張笑笑，張 鑫，賀敬霞，張曉莉，黨艷妮，陳衍斌*

(1.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院，咸陽(yáng) 712046；2.陜西步長(zhǎng)高新制藥有限公司，西安 710075)

小兒健胃咀嚼片是由沙參、稻芽、白芍、玉竹、炒麥芽、山楂、麥冬、陳皮等11味藥材經(jīng)提取制成的中藥復(fù)方制劑，具有健脾消食、清熱養(yǎng)陰的功效，主治脾胃陰虛所致的食欲減退和消化不良[1]。方中荷葉、麥芽在處方中占比較大，本研究遵循以主藥成分為控制要素的原則，并增加對(duì)制劑主藥荷葉、麥芽的薄層色譜(TLC)鑒別。麥芽性平味甘，歸脾、胃經(jīng)，主要功效是行氣消食、健胃開脾[2-3]，在小兒健胃咀嚼片中發(fā)揮重要作用。陳皮中主要含黃酮類化學(xué)成分，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效[4-5]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，橙皮苷對(duì)胃腸有興奮作用，能明顯拮抗阿托品、腎上腺素引起的小腸胃排空和小腸推進(jìn)抑制作用，對(duì)平滑肌也有明顯的先興奮后抑制作用，是健胃消食類藥物的主要成分之一[6-7]。

小兒健胃咀嚼片藥品標(biāo)準(zhǔn)于2010年獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局的審批，并已實(shí)施。標(biāo)準(zhǔn)中通過(guò)TLC鑒別對(duì)北沙參、白芍、荷葉進(jìn)行鑒定，通過(guò)高效液相色譜法(HPLC)對(duì)陳皮中橙皮苷的含量進(jìn)行控制，但其標(biāo)準(zhǔn)控制項(xiàng)較單一，難以對(duì)小兒健胃咀嚼片進(jìn)行全面的質(zhì)量控制。因此，本研究在現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上[1]，參考相關(guān)文獻(xiàn)，增加了荷葉藥材(荷葉堿)和麥芽藥材的TLC鑒別[8-9]，建立了一種快速、高效且能同時(shí)測(cè)定小兒健胃咀嚼片中橙皮苷和蕓香柚皮苷含量的測(cè)定方法[10-12]，旨在為小兒健胃咀嚼片的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 ACQuity Class UPLC系統(tǒng)，包含二元高壓泵在線脫氣裝置、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱(美國(guó)Waters公司)；MS403TS102型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；ZF-2C型暗箱式自動(dòng)紫外分析儀(上海安亭電子儀器廠)；KQ-800KDE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q Direct 8型純水機(jī)[默克化工技術(shù)(上海)有限公司]；光電二級(jí)管陣列(PDA)檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)。

1.2試藥 荷葉對(duì)照藥材(批號(hào)121322-201805)、荷葉堿對(duì)照品(批號(hào)111566-201907)、麥芽對(duì)照藥材(批號(hào)121105-201808)和橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)110721-201818，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96%)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；蕓香柚皮苷對(duì)照品(批號(hào)MUST-19101010，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，成都曼斯特生物技術(shù)有限公司)；硅膠G薄層板(青島海洋化工有限公司)；乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher公司)；氫氧化鉀、碘化鉀(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；水為自制超純?nèi)ルx子水；其他試劑均為分析純。小兒健胃咀嚼片(批號(hào)分別為：20001、20002、20003，山東神州制藥有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1TLC鑒別

2.1.1荷葉 分別取3批小兒健胃咀嚼片，研成粉末，稱取4 g，加水40 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液用濃氨調(diào)節(jié)pH值至10～12，加三氯甲烷振搖提取3次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取荷葉對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取荷葉堿對(duì)照品適量，加三氯甲烷溶液制成質(zhì)量濃度為0.6 mg·mL-1的荷葉堿對(duì)照品溶液。取處方量的1/10，按照小兒健胃咀嚼片處方比例制備不含荷葉的陰性樣品，再按照上述供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。按照TLC法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(10∶0.5)為展開劑，展開7.5 cm，取出，晾干，噴以改良的碘化鉍鉀試液，日光燈下檢視。結(jié)果表明，供試品在與荷葉對(duì)照藥材和荷葉堿對(duì)照品相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性溶液無(wú)干擾。見圖1A。

2.1.2麥芽 分別取3批小兒健胃咀嚼片，研成粉末，稱取8 g，加無(wú)水乙醇50 mL，超聲處理40 min，濾過(guò)，濾液加500 g·L-1的氫氧化鉀1.5 mL，加熱回流15 min，置于冰浴中冷卻5 min，移至分液漏斗，加水20 mL 洗滌回流所用玻璃儀器，將水液合并置于分液漏斗中，用石油醚(30～60 ℃)振搖提取3 次，每次20 mL，合并石油醚液，揮干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL 使溶解，作為供試品溶液。另取麥芽對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取處方量的1/10，按照小兒健胃咀嚼片處方比例制備不含麥芽的陰性樣品，再按照上述供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。按照TLC法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，吸取上述溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯(10∶10∶2)為展開劑，展開8.0 cm，晾干，再以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯(10∶10∶1)為展開劑，展開，晾干，噴以體積分?jǐn)?shù)為15%的硝酸乙醇溶液，顯色，晾干，置于紫外光燈365 nm處檢視。結(jié)果表明，供試品在與麥芽對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性溶液無(wú)干擾。見圖1B。

圖1 TLC圖

2.2陳皮藥材中橙皮苷和蕓香柚皮苷的含量測(cè)定

2.2.1溶液的制備

2.2.1.1供試品溶液 分別取3批次小兒健胃咀嚼片，研成粉末，精密稱取1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min(53 kHz，500 W)，放冷，再稱定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾液過(guò)0.22 μm濾膜，即得。

2.2.1.2混合對(duì)照品溶液 精密稱取橙皮苷、蕓香柚皮苷對(duì)照品粉末適量，置于25 mL量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，制成2種成分質(zhì)量濃度分別為203.46、87.00 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.1.3陰性樣品溶液 取處方量的1/10，按照小兒健胃咀嚼片處方比例和制備工藝制備缺陳皮的陰性樣品，再按照2.2.1.1項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.2.2色譜條件 色譜柱為Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)柱。流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(洗脫程序?yàn)?～5 min，15%A～21%A；5～6 min，21%A～45%A；6～11 min，45%A～75%A；11～12 min，75%A～15%A)。流速為0.3 mL·min-1；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為2 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1專屬性實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液、供試品溶液以及缺陳皮的陰性樣品溶液各2 μL，進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，在2.2.2項(xiàng)下色譜條件下，供試品溶液中橙皮苷和蕓香柚皮苷與其他組分色譜峰均可達(dá)到基線分離(分離度大于1.5)，且陰性供試品溶液無(wú)干擾。見圖2。

圖2 UPLC圖

2.3.2線性范圍考察 按照2.2.1.2項(xiàng)下方法制備系列混合對(duì)照品溶液，其中橙皮苷的質(zhì)量濃度分別為10.17、30.52、61.04、91.55、152.60 μg·mL-1，蕓香柚皮苷的質(zhì)量濃度分別為4.35、13.05、26.10、39.15、65.25 μg·mL-1。分別精密吸取上述系列混合對(duì)照品溶液注入超高效液相色譜(UPLC)儀，按照2.2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以各成分峰面積為縱坐標(biāo)(y)、各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，制得橙皮苷和蕓香柚皮苷的回歸方程分別為y1=11 644x1+2 374.6(r1=0.999 9)和y2=8 981.7x2+33 139(r2=0.999 9)，線性范圍分別為10.17～152.60、4.35～65.25 μg·mL-1。

2.3.3精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.2.1.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液2 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按照2.2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得橙皮苷、蕓香柚皮苷峰面積積分的RSD值分別為1.23%、0.89%，表明該儀器精密度良好。

2.3.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)20003)，按照2.2.1.1項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按照2.2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得供試品溶液中橙皮苷和蕓香柚皮苷的平均含量分別為31.52、8.90 μg·mL-1，其RSD值分別為1.65%、1.17%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)20003)，按照2.2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在制備后0、2、4、6、8、10、12，16，20、24 h分別進(jìn)樣，測(cè)得供試品中橙皮苷和蕓香柚皮苷峰面積積分的RSD值分別為0.43%、0.94%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱定同一批樣品(批號(hào)20003)6份，分別精密加入2.2.1.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液適量，按照2.2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各組分回收率。結(jié)果見表1。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.4含量測(cè)定 取3批小兒健胃咀嚼片，按照2.2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算3批樣品中橙皮苷和蕓香柚皮苷的含量，結(jié)果見表2。由表2可知，小兒健胃咀嚼片每1 g含陳皮以蕓香柚皮苷和橙皮苷計(jì)，蕓香柚皮苷不得少于0.08 mg，橙皮苷不得少于0.32 mg。

表2 小兒健胃咀嚼片的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

小兒健胃咀嚼片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的含量控制項(xiàng)僅限于橙皮苷的含量測(cè)定，不能全面控制中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量。本研究首次采用UPLC法同時(shí)測(cè)定了小兒健胃咀嚼片中橙皮苷和蕓香柚皮苷的含量，該方法檢測(cè)速度快，僅需要12 min即可完成檢測(cè)、資源消耗小(3.6 mL流動(dòng)相即可)，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為提高小兒健胃咀嚼片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供參考。

3.1TLC鑒別藥材的選擇 小兒健胃咀嚼片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)北沙參、荷葉和白芍進(jìn)行TLC鑒別，在此基礎(chǔ)上，前期分別進(jìn)行了山楂、牡丹皮、麥冬、玉竹、荷葉、麥芽和山藥的TLC 鑒別預(yù)實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山楂、麥冬、玉竹和山藥的陰性樣品溶液均有較大干擾，因此不能通過(guò)調(diào)整供試品制備方法、展開劑和顯色劑等予以排除；并且研究發(fā)現(xiàn)，麥冬和玉竹的陰性樣品溶液互相干擾，經(jīng)查閱文獻(xiàn)可知，玉竹藥材和麥冬藥材均屬于百合科，主要化學(xué)成分類型極為相似，均屬甾體皂苷類[13-15]；在荷葉TLC鑒別中，增加荷葉堿對(duì)照品作為對(duì)照(而原標(biāo)準(zhǔn)僅采用荷葉對(duì)照藥材作為對(duì)照)，可更加全面地控制荷葉藥材的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，麥芽和荷葉斑點(diǎn)顯色清晰、分離效果好，陰性樣品溶液無(wú)干擾，故增加麥芽和荷葉TLC鑒別用于小兒健胃咀嚼片的質(zhì)量控制。

3.2提取溶劑的選擇 分別采用純水、體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇、體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇作為提取溶劑，研究不同提取溶劑對(duì)樣品中各待測(cè)組分溶出的影響，結(jié)果表明，以體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇作為提取溶劑時(shí)，2種待測(cè)成分能同時(shí)出峰，且含量較高。

3.3提取方法的選擇 分別考察了2種提取方法，即分別用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇超聲提取30 min與加熱回流提取1 h，測(cè)定待測(cè)組分峰面積。結(jié)果表明，超聲提取較加熱回流提取待測(cè)組分含量低，但超聲提取法操作簡(jiǎn)單，節(jié)約時(shí)間，綜合考慮最終選用超聲提取法。

3.4液料比及提取時(shí)間的選擇 分別考察了3、6、10、15、20倍提取液料比，結(jié)果表明，液料比為10、15倍時(shí)，樣品中待測(cè)成分含量基本相同，因此，選定提取液料比為10倍。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定提取時(shí)間(30、45、60 min)對(duì)樣品中各待測(cè)成分溶出的影響，結(jié)果表明，各成分在提取30、45、60 min時(shí)結(jié)果基本相同，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，各成分含量變化不大，樣品在提取30 min后各組分已基本全部被提取[16]。因此，最終選擇10倍量體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇超聲提取30 min為小兒健胃咀嚼片的最佳提取方法。

3.5檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 將小兒健胃咀嚼片樣品溶液用PDA檢測(cè)器在210～400 nm范圍內(nèi)做全波長(zhǎng)掃描，得到橙皮苷、蕓香柚皮苷在283 nm波長(zhǎng)處有最大吸收[17]。在此基礎(chǔ)上，綜合考慮檢測(cè)時(shí)各色譜峰的響應(yīng)值要求，最終選擇283 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

中藥復(fù)方藥味多，成分復(fù)雜[18]，難以找到有效的方法測(cè)定其有效成分，導(dǎo)致中藥的發(fā)展始終滯后。近年來(lái)，眾多研究者紛紛開展中藥有效成分分析方法的研究，現(xiàn)已成為中藥研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[19-21]。本研究采用UPLC法對(duì)中藥復(fù)方小兒健胃咀嚼片建立2種有效成分的含量測(cè)定，也確定了含量限度。但由于本次研究樣品量較少，后期還需進(jìn)一步對(duì)多個(gè)批次樣品進(jìn)行含量測(cè)定研究，從而保證含量限度的合理性。

綜上所述，本研究成功建立了小兒健胃咀嚼片中麥芽、荷葉藥材的定性鑒別方法和陳皮中蕓香柚皮苷、橙皮苷的含量測(cè)定方法，均可用于小兒健胃咀嚼片的質(zhì)量控制。