參與調控細胞生長、分化及死亡等多種生理病理進程[3-4]。FAS-AS1(antisense transense of FAS)是一個位于Fas基因1號內含子反義鏈上的反義LncRNA,其在正常成人心臟、肝臟、胰腺等多種組織中表達上調。有研究顯示,反義LncRNA FAS-AS1在乳腺癌組織及乳腺癌細胞中的表達分別低于正常乳腺組織及正常乳腺細胞,且對宿主基因Fas的表達及乳腺癌細胞的增殖能力有一定影響作用[5]。但其在腦膠質瘤組織中的表達情況,目前尚鮮有報道。本研究通過檢測腦膠質瘤組織中LncRNA FAS-AS1的表達情況,以期探討其與腦膠質瘤患者臨床病理參數(shù)及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2015年1月至2016年12月在我院就診的58例腦膠質瘤患者為研究對象,其中男35例,女23例,年齡25～70歲,平均(46.24±12.25)歲。按照世界衛(wèi)生組織(WHO)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級標準分為:Ⅰ級8例,Ⅱ級11例,Ⅲ級30例,Ⅳ級9例。病理類型為:星型細胞瘤28例,少突膠質細胞瘤18例,其他12例。納入標準:①符合2018年腦膠質瘤診療規(guī)范[6]中腦膠質瘤的標準;②首次經(jīng)鏡下手術全切除治療;③術前未經(jīng)放、化療及其他輔助性治療。排除標準:①患有精神疾病患者;②患有傳染性疾病患者。另擇同期因顱腦外傷而行手術治療的患者42例為對照組,其中男22例,女20例,年齡26～70歲,平均(47.05±12.21)歲。兩組患者性別(χ2=0.347,P=0.556)、年齡(t=0.327,P=0.745)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,患者均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 根據(jù)影像學攝片(CT或MRI)判斷腫瘤部位、腫瘤直徑、瘤周腦水腫(Peritumoral vasogenic brain edema,PTBE)的分類及病理分級,參照WHO的分類標準[7]。

其中PTBE的嚴重程度根據(jù)MRI診斷顯示水腫最明顯及腫瘤直徑最大的平面上測到的水腫帶寬度進行評估,用水腫指數(shù)EI進行表示,即T2加權圖像瘤周水腫的最大直徑和相應層面腫瘤最大直徑比,或增強CT掃描顯示低密度的瘤周水腫的最大直徑與相應層面腫瘤最大直徑的比值。當EI=1時說明無瘤周水腫,EI>2為重度水腫,1

1.2.2 主要試劑及儀器 RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒及miScript SYBR Green PCR Kit均購自天根生化科技(北京)有限公司。飛利浦16層Brilliance CT購置荷蘭飛利浦公司,GE1.5T及3.0T超導型磁共振掃描儀購置美國GE公司。

1.2.3 樣本采集與保存 取腦膠質瘤患者及顱腦外傷患者手術切除后的腦膠質瘤組織及正常腦組織,并及時將其保存于-80 ℃液氮中待測。

1.2.4 采用實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)法檢測LncRNA FAS-AS1的表達 將腦膠質瘤組織及正常腦組織放入研缽,加入液氮,迅速進行研磨,采用Trizol法提取腦膠質瘤組織及正常腦組織中的總RNA,采用蛋白核酸分析儀檢測其濃度及純度,采用反轉錄試劑盒反轉錄RNA得cDNA,以該cDNA為模板,按miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒說明書配制20 μl反應體系進行RT-qPCR實驗。反應條件:95 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個循環(huán),72 ℃延伸5 min。LncRNA FAS-AS1及內參GAPDH的引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法對LncRNA FAS-AS1的表達水平進行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5 隨訪 自患者出院之日起,對患者進行門診復查或者電話隨訪,隨訪時間為2年,記錄患者的生存情況,以患者死亡、失訪或最近一次隨訪時間為終點。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 腦膠質瘤組織及正常腦組織中LncRNA FAS-AS1的表達情況

腦膠質瘤組織及正常腦組織中LncRNA FAS-AS1的表達水平分別為1.01±0.32、2.05±0.21,腦膠質瘤組織LncRNA FAS-AS1的表達水平低于正常腦組織(t=7.544,P<0.05)。

2.2 LncRNA FAS-AS1與腦膠質瘤臨床病理參數(shù)的關系

以腦膠質瘤組織中LncRNA FAS-AS1表達水平的均值為界,將腦膠質瘤分為低表達組(26例)與高表達組(32例)。LncRNA FAS-AS1低表達組患者腫瘤直徑>3 cm、病理分級Ⅲ～Ⅳ級、重度PTBE比例高于高表達組(P<0.05),性別、年齡、腫瘤部位、病理類型與高表達組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。

表2 不同LncRNA FAS-AS1表達組與腦膠質瘤臨床病理參數(shù)的關系 [例(%)]

2.3 LncRNA FAS-AS1表達水平與腦膠質瘤患者預后的關系

所有患者均獲隨訪,平均隨訪時間為(20.51±2.24)個月。本組患者中有28例死亡,2年生存率為51.72%,中位生存時間為(16.42±2.63)個月。其中LncRNA FAS-AS1低表達患者2年生存率為30.77%,顯著低于高表達患者的68.75%(Log-rankχ2=7.674,P<0.05),見圖1。

圖1 LncRNA FAS-AS1表達水平與腦膠質瘤患者預后的關系

2.4 影響膠質瘤患者預后因素的Cox回歸分析

以LncRNA FAS-AS1表達、PIBE、病理分級、腫瘤直徑為自變量,以腦膠質瘤患者預后(生存=0,死亡=1)為因變量,進行多因素Cox回歸分析,結果顯示,LncRNA FAS-AS1低表達、病理分級Ⅲ～Ⅳ級、重度PIBE是影響腦膠質瘤患者預后的危險因素,見表3。

表3 腦膠質瘤患者預后的多因素Cox回歸分析

3 討論

腦膠質瘤細胞最大的生物學特性是細胞呈浸潤生長,臨床診斷及分級準確度低,手術清除困難,術后容易復發(fā),盡管現(xiàn)代臨床治療方式已由單一手術治療轉變?yōu)橐允中g為主,結合術后化療、放療的綜合治療方式,然而腦膠質瘤患者的治愈率并未得到明顯改善,術后復發(fā)率及病死率依然較高[8-9]。因此尋找可早期預測腦膠質瘤預后情況的生物學指標,對改善患者生存情況具有重要意義。

LncRNA具有多種生物活性,參與細胞分化、胚胎與組織發(fā)育等生物學過程,且在腫瘤發(fā)生發(fā)展及神經(jīng)代謝疾病中發(fā)揮重要的功能[10]。目前已發(fā)現(xiàn)LncRNA MEG3等多種LncRNA可能在膠質瘤的發(fā)病機制中起關鍵的調控作用[11]。反義LncRNA是一類基因序列與宿主基因mRNA互補,轉錄方向與其相反的LncRNA分子。LncRNA FAS-AS1是一個位于Fas基因1號內含子反義鏈上的反義LncRNA,在B細胞淋巴瘤患者淋巴瘤細胞及外周血中表達異常下調[12]。有研究證實,B淋巴細胞瘤中,FAS-AS1可與RBM5結合并相互作用,進而影響Fas基因6號外顯因子的轉錄,對sFas表達產(chǎn)生抑制作用[13]。本研究結果顯示,腦膠質瘤組織中LncRNA FAS-AS1的表達水平顯著低于正常腦組織,提示LncRNA FAS-AS1在腦膠質瘤組織中表達下調,可能在腫瘤發(fā)生中扮演抑癌基因的角色,參與腦膠質瘤的發(fā)生。本研究進一步分析腦膠質瘤組織中LncRNA FAS-AS1的表達水平與患者臨床病理參數(shù)的關系,結果顯示,LncRNA FAS-AS1低表達組患者腫瘤直徑>3 cm、病理分級Ⅲ～Ⅳ級比例高于高表達組,推測原因可能是一方面LncRNA FAS-AS1可分泌至血液中造成腫瘤細胞的遷移、侵襲,導致腫瘤直徑加大,病理分級加重;另一方面,腫瘤直徑越大,病理分級越嚴重,又可能導致合成和釋放的LncRNA FAS-AS1越少,進一步提示LncRNA FAS-AS1可能參與腦膠質瘤的發(fā)生發(fā)展。PTBE是腦膠質瘤影像學檢測中常見的表現(xiàn),其主要是由于腫瘤內毛細血管內皮結構及功能改變,或因生化因子對血流屏障及血腦屏障產(chǎn)生損害,而造成蛋白外滲、血管通透性增加,導致液體聚集在腫瘤間質或腫瘤周圍腦實質中而形成。本研究中LncRNA FAS-AS1低表達組患者重度PTBE比例高于高表達組,推測可能與腦膠質瘤血管通透性的增加,而造成腦膠質瘤瘤周水腫,進而引起腫瘤周圍腦組織扭曲,局部組織壓升高,造成腦缺血、缺氧,患者嚴重程度加重有關。

臨床數(shù)據(jù)表明,腦膠質瘤在成人患者中的中位生存期僅14.6個月[14],王瑩等[15]從公用數(shù)據(jù)庫中國腦膠質瘤基因組圖譜計劃中下載了包含B細胞淋巴瘤因子3(B-cell CLL/lymphoma 3,BCL3)基因表達及患者預后的膠質瘤患者數(shù)據(jù),通過分析發(fā)現(xiàn),低級別膠質瘤患者術后總生存期為0.03～211個月,中位生存期為23.19個月;膠質母細胞瘤患者術后總生存期范圍為0.1～127.5個月,中位生存期為12.42個月。本研究對58例腦膠質瘤患者進行2年隨訪,死亡28例,2年生存率為51.72%,中位生存時間為(16.42±2.63)個月。其中LncRNA FAS-AS1低表達患者2年生存率為30.77%,顯著低于高表達患者的68.75%,提示LncRNA FAS-AS1表達可能與腦膠質瘤患者預后有關,且LncRNA FAS-AS1的低表達提示預后較差。本研究進一步通過Cox模型分析顯示,LncRNA FAS-AS1低表達、病理分級Ⅲ～Ⅳ級、重度PIBE是影響腦膠質瘤患者預后的獨立危險因素,提示LncRNA FAS-AS1參與腦膠質瘤的發(fā)生發(fā)展,且可能成為腦膠質瘤患者不良預后的生物標記物之一。