張淑玫，陳佳娜，程 賽，周藝吉，辛志明，陳玲凡，張 旗*

(1.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)系，福州 350122；2.福建省新藥安全評(píng)價(jià)中心，福州 350122)

在抗擊新型冠狀病毒肺炎疫情中，中醫(yī)藥發(fā)揮了良好的作用。劉清泉等[1-2]研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方制劑能顯著縮短其病程，減輕患者的臨床癥狀，減少普通型病例向重型及危重型的轉(zhuǎn)化，降低病死率。各地衛(wèi)生主管部門(mén)以中醫(yī)專(zhuān)家共識(shí)性的病因病機(jī)分析為依據(jù)，制定了一批中醫(yī)診療方案，向3個(gè)階段不同證型新型冠狀病毒肺炎推薦了指導(dǎo)性處方。全國(guó)地級(jí)市及以上衛(wèi)生管理部門(mén)發(fā)布了308 種中藥處方。治療期主要證型為內(nèi)閉外脫、疫毒閉肺、寒濕郁肺及邪熱壅肺，共涉及 187 味藥材。清營(yíng)湯是治療新型冠狀病毒肺炎的常用復(fù)方之一，服用后低熱消失，納食改善，精神轉(zhuǎn)好，可明顯改善肺部炎癥[3]。

清營(yíng)湯出自吳鞠通的《溫病條辨》，為溫病學(xué)的經(jīng)典方劑[4]。該方由水牛角、玄參、地黃、麥冬、金銀花、淡竹葉、黃連、連翹及丹參9味中藥組成，治療熱在營(yíng)分證[5]，可清營(yíng)透氣，用于治療邪熱初入營(yíng)分、身熱、時(shí)有譫語(yǔ)、心煩不得入眠、或斑疹隱隱、舌絳而干、脈象細(xì)數(shù)的病癥，臨床主治急性肺炎、病毒性腦炎、乙型腦炎、流行性腦脊髓膜炎、急性胰腺炎、過(guò)敏性紫癜、膿毒癥、敗血癥、腸傷寒或其他熱性病證屬熱入營(yíng)衛(wèi)者[6-7]。藥理研究表明，清營(yíng)湯具有解熱、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等作用，在一定程度上可改善血液流變、心肌損害[7]。

清營(yíng)湯臨床應(yīng)用廣泛，但其復(fù)方藥效物質(zhì)尚未闡明。因此本研究將建立清營(yíng)湯提取物的超高效液相色譜法(UPLC)特征圖譜，并通過(guò)超高效液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-ESI-MSn)總離子流圖，根據(jù)質(zhì)譜裂解信息以及文獻(xiàn)對(duì)比結(jié)果，分析清營(yíng)湯提取物的化學(xué)成分。

1 儀器與試藥

1.1儀器 DZTE 型電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；BUCHI 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(瑞士步琦有限公司)；5810R型離心機(jī)(德國(guó) Effendorf 公司)；AR124CN型電子天平(奧豪斯儀器有限公司)；Waters ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀(美國(guó) Waters 公司)；0.22 μm微孔過(guò)濾膜(有機(jī)系，津騰公司)；靜電場(chǎng)軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)； Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(150 mm×3 mm，1.8 μm，美國(guó)Agilent公司)。

1.2試藥 甲酸和乙酸為分析純，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇(色譜純)，賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司；乙腈(色譜純)，德國(guó)默克公司；無(wú)水乙醇(分析純)，北京化工廠；蒸餾水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司；清營(yíng)湯處方藥材，購(gòu)自北京同仁堂藥店。

2 方法與結(jié)果

2.1特征圖譜的建立

2.1.1清營(yíng)湯提取物的制備 清營(yíng)湯處方組成：水牛角30 g，生地黃15 g，玄參9 g，竹葉心3 g，麥冬9 g，丹參6 g，黃連5 g，金銀花9 g，連翹6 g。藥材加10倍量體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇回流提取3次，每次1 h，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮，定容至250 mL，得到質(zhì)量濃度為1.1 g·mL-1的清營(yíng)湯提取液。

2.1.2色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(150 mm×3 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：1 mL·L-1甲酸-甲醇；流速：0.2 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。流動(dòng)相A為 1 mL·L-1甲酸，流動(dòng)相B為甲醇，洗脫梯度：0 min，3%B；5 min，6%B；7 min，7%B；20 min，15%B；60 min，17%B；63 min，23%B；80 min，24%B；90 min，30%B；105 min，34%B；125 min，34%B；135 min，40%B。

2.1.3方法學(xué)考察

2.1.3.1精密度實(shí)驗(yàn) 取清營(yíng)湯藥材，按照2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1.2項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。通過(guò)對(duì)記錄的色譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算得其相對(duì)保留時(shí)間RSD值小于3%，16個(gè)共有峰面積的RSD值≤3%，表明儀器精密度良好。

2.1.3.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取清營(yíng)湯處方藥材，按照2.1.1項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按照2.1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。通過(guò)對(duì)記錄的色譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算得其相對(duì)保留時(shí)間的RSD值小于3%，16個(gè)共有峰面積的RSD值≤3%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.1.3.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取清營(yíng)湯處方藥材，按照2.1.1項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按照2.1.2項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、36、48 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。通過(guò)對(duì)記錄的色譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算得其相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于3%，16個(gè)共有峰面積的RSD值≤3%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4指紋圖譜的建立 按照2.1.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，選擇體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇回流提取所得的樣品溶液，并將其平行制備10份后平行進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)圖1。通過(guò)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算相似度，結(jié)果見(jiàn)表1。10個(gè)批次的樣品相似度均大于0.900，說(shuō)明不同批次的樣品無(wú)顯著差異。

圖1 對(duì)照品(R)和10批清營(yíng)湯提取物的特征圖譜

表1 10批清營(yíng)湯提取物的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.2利用UPLC-MS-MSn解析清營(yíng)湯提取物的化學(xué)成分 質(zhì)譜條件為電噴霧(ESI)離子源，采用正、負(fù)離子模式檢測(cè)，毛細(xì)管溫度為350 ℃，氮?dú)饬魉贋?0 arb，輔助氣流速為10 arb，噴霧電壓為3 kV，毛細(xì)管電壓為35 V，管透鏡電壓為110 V，樣品先進(jìn)行全掃描，分辨率設(shè)為30 000，掃描范圍m/z為100～1 500，二級(jí)和三級(jí)質(zhì)譜采用動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)依賴(lài)性掃描，選取上一級(jí)豐度前10強(qiáng)的峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離 (CID) 碎片掃描，以離子阱進(jìn)行檢測(cè)。

根據(jù)UPLC-MS-MSn中總離子流圖中峰的保留時(shí)間以及離子碎片，并結(jié)合參考文獻(xiàn)，共解析出61個(gè)化合物[8-20]，包括黃酮類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)、苯丙素類(lèi)、生物堿類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)和三萜皂苷類(lèi)等化合物。見(jiàn)表2和圖2。

圖2 清營(yíng)湯提取物的總離子流圖

3 討論

本研究通過(guò)考察清營(yíng)湯在不同檢測(cè)波長(zhǎng)、不同質(zhì)量濃度、不同提取溶劑、不同流動(dòng)相條件下的色譜圖，得到清營(yíng)湯提取物UPLC的最佳洗脫條件，建立清營(yíng)湯的最佳色譜圖。同時(shí)運(yùn)用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)得到UPLC-ESI-MSn總離子流圖，并根據(jù)其質(zhì)譜的裂解碎片信息及文獻(xiàn)信息推斷出清營(yíng)湯的主要化學(xué)成分，其主要含有地黃苷(地黃苷A、地黃苷D、地黃苷C、地黃苦苷、洋地黃葉苷 C、焦地黃苷A1/A2等)、綠原酸(異綠原酸C、異綠原酸B、新綠原酸、隱綠原酸等)和連翹酯苷E等類(lèi)別，共61個(gè)化合物。其中通過(guò)查詢(xún)文獻(xiàn)得知，連翹酯苷E、二氫梓醇、腺苷、單蜜力特苷、蜜力特苷、8-表番木鱉酸、毛蕊花糖苷、連翹酯苷和地黃苷類(lèi)等來(lái)源于麻杏石甘湯中的地黃；6-O-甲基梓醇、哈巴俄苷、ningpogoside A、cistanoside F、6-O-methylaucubin和cistanoside D等來(lái)源于玄參；連翹酯苷A、蘆丁和槲皮素來(lái)源于連翹；木蘭花堿、非防己堿、表小檗堿、藥根堿、黃連堿、巴馬亭和小檗堿等來(lái)源于黃連；馬錢(qián)子苷、檸檬酸、奎寧酸、馬錢(qián)子酸和綠原酸類(lèi)來(lái)源于金銀花；methylophiopogonanone A、lirigramoside A、ophiopojaponin A、(+)-pinoresinol-β-D-glucoside和(+)-epipinoresinol-4′-O-glucoside等來(lái)源于麥冬；其余各成分歸屬于其余藥材。本研究闡明了清營(yíng)湯的基本化學(xué)成分，為開(kāi)發(fā)治療新型冠狀病毒肺炎藥物提供了理論依據(jù)，為進(jìn)一步指導(dǎo)清營(yíng)湯的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。