張 偉，王 彤，余建強(qiáng)，王曉琴，康艷生，常人元，劉靜靜*

(1.榆林市第一醫(yī)院藥劑科，榆林 719000；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，銀川 750004)

酒精性肝病(ALD)是臨床常見(jiàn)的一種因長(zhǎng)期和/或大量飲酒所致的肝病，已成為除病毒性肝炎所致肝損傷以外的第二大常見(jiàn)肝病[1]。酒精攝入機(jī)體后90%以上在肝臟代謝，少量直接通過(guò)肺、尿液和汗液排出體外，其在肝臟代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量活性氧自由基(ROS)和活性氮自由基，當(dāng)酒精攝入量超過(guò)肝臟的清除能力后，便會(huì)引起肝臟的氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致酒精脂肪肝、肝炎、肝硬化，甚至肝癌[2]。氧化槐果堿(OSC)是從天然藥物苦豆子中提取的藥代動(dòng)力學(xué)符合二房室模型的一種生物堿[3]。研究表明，OSC具有鎮(zhèn)痛[4-5]、抗炎[6-8]、抗肺損傷[9]、抗腫瘤[10-11]、抗驚厥[12-13]、抗腦缺血/再灌注損傷[14-15]等多種藥理作用，其肺損傷保護(hù)作用和神經(jīng)保護(hù)作用皆與OSC抗氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及抗凋亡等機(jī)制有關(guān)。本研究旨在通過(guò)建立急性酒精性肝損傷小鼠模型，觀察OSC對(duì)模型小鼠的肝功能指標(biāo)、抗氧化指標(biāo)以及肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響，探討OSC對(duì)酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷是否具有保護(hù)作用及其潛在的機(jī)制，為尋找保肝新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 低溫冰箱(-20 ℃，合肥榮事達(dá)電冰箱有限公司)；超低溫冰箱(-80 ℃，日本三洋電器股份有限公司)；DK-600型電熱恒溫水浴箱(上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；752型紫外分光光度儀(上海精密科學(xué)儀器廠)；超聲波細(xì)胞破碎機(jī)(南京貝帝實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；FM70型制冰機(jī)(美國(guó)Grant公司)；WH-861型旋渦混勻器(太倉(cāng)市科教器材廠)；METTLER TOLED型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；pH計(jì)(德國(guó)Beckman公司)；Olympus CHC-212光學(xué)顯微鏡(日本)奧林巴斯株式會(huì)社。

1.2試藥 氧化槐果堿(OSC，批號(hào)80041122，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)；56°白酒(北京紅星酒業(yè)有限公司)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、過(guò)氧化氫酶(CAT)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX) 試劑盒和丙二醛(MDA)試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3動(dòng)物 50只SPF級(jí)昆明種雄性小鼠，體質(zhì)量為(20±2) g，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于榆林市第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室清潔級(jí)動(dòng)物房,12 h光照和黑夜循環(huán),溫度為(22±2) ℃,相對(duì)濕度為50%～60%,標(biāo)準(zhǔn)飼料飼喂,自由飲水。

2 方法

2.1動(dòng)物分組、模型制備及動(dòng)物處理 隨機(jī)將50只小鼠分為5組，即正常對(duì)照組、模型組、OSC低(10 mg·kg-1)、中(20 mg·kg-1)、高(40 mg·kg-1)劑量組。適應(yīng)性飼喂1周后，OSC各劑量組(10、20、40 mg·kg-1)提前預(yù)防給藥2 d，同時(shí)正常對(duì)照組和模型組給予等體積(0.04 mL·g-1)的9 g·L-1生理鹽水；根據(jù)文獻(xiàn)方法[16]第3天模型組和OSC各劑量組小鼠均給予56°白酒(6 g·kg-1)灌胃，正常對(duì)照組給予等熱量、等體積的糖水(0.5 kg·L-1)灌胃，灌胃后5組均禁食不禁水，6 h后稱取各組小鼠體質(zhì)量后眼靜脈叢取血，室溫下靜置1 h，于4 ℃以4 000 r·min-1離心10 min，分離血清，分裝于0.5 mL的離心管，置于-20 ℃低溫冰箱中凍存。頸椎脫臼法處死小鼠，取肝臟全葉，用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水洗凈，經(jīng)濾紙輕柔吸去表面水分后稱質(zhì)量，計(jì)算肝臟指數(shù)。取肝臟小圓葉固定于多聚甲醛溶液(40 g·L-1)中做病理學(xué)檢查，其余放入液氮速凍，置于超低溫冰箱中(-80 ℃)保存。

2.2肝臟指數(shù) 用公式肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量÷體質(zhì)量×100%計(jì)算肝臟指數(shù)。

2.3血清ALT和AST水平檢測(cè) 取部分凍存于-20 ℃冰箱的血清，用752型紫外分光光度儀和AST、ALT試劑盒檢測(cè)小鼠血清ALT和AST水平。

2.4肝組織SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量測(cè)定 用4 ℃預(yù)冷的9 g·L-1生理鹽水將超低溫(-80 ℃)冰箱冷凍的肝組織制成10%肝組織勻漿液，于4 ℃以3 500 r·min-1離心10 min，取上層清液。按照 SOD、CAT、GSH-Px和MDA試劑盒操作說(shuō)明，用752型紫外分光光度儀檢測(cè)上層液中SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量。

2.5病理學(xué)檢查 將固定于40 g·L-1多聚甲醛溶液的肝臟小圓葉進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋切片、蘇木素-伊紅(HE) 染色，光鏡下觀察其肝組織形態(tài)學(xué)變化。

3 結(jié)果

3.1小鼠一般情況、體質(zhì)量及肝臟指數(shù)的變化 模型組和OSC各劑量(10、20、40 mg·kg-1)組小鼠在酒精灌胃后數(shù)分鐘出現(xiàn)翻正反射消失、嗜睡等醉酒狀態(tài)，灌酒6 h后小鼠逐漸蘇醒。各組小鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)均無(wú)中毒死亡情況，體質(zhì)量亦無(wú)明顯變化；模型組小鼠肝臟指數(shù)較正常對(duì)照組升高，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與正常對(duì)照組相比,OSC各劑量組肝臟指數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 OSC對(duì)小鼠初始體質(zhì)量、終末體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響 (n=10)

3.2OSC對(duì)小鼠血清肝損傷標(biāo)志酶ALT和AST的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清ALT和AST水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明小鼠急性酒精性肝損傷模型建立成功；給予OSC(10、20、40 mg·kg-1)預(yù)處理后，OSC各劑量組小鼠血清ALT和AST水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示OSC(10、20、40 mg·kg-1)預(yù)處理對(duì)小鼠酒精性肝損傷有保護(hù)作用。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 OSC對(duì)小鼠血清肝損傷標(biāo)志酶ALT和AST的影響 (n=10)

3.3肝臟病理學(xué)檢查 光鏡下，將小鼠肝臟組織切片進(jìn)行HE染色后，正常對(duì)照組可見(jiàn)肝小葉輪廓清晰，肝板以小葉中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，肝細(xì)胞排列整齊(見(jiàn)圖1)；模型組可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝板列紊亂，呈點(diǎn)狀、片狀壞死，胞漿中可見(jiàn)大小不等、數(shù)量不一的圓形脂肪空泡，小葉中央靜脈周圍和匯管區(qū)有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖1)；OSC(10、20、40 mg·kg-1)預(yù)防給藥后肝臟細(xì)胞間隙水腫明顯減輕，有散在炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞索排列較整齊，肝細(xì)胞呈多邊形，細(xì)胞分界清晰，核圓而清晰，位于細(xì)胞中央，提示OSC具有顯著改善急性酒精性肝損傷小鼠組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)的作用。

圖1 急性酒精性肝損傷小鼠肝臟病理切片 (HE×200)

3.4OSC對(duì)小鼠肝組織SOD、CAT、GSH-Px和 MDA的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織SOD、CAT和GSH-Px活性顯著下降(P<0.01)，MDA含量顯著提高(P<0.01)，提示酒精可誘導(dǎo)肝臟發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致氧化與抗氧化水平失衡；OSC(10、20、40 mg·kg-1)預(yù)防給藥后可明顯逆轉(zhuǎn)肝組織SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶的活性(P<0.05或P<0.01)，且顯著降低肝臟MDA含量(P<0.01)，并且隨著劑量增加效果更明顯，提示給予OSC預(yù)防給藥能夠明顯提高抗氧化酶的活性，減輕酒精引起的肝組織氧化損傷。見(jiàn)表3。

表3 OSC對(duì)小鼠肝組織SOD、CAT、GSH-Px和MDA的影響 (n=10)

4 討論

ALD具有較高的發(fā)病率和嚴(yán)重的不良預(yù)后，嚴(yán)重危害人類的身體健康。因此，尋找合適的藥物防止ALD的發(fā)生發(fā)展是當(dāng)務(wù)之急。天然抗氧化植物及其成分已成為抗急性酒精性肝損傷藥物研究的熱點(diǎn)[3]。本研究參考文獻(xiàn)方法[16]選用昆明種小鼠給予56°白酒一次性灌胃(6 g·kg-1)，建立小鼠急性酒精性肝損傷模型；并參考文獻(xiàn)[17-18]報(bào)道的OSC的半數(shù)致死量(LD50)，設(shè)計(jì)了低、中、高3個(gè)劑量(10、20、40 mg·kg-1)組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OSC(10、20、40 mg·kg-1)預(yù)處理2 d后，各劑量組均未出現(xiàn)小鼠死亡；OSC顯著改善了急性酒精性肝損傷小鼠的肝腫大，降低了肝臟指數(shù)；組織病理學(xué)結(jié)果表明，OSC顯著減輕肝臟炎性水腫，提示本研究OSC給藥劑量范圍設(shè)計(jì)適當(dāng)，且在該劑量范圍內(nèi)OSC對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠具有一定的保護(hù)肝作用。

ALT和AST是肝細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志酶，在正常血清中ALT和AST含量很低，當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，肝細(xì)胞中的ALT和AST進(jìn)入外周血清中，導(dǎo)致血清中ALT和AST含量明顯升高[19]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠血清ALT和AST含量較正常對(duì)照組明顯增高，且ALT增高幅度大于AST，此結(jié)果與文獻(xiàn)[19]報(bào)道一致。而相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[20-21]，AST的增高幅度大于ALT，其原因可能與小鼠飲酒量以及持續(xù)時(shí)間不同而導(dǎo)致肝損傷的嚴(yán)重程度不同有關(guān)。給予OSC(10、20、40 mg·kg-1)干預(yù)后，小鼠血清中的ALT和AST含量呈劑量依賴性下降，尤其是ALT含量顯著降低，其降酶機(jī)制可能與OSC維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性、減少肝細(xì)胞損傷，進(jìn)而減少肝細(xì)胞ALT、AST外漏有關(guān)，表明OSC對(duì)急性酒精性肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

經(jīng)胃腸道吸收的酒精約90%經(jīng)過(guò)乙醇脫氫酶(ADH)途徑、細(xì)胞色素P4502E1(CYP2E1)途徑和還原型輔酶Ⅱ(NADPH )途徑代謝為具有毒性的乙醛，并產(chǎn)生ROS。過(guò)量的 ROS 會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激狀態(tài)，促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化，產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，如 MDA，還會(huì)耗盡抗氧化酶，如SOD、CAT和GSH-Px[21-22]。本研究結(jié)果顯示，OSC(10、20、40 mg·kg-1)預(yù)處理后，肝組織中SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶活性顯著提高，而MDA含量顯著下降，表明OSC可減輕急性酒精性肝損傷小鼠的肝臟腫大程度、改善肝組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)、降低血清中ALT和AST含量，并增加肝組織SOD、CAT和GSH-Px活性，從而提高小鼠的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力，降低肝細(xì)胞的壞死程度，修復(fù)肝細(xì)胞損傷。

綜上所述，OSC對(duì)急性酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用，該作用可能與其通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力、清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和維持肝細(xì)胞膜穩(wěn)定性有關(guān)。