胡文靜，沈紅良，張 萌，延新年

(1.延安市中醫(yī)醫(yī)院眼科,陜西 延安716000;2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,陜西 西安710061;3.咸陽市第一人民醫(yī)院青光眼綜合眼病中心,陜西 咸陽712000)

干眼癥在臨床上比較常見，在臨床上主要表現(xiàn)為淚液異常、眼燒灼感、眼異物感、眼癢、眼紅、淚膜不穩(wěn)，伴或不伴隨眼部不適，嚴(yán)重時(shí)可能會導(dǎo)致視力障礙甚或失明[1]。該病多發(fā)生于女性，亞洲人多于其他人種，老年人多于青年人[2]。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin，TSLP)是一種上皮細(xì)胞來源的細(xì)胞因子，相關(guān)研究[3-5]表明：其在Th2細(xì)胞介導(dǎo)的過敏性炎癥中發(fā)揮重要作用，并在人體天然免疫以及適應(yīng)性免疫能力方面具有調(diào)控作用。炎癥因子可參與眼部多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，包括鞏膜炎、難治性葡萄膜炎、角膜炎等[6]。特別是白介素(Interleukin，IL)-18可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，從而減少淚液分泌，誘導(dǎo)干眼癥的發(fā)生[7]。本研究探討了TSLP、IL-18在干眼癥小鼠中的水平變化及相關(guān)機(jī)制，希望為明確干眼癥的發(fā)生機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動物：64只健康雄性BALB/c小鼠(體重18～22 g，6～8周齡，眼前節(jié)、眼底無異常)，購于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司，為無特定病原體級實(shí)驗(yàn)動物(SPF級動物)，交替的12 h明暗周期，濕度(60±10)%，室溫(25±1)℃飼養(yǎng)。主要儀器及試劑：小鼠IL-1β、IL-18、TSLP 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，裂隙燈顯微鏡(上海美沃精密儀器有限公司)，可見光分光光度計(jì)(上海光學(xué)儀器一廠)，苯扎氯銨粉末(美國Sigma公司)，熒光素鈉溶液(上海生工公司)。

1.2 干眼癥小鼠模型的建立 所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為對照組與模型組各32只。模型組小鼠雙眼均滴入5 μl 0.2%苯扎氯銨溶液(0.2 g苯扎氯銨粉末溶于99.8 ml雙蒸水)，每天2次，連續(xù)15 d，誘導(dǎo)小鼠干眼模型[8]，在第7、10、15天記錄淚液分泌量，評估干眼情況，取最接近均數(shù)的小鼠納入以下實(shí)驗(yàn)。對照組給予等劑量(5 μl)的磷酸鹽緩沖液滴雙眼，每天2次，連續(xù)15 d。

1.3 觀察指標(biāo) ①淚液分泌實(shí)驗(yàn)(SIT)：取酚紅棉線，置于小鼠右眼外眥中外1/3 左右處，計(jì)時(shí)1 min，測定酚紅棉線紅色部分的長度，換算為淚液分泌量。②角膜熒光素染色(FL)評分：用1 μl 10 g/L 熒光素鈉滴眼液滴入小鼠結(jié)膜囊中，在裂隙燈下觀察各組角膜上皮缺損狀況，0分：無染色；1分：輕度染色<5個(gè)點(diǎn)；2分：中度染色≥5個(gè)點(diǎn)；3分：重度染色≥5個(gè)點(diǎn)。角膜分為上區(qū)、下區(qū)、中央?yún)^(qū)、鼻側(cè)區(qū)、顳側(cè)區(qū)等5個(gè)區(qū)得分相加即為染色評分。③淚膜破裂時(shí)間(BUT)檢測：用1 μl 10 g/L 熒光素鈉滴眼液滴入小鼠結(jié)膜囊中，在裂隙燈鈷藍(lán)光下觀察記錄角膜染色區(qū)出現(xiàn)第1個(gè)破裂點(diǎn)的時(shí)間。④IL-18、TSLP水平檢測：收集兩組小鼠的淚液，1000～1500 r/min離心10 min，取上層淚液，采用酶聯(lián)免疫法檢測淚液中IL-18、TSLP水平，檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。⑤所有小鼠經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行處死，行HE染色及透射電子顯微鏡觀察并拍照記錄。

2 結(jié) 果

2.1 兩組SIT與BUT值變化對比 兩組實(shí)驗(yàn)第1天的SIT與BUT值對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，模型組實(shí)驗(yàn)第15天的SIT與BUT值低于對照組，也低于實(shí)驗(yàn)第1天，對比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)SIT與BUT值變化對比

2.2 兩組FL評分對比 兩組實(shí)驗(yàn)第1天的FL評分對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，模型組實(shí)驗(yàn)第15天的FL評分高于對照組，也高于實(shí)驗(yàn)第1天，對比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表2。

表2 兩組不同時(shí)間點(diǎn)FL評分對比(分)

2.3 兩組淚液IL-18、TSLP水平對比 兩組實(shí)驗(yàn)第1天淚液IL-18、TSLP水平對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，模型組實(shí)驗(yàn)第15天淚液IL-18、TSLP水平顯著高于對照組和實(shí)驗(yàn)第1天(均P<0.05)，見表3。

表3 兩組不同時(shí)間點(diǎn)淚液IL-18、TSLP水平對比(ng/L)

2.4 兩組病理特征對比 HE染色特征：對照組：角膜為整齊緊密排列的5層左右上皮細(xì)胞，基底細(xì)胞為單層柱狀上皮細(xì)胞層；模型組：角膜上皮細(xì)胞層數(shù)為9層左右，角膜表面欠光滑，伴有表層上皮細(xì)胞損傷、脫落。電鏡特征：對照組：角膜上皮細(xì)胞會向外伸出許多微絨毛和微皺襞，可見豐富的微絨毛，呈指狀突起；模型組：角膜上皮微絨毛可見明顯缺失、脫落、減少，排列紊亂。

2.5 相關(guān)性分析 在模型組中，直線相關(guān)分析顯示實(shí)驗(yàn)第15天的淚液TSLP與IL-18、FL評分、SIT、BUT都存在相關(guān)性(均P<0.05)，見表4。

表4 干眼癥小鼠淚液TSLP水平與其他指標(biāo)的相關(guān)性

3 討 論

干眼癥是眼表疾病中常見的疾病之一，也被稱為角結(jié)膜干燥癥。該病在臨床上主要表現(xiàn)為畏光、眼部充血、視物模糊、眼睛干澀、有異物感等，對患者生活質(zhì)量具有嚴(yán)重不良影響[9]。其主要治療方法人工淚液治療，即：將人工自然滴眼液(含右旋糖酐、氯化鉀、氯化鈉等成分)滴于眼部表面進(jìn)行治療[10]。干眼癥的具體發(fā)病機(jī)制還不明確，不過可能與內(nèi)分泌失衡、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)機(jī)能障礙等多種因素有關(guān)，當(dāng)淚液分泌或排出系統(tǒng)功能異常時(shí)，淚膜成分平衡因此而受到破壞，導(dǎo)致眼表正常的修復(fù)或防御機(jī)制受到損傷，并使淚膜的穩(wěn)定性下降[11]。苯扎氯銨滴眼可以造成機(jī)體淚膜破裂時(shí)間縮短與淚液分泌量減少，并伴隨有眼表上皮損傷、杯狀細(xì)胞減少、角膜上皮鱗狀化生等眼表結(jié)構(gòu)功能的變化，是當(dāng)前應(yīng)用比較多見的干眼動物模型制作方法[12]。本研究顯示模型組實(shí)驗(yàn)第15天的SIT與BUT值低于對照組，也低于實(shí)驗(yàn)第1天，對比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;模型組實(shí)驗(yàn)第15天的FL評分高于對照組，也高于實(shí)驗(yàn)第1天，對比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明干眼癥小鼠模型建立成功。

淚膜主要是由眼眶周附屬腺體、眼表上皮細(xì)胞分泌而形成的混合液體所組成，其主要功能是保持正常眼表健康，修復(fù)眼表的受損表面。正常眼瞼關(guān)閉、充分的淚液量、規(guī)律瞬目、正常的淚膜組成是保持眼前淚膜穩(wěn)定的主要影響因素[13]。健康人眼表面存在免疫性炎癥細(xì)胞，可以通過多種機(jī)制調(diào)控眼部免疫及炎癥反應(yīng)，并使兩者維持平衡穩(wěn)定狀態(tài)[14]。淚膜出現(xiàn)異常會使得眼表正常修復(fù)功能受損，導(dǎo)致眼表面的正常防御平衡受到破壞，從而引發(fā)眼表和淚腺的炎癥反應(yīng)[15]。TSLP是一種來自于上皮細(xì)胞的細(xì)胞因子，具有IL-18分泌調(diào)控作用，可通過多種信號通路激活樹突狀細(xì)胞，誘導(dǎo)Th2的炎性反應(yīng)。TSLP在Th2細(xì)胞介導(dǎo)的過敏性炎癥反應(yīng)、天然免疫、適應(yīng)性免疫中都具有良好的調(diào)節(jié)作用[16]。本研究顯示兩組實(shí)驗(yàn)第1天的淚液IL-18、TSLP水平對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型組實(shí)驗(yàn)第15天的淚液IL-18、TSLP水平顯著高于對照組及實(shí)驗(yàn)第1天，表明干眼癥小鼠伴隨有淚液IL-18、TSLP的高表達(dá)。從機(jī)制上分析，TSLP處于較高水平時(shí)有助于抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放水平，促進(jìn)淚液IL-18的表達(dá)，降低淚液的分泌水平，從而誘發(fā)干眼癥的發(fā)生[17]。

干眼癥患者眼表面通常出現(xiàn)天然的抗炎因子的分泌量下降、而炎癥因子分泌量上升，即炎癥反應(yīng)平衡受到破壞，此外細(xì)胞凋亡、激素、神經(jīng)調(diào)節(jié)等也是導(dǎo)致干眼癥發(fā)病的重要因素。有研究將培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞暴露于濃度逐漸增高的氯化鈉溶液中，炎癥因子可出現(xiàn)濃度依賴性升高的現(xiàn)象，同時(shí)TSLP mRNA基因呈現(xiàn)高表達(dá)[18]。本研究直線相關(guān)分析顯示干眼癥小鼠實(shí)驗(yàn)第15天的淚液TSLP與IL-18、FL評分、SIT、BUT都存在相關(guān)性。從機(jī)制上分析，TSLP具有IL-18作用，主要是與樹突狀細(xì)胞表面的TSLP 受體結(jié)合，通過多種信號通路激活啟動過敏反應(yīng)，從而參與干眼癥的發(fā)生與發(fā)展[19-20]。本研究也存在一定的不足，沒有進(jìn)行多時(shí)間點(diǎn)的動態(tài)分析，且相關(guān)機(jī)制分析不夠深入，將在后續(xù)研究中深入探討。

總之，TSLP在干眼癥小鼠淚液中呈現(xiàn)高表達(dá)水平，可能抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，促進(jìn)淚液IL-18的表達(dá)，降低淚液分泌，從而誘發(fā)干眼癥的發(fā)生，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。