李紀(jì)宏，劉晨旭，馮穎達(dá)，孫 陽，李小強，張慧楠

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥理學(xué)教研室，西安 710032；2.國家中醫(yī)藥管理局中藥胃腸藥理重點研究室，西安 710032)

腦卒中是嚴(yán)重威脅人類生命健康的重大疾病[1-2]。尋找并開發(fā)新的具有神經(jīng)保護(hù)作用的藥物對于減輕腦缺血再灌注損傷(CIRI)具有重要的臨床意義[3-4]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦中數(shù)量最多的細(xì)胞，通過藥物干預(yù)減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥釋放是改善CIRI預(yù)后的有效治療策略[5-7]。

胰高血糖素樣1受體(GLP-1R)屬于G蛋白偶聯(lián)受體，在心臟、腎臟、肝臟和腦等重要器官中均有表達(dá)[8-9]。腦內(nèi)GLP-1R激動能夠抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕炎癥損傷[10-11]。目前在臨床上應(yīng)用的GLP-1R激動劑均只能注射給藥[12]。Boc5 (C54H52N4O16S2)是通過高通量篩選的方法在48 600個小分子化合物庫中篩選得到的具有口服活性的GLP-1R小分子激動劑[13]。既往實驗結(jié)果表明，Boc5能夠通過激活GLP-1R降低血糖[14-15]，但其對CIRI的保護(hù)作用目前尚無報道，本研究通過小鼠大腦中動脈栓塞再灌注(MCAO/R)模型探討其作用及機制。

1 儀器與材料

1.1儀器 SZM45型體式顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；HC-X803型顯微精細(xì)鑷，寧波市成和顯微器械廠；紫外分光光度計，美國Bio-Rad公司；FV1000型激光掃描共聚焦顯微鏡，日本Olympus公司；Tanon-4200型化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

1.2試藥 Boc5，美國TargetMol Boston公司；2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)，美國Sigma公司；多聚甲醛溶液、磷酸鹽緩沖液(PBS)，均購自北京里根生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和過氧化氫酶(CAT)試劑盒，均購自南京建成科技有限公司；抗閉合蛋白、緊密連接蛋白-5單克隆抗體、二抗，均購自美國Cell Signaling Technology公司；TUNEL染色試劑盒，北京四正柏生物科技有限公司。

1.3實驗動物 成年雄性C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量為18～22 g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)動物中心。在溫度為25±2 ℃、相對濕度為50%～70%的條件下飼養(yǎng)，12 h明暗交替。

2 方法

2.1MCAO/R模型的建立 參照文獻(xiàn)方法[16]。將C57BL/6J小鼠用10 mg·mL-1戊巴比妥鈉麻醉，沿頸部正中剪開皮膚，鈍性分離皮下組織和肌肉，分離出頸總、頸外和頸內(nèi)動脈，栓線自頸內(nèi)動脈穿入，經(jīng)頸總動脈栓塞大腦中動脈，60 min后拔出栓線模擬再灌注過程。

2.2動物分組及處理 將75只C57BL/6J小鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和Boc5高、中、低劑量(10.0、5.0、2.5 μmol·kg-1)組，每組15只。Boc5高、中、低劑量組連續(xù)灌胃給藥7 d后行MCAO/R損傷；模型組給予等體積的生理鹽水7 d后行MCAO/R損傷。

2.3神經(jīng)功能缺陷評分 MCAO/R損傷24 h后，分別在各組小鼠中隨機取8只，按照改良神經(jīng)功能損害評分法(mNSS)評價神經(jīng)功能損傷情況[17-18]，其中提尾實驗3分，行為功能評分3分，感覺實驗評分2分，平衡木實驗6分，反射評分4分，總分為18分，總分越高，表示行為缺陷越嚴(yán)重。

2.4足誤實驗及轉(zhuǎn)棒實驗 神經(jīng)功能缺陷評分后隨即進(jìn)行足誤實驗及轉(zhuǎn)棒實驗[19-20]。足誤實驗旨在評價左前肢功能，將小鼠放在帶網(wǎng)格的格子架上(長×寬×高：40 cm×20 cm×30 cm)，計數(shù)小鼠左前爪錯誤次數(shù)和右前爪總步數(shù)；轉(zhuǎn)棒實驗旨在評價運動協(xié)調(diào)能力。MCAO/R損傷前每日對各組小鼠進(jìn)行1次訓(xùn)練，共3 d，MCAO/R損傷測定小鼠轉(zhuǎn)棒停留時間。

2.5生化指標(biāo)檢測 MCAO/R損傷24 h后，分別在各組小鼠中取6只，眼眶取血，分離血清，按照試劑盒說明書檢測SOD、MDA和CAT水平。

2.6TTC染色 各組分別取5只小鼠，處死，取腦，用TTC染色法計算梗死面積[21]。將腦組織置于-20 ℃環(huán)境下冷凍0.5 h，冠狀切面(2 mm·片-1)；將腦片置于TTC溶液(20 mg·mL-1)中，37 ℃孵育0.5 h，不斷翻動腦片，確保染色均勻；多聚甲醛(40 mg·mL-1)固定12 h，拍照，用Photoshop計算梗死面積百分比。

2.7原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)方法[22]，取新生1 d的幼鼠，酒精浸泡消毒后置于冰浴D-Hank′s平衡液的滅菌皿中，精細(xì)鑷取全腦置于另一滅菌皿中；剝離軟腦膜，夾碎皮層；加入10 mg·mL-1胰蛋白酶1.5 mL，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中消化30 min；離心管中將細(xì)胞吹打至混懸；200目篩網(wǎng)過濾；置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，每3 d換液1次。

2.8氧糖剝奪損傷/復(fù)氧 (OGD/R) 損傷 參考文獻(xiàn)方法[23]，用PBS沖洗細(xì)胞3次，置于無糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在無氧氣體(94%氮氣+6%二氧化碳)的密閉室內(nèi)培養(yǎng)6 h；損傷6 h后換回含血清DMEM培養(yǎng)基[24]，置于正常氧環(huán)境中培養(yǎng)24 h。

2.9血腦屏障通透性測定 伊文氏藍(lán)法檢測血腦屏障通透性[25-26]。MCAO/R后，分別在各組中取4只小鼠，尾靜脈注射20 mg·kg-1伊文氏藍(lán)，2 h后過量麻醉處死小鼠，取缺血側(cè)腦組織稱定質(zhì)量后置于EP管中，加入甲酰胺3.0 mL，55 ℃避光孵育24 h，用紫外分光光度計在630 nm波長處檢測吸光度值A(chǔ)，結(jié)果表示為A·g-1濕腦組織。

2.10酶聯(lián)免疫吸附 (ELISA) 法檢測炎性因子水平 采用試劑盒檢測炎性因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6 (IL-6)的水平。取星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液，4 ℃條件下以1 000 r·min-1離心5 min；加入到包被抗小鼠IL-1β、TNF-α和IL-6單抗的酶標(biāo)板上；每孔分別加入酶標(biāo)抗體液100 μL，混勻后置于37 ℃孵箱內(nèi)孵育1 h；洗滌酶標(biāo)板，甩干水分；每孔再分別加底物工作液100 μL，置于37 ℃孵箱中避光反應(yīng)10 min，顯色；每孔各加入50 μL終止液終止反應(yīng)；置于酶標(biāo)儀上測定各孔在490 nm波長處的吸光度值A(chǔ)。

2.11Western Blot實驗 MCAO/R后，分別在各組中取4只小鼠過量麻醉處死小鼠，取缺血半暗區(qū)組織，加入100 μL蛋白裂解液，冰上超聲，以13 000 r·min-1離心15 min，取上清液；蛋白質(zhì)定量(BCA)法測定蛋白濃度；加上樣緩沖液40 μg，煮沸5 min，電泳分離、轉(zhuǎn)膜，以0.05 g·mL-1脫脂奶粉封閉60 min，加一抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育12 h，TBST洗滌3次，加二抗(1∶5 000稀釋)，室溫孵育60 min，用TBST洗滌3次，ECL顯色，Bio Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照，Quantity One軟件對Western Blot條帶進(jìn)行灰度分析。

2.12統(tǒng)計學(xué)方法 2組間比較采用Student'st檢驗；多組間比較先進(jìn)行方差分析后進(jìn)行Dunnettt檢驗；P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1Boc5對MCAO/R所致小鼠行為缺陷的影響 見表1。由表1可知，與模型組比較，Boc5中、高劑量組神經(jīng)缺陷評分和足誤率顯著改善，轉(zhuǎn)棒停留時間明顯延長。實驗結(jié)果表明，Boc5能改善MCAO/R所致的小鼠行為學(xué)損傷。

表1 Boc5對MCAO/R所致小鼠行為缺陷的影響

3.2Boc5對MCAO/R后生化指標(biāo)的影響 見表2。由表2可知，與模型組比較，Boc5低、中、高劑量組SOD、MDA和CAT水平均顯著改善。

表2 Boc5對MCAO/R后血液生化指標(biāo)的影響

3.3Boc5對MCAO/R損傷后腦梗死面積的影響 由于Boc5中劑量組小鼠在行為學(xué)實驗中即表現(xiàn)出顯著的行為缺陷，故選取Boc5中劑量組給藥開展后續(xù)實驗。見表3和圖1。由表3和圖1可知，MCAO/R損傷后小鼠腦區(qū)出現(xiàn)大面積梗死(白色)；與模型組比較，Boc5 中劑量組能顯著減小小鼠腦梗死面積。

圖1 Boc5對MCAO/R損傷后腦梗死面積的影響

表3 Boc5對MCAO/R損傷后腦梗死面積的影響

3.4Boc5對MCAO/R致血腦屏障損傷的影響 見表4和圖2。由表4可知，模型組血腦屏障通透性明顯增加，與模型組相比，Boc5中劑量組血腦屏障通透性顯著降低。由圖2可知，模型組缺血半暗區(qū)閉合蛋白、緊密連接蛋白-5表達(dá)顯著降低，而Boc5中劑量組則顯著增加閉合蛋白、緊密連接蛋白-5表達(dá)水平。實驗結(jié)果表明，Boc5可顯著減輕MCAO/R所致的血腦屏障損傷。

圖2 Western Blot結(jié)果

表4 Boc5對MCAO/R致血腦屏障損傷的影響

3.5Boc5對MCAO/R損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖及活化的影響 見圖3和表5。由圖3和表5可知，MCAO/R損傷24 h后，模型組缺血半暗區(qū)內(nèi)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加，而Boc5中劑量組GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少。表明Boc5能夠改善MCAO/R損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖及活化。

圖3 Boc5對MCAO/R損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖及活化的影響

表5 Boc5對MCAO/R損傷后GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量的影響

3.6Boc5降低OGD/R損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子水平 CIRI后星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生和活化產(chǎn)生的炎性因子是導(dǎo)致血腦屏障破壞的重要原因。體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，ELISA法檢測OGD/R損傷后炎性因子水平，評價Boc5對星形膠質(zhì)細(xì)胞所致炎癥反應(yīng)的影響。ELISA實驗結(jié)果表明，氧糖剝奪損傷(OGD) 6 h，復(fù)氧24 h后，IL-1β、TNF-α和IL-6水平顯著增加，而Boc5可顯著降低IL-1β、TNF-α和IL-6炎性因子水平，見表6。

表6 Boc5對星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R損傷后炎性因子水平的影響

4 討論

缺血性腦卒中嚴(yán)重影響人類生命健康，尋找切實有效的防治靶點是科學(xué)家研究的熱點[27-28]。既往研究表明，GLP-1R激動劑exendin-4、liraglutide和pro-GLP-1等能有效減輕腦缺血面積、改善行為缺陷、減少神經(jīng)元細(xì)胞死亡和減輕炎性反應(yīng)，表明GLP-1R激動劑能成為防治CIRI的有效藥物[29]。目前，已有GLP-1R激動劑艾塞那肽、利拉魯肽批準(zhǔn)上市，然而這些藥物均為多肽類藥物，存在不能口服給藥的缺點。近年來，相繼發(fā)現(xiàn)了一些具有口服活性的小分子GLP-1R激動劑[30]，其中Boc5具有安全性高、半衰期長和能夠透過血腦屏障的優(yōu)點，具有較好的成藥性，本研究所采用劑量為前期實驗報道的安全劑量。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Boc5口服給藥后能夠顯著減輕MCAO/R所致的損傷。以上研究表明，Boc5可能成為具有口服吸收活性的防治CIRI的有效藥物。

星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的炎性因子是加重CIRI后血腦屏障損傷的重要誘因。本實驗結(jié)果表明，Boc5能降低星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R釋放的炎性因子水平。據(jù)此推測，Boc5的作用機制可能是通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞GLP-1R，通過減少炎性因子釋放減輕CIRI后血腦屏障損傷，最終改善CIRI，其確切機制還需進(jìn)一步實驗證實。