謝江濤,馮樂(lè)宵,王世鋒,劉振鋒,李云翔

(1.咸陽(yáng)市中心醫(yī)院神經(jīng)外科,陜西 咸陽(yáng)712000;2.乾縣人民醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 乾縣713300)

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，膠質(zhì)瘤瘤體的快速生長(zhǎng)和增殖需要消耗大量氧氣，因此瘤體處于一種相對(duì)低氧的狀態(tài)，在這種低氧條件下低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表達(dá)增高，從目前的研究得知HIF-1α應(yīng)對(duì)低氧微環(huán)境時(shí)，能調(diào)節(jié)多種涉及低氧應(yīng)激下細(xì)胞適應(yīng)和存活的靶基因，增加其轉(zhuǎn)錄活性并表達(dá)相應(yīng)的產(chǎn)物以適應(yīng)低氧應(yīng)激反應(yīng)[1]。HIF-1α的表達(dá)受到了諸多因素的影響，因此對(duì)HIF-1α的調(diào)控成為膠質(zhì)瘤適應(yīng)低氧微環(huán)境的核心點(diǎn)?；钚匝?Reactive oxygen species,ROS)就有可能是影響HIF-1α表達(dá)的因素之一，但相關(guān)機(jī)制仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬于常氧(常規(guī)培養(yǎng)箱)及低氧(氯化鈷化學(xué)低氧法)條件下培養(yǎng)SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞并應(yīng)用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)研究ROS對(duì)HIF-1α表達(dá)水平的調(diào)節(jié)，為進(jìn)一步研究低氧條件下膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為及治療靶點(diǎn)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 膠質(zhì)瘤SHG-44瘤株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，NAC、氯化鈷(CoCl2)均購(gòu)于Sigma公司，ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天公司，HIF-1α引物設(shè)計(jì)由Primer 5.0軟件完成，引物合成由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成，RNA提取試劑盒、RT-PCR檢測(cè)全套試劑盒購(gòu)于Fermentas公司。5% CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)THERMO371)，流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)BD FACSCalibur，型號(hào)DICKIN SON)，多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)Bio-Rad iQTM5)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞系培養(yǎng)與傳代：SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞采用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后傳代(1∶2)。

1.2.2 CoCl2化學(xué)法模擬低氧：5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)SHG-44瘤株的基礎(chǔ)上在DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中加入CoCl2溶液(終濃度150 μmol/L共培養(yǎng)24 h)，阻斷細(xì)胞中氧信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，模擬低氧信號(hào)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組：常氧對(duì)照組，常氧條件下培養(yǎng)SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞；常氧NAC干預(yù)組，常氧條件下培養(yǎng)SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞+NAC；低氧對(duì)照組，CoCl2化學(xué)法模擬低氧條件培養(yǎng)SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞；低氧NAC干預(yù)組，CoCl2低氧法培養(yǎng)SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞+NAC。

1.2.4 MTT法檢測(cè)CoCl2化學(xué)法模擬低氧環(huán)境后細(xì)胞增殖情況：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SHG-44 膠質(zhì)瘤細(xì)胞，制成4×104細(xì)胞/ml細(xì)胞懸液,接種于96孔板,每孔100 μl(設(shè)5個(gè)復(fù)孔),每孔添加100 μl CoCl2溶液，并使各孔終濃度為150 μmol/L。培養(yǎng)24 h后檢測(cè)OD值。

1.2.5 按預(yù)設(shè)實(shí)驗(yàn)分組加入CoCl2和(或)NAC：四組每組一塊6孔板，一塊Double well雙孔玻片。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞，制成4×104細(xì)胞/ml細(xì)胞懸液,接種于6孔板,每孔3 ml,低氧對(duì)照組及低氧NAC干預(yù)組次日每孔補(bǔ)加1 ml含CoCl2DMEM培養(yǎng)液(600 μmol/L)，使CoCl2終濃度為150 μmol/L;常氧對(duì)照組及常氧NAC干預(yù)組次日每孔補(bǔ)加1 ml DMEM培養(yǎng)液。同時(shí)稀釋細(xì)胞懸液為2×104細(xì)胞/ml,接種于Double well雙孔玻片,每孔200 μl，低氧對(duì)照組及低氧NAC干預(yù)組次日小心吸棄上清，并補(bǔ)加200 μl含氯化鈷DMEM培養(yǎng)液(150 μmol/L)，常氧對(duì)照組及常氧NAC干預(yù)組次日小心吸棄上清，并補(bǔ)加DMEM培養(yǎng)液200 μl，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后常氧NAC干預(yù)組和低氧NAC干預(yù)組各孔加入活性氧的抑制劑NAC(終濃度為10 mmol/L)，各組繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.6 各組細(xì)胞ROS表達(dá)檢測(cè)：配制熒光探針DCFH-DA，取DCFH-DA(10 mmol/L)5 μl加入5 ml無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中(1∶1000)，四組六孔板到達(dá)培養(yǎng)時(shí)間后，每孔加入500 μl熒光探針DCFH-DA(1∶1000),混勻后繼續(xù)放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，以使DCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化為有熒光的DCF。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCF的熒光(488 nm激發(fā)波長(zhǎng),525 nm發(fā)射波長(zhǎng))以檢測(cè)胞內(nèi)ROS的水平。

1.2.7 各組細(xì)胞HIF-1α mRNA表達(dá)檢測(cè)：四組六孔板到達(dá)培養(yǎng)時(shí)間后轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管中(冰浴中完成)，RNA提取試劑盒(RNAfast 200)快速抽提RNA。取抽提的總RNA 5 μl，mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(cDNA)1 μl作為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，其中引物設(shè)計(jì),見(jiàn)表1。RT-PCR 反應(yīng)條件為：50 ℃、2 min 1個(gè)循環(huán)，95 ℃、10 min 1個(gè)循環(huán)，變性 95 ℃、15 s，退火 60 ℃、30 s，延伸 72 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。設(shè)定反應(yīng)條件后置于多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad iQTM5)中進(jìn)行反應(yīng)，到時(shí)間中止反應(yīng)后分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算目的基因的相對(duì)變化量。目的基因的相對(duì)變化量2-△△CT=2-(實(shí)驗(yàn)組目的基因-實(shí)驗(yàn)組參照基因)/(對(duì)照組目的基因—對(duì)照組參照基因)。

表1 HIF-1α及β-actin引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)之間應(yīng)用方差分析進(jìn)行比較(數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)符合方差齊性)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測(cè)CoCl2化學(xué)法模擬低氧環(huán)境后細(xì)胞增殖情況 常氧組隨著NAC濃度梯度增大，NAC在0～5 mmol/L濃度，細(xì)胞的吸光度(OD值)升高(均P<0.05)，而濃度增大至10、15 mmol/L時(shí)細(xì)胞的吸光度(OD值)下降(均P<0.05)；然而0 mmol/L組與10 mmol/L組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。低氧組隨著NAC濃度梯度增大，NAC在0～5 mmol/L濃度，細(xì)胞的吸光度(OD值)無(wú)明顯變化(均P>0.05)，而濃度增大至10 mmol/L及15 mmol/L細(xì)胞的吸光度(OD值)明顯下降(均P<0.05)。提示低氧條件下NAC在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有太大影響，但在較大濃度時(shí)(>10 mmol/L)則對(duì)細(xì)胞活力影響較大。見(jiàn)表2。

表2 常氧及低氧組不同濃度NAC作用后細(xì)胞增殖OD值

2.2 各組細(xì)胞ROS表達(dá)情況比較 常氧對(duì)照組ROS表達(dá)低于低氧對(duì)照組(P<0.05)，常氧NAC干預(yù)組ROS表達(dá)低于常氧對(duì)照組(P<0.05)，低氧NAC干預(yù)組ROS表達(dá)低于低氧對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)果提示低氧條件下培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞ROS表達(dá)水平明顯高于常氧條件培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，而且應(yīng)用ROS的干預(yù)劑NAC后可明顯降低常氧及低氧培養(yǎng)條件下的ROS表達(dá)。見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞ROS表達(dá)情況比較

2.3 各組細(xì)胞HIF-1α mRNA表達(dá)情況比較 低氧組HIF-1α mRNA表達(dá)高于常氧組(均P<0.05)，低氧組HIF-1α mRNA表達(dá)高于常氧NAC干預(yù)組及低氧NAC干預(yù)組(均P<0.05)。常氧組HIF-1α mRNA表達(dá)與常氧NAC干預(yù)組及低氧NAC干預(yù)組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)，低氧NAC干預(yù)組HIF-1α mRNA表達(dá)與常氧NAC干預(yù)組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

HIF-1α是Wang 和Semenza于1992年從缺氧的Hep-3細(xì)胞核中首次提取分離出缺氧誘生的并具有DNA結(jié)合活性的一種轉(zhuǎn)錄因子，腫瘤的惡性增殖使其組織內(nèi)耗氧及血管形成不全，導(dǎo)致微環(huán)境含氧量不足，使腫瘤各區(qū)域處于不同的低氧微環(huán)境中[2]。HIF-1α應(yīng)對(duì)低氧微環(huán)境時(shí)，能調(diào)節(jié)多種涉及低氧應(yīng)激下細(xì)胞適應(yīng)和存活的靶基因，增加其轉(zhuǎn)錄活性并表達(dá)相應(yīng)的產(chǎn)物以適應(yīng)低氧應(yīng)激反應(yīng)[3-4]。

從目前的研究得知HIF-1β持續(xù)性穩(wěn)定表達(dá)于胞質(zhì)中，不受缺氧及其他因素的調(diào)節(jié)和干擾，對(duì)HIF-1α的調(diào)控分為HIF-1α降解水平的調(diào)節(jié)和影響HIF-1α轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)[5-6]。HIF-1α降解水平的調(diào)節(jié)目前研究的相對(duì)較多，尤其是pHDs-pVHL——泛素化蛋白水解酶降解途徑研究的比較透徹了[7]，此外還有一些其他降解途經(jīng)，例如OS-9[8-9]促進(jìn)脯氨酸羥化酶誘發(fā)的依賴pVHL的泛素化蛋白水解酶降解途徑。而關(guān)于影響HIF-1α轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)目前相關(guān)報(bào)道較少，Steffen等[10]發(fā)現(xiàn)GSK3β通過(guò)抑制HIF-1α的轉(zhuǎn)錄起始因子eIF2B，使HIF-1α的mRNA表達(dá)水平降低，GSK3β的抑制劑靛玉紅可明顯提高HIF-1α mRNA表達(dá)水平。

本研究中低氧條件下培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞ROS表達(dá)水平明顯高于常氧條件培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，而且應(yīng)用ROS的干預(yù)劑NAC后可明顯降低常氧及低氧培養(yǎng)條件下的ROS表達(dá)。而Alex等[11]也認(rèn)為腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS升高可能是一種參與調(diào)控HIF-1α的重要因素。ROS可能作為一種特殊的第二信使參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及影響基因的轉(zhuǎn)錄活性，啟動(dòng)多種細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)[12-13]。ROS是線粒體的電子轉(zhuǎn)運(yùn)鏈在運(yùn)氧過(guò)程中電子遺漏，基態(tài)氧通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)鏈時(shí)接受漏出的電子變?yōu)镽OS，腫瘤組織因生長(zhǎng)失控，其內(nèi)部處于一種相對(duì)低氧的狀態(tài)，因此線粒體有氧呼吸電子轉(zhuǎn)運(yùn)鏈有可能因受阻而產(chǎn)生ROS[14-15]。因此可以得出SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞于低氧條件下培養(yǎng)時(shí)ROS表達(dá)水平明顯高于常氧條件培養(yǎng)，然而給予抗氧化劑NAC之后兩組ROS表達(dá)水平均明顯下降。

本次試驗(yàn)中低氧條件下HIF-1α mRNA表達(dá)水平高于常氧條件下，但是應(yīng)用抗氧化劑NAC后HIF-1α mRNA表達(dá)下降。而Koshikawa等[16]的研究也指出ROS可能通過(guò)激活PI3K-PKB/Akt通路進(jìn)而影響HIF-1α的表達(dá)。PI3K-PKB/Akt通路并非直接調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)和穩(wěn)定性，它有很多的下游調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，可以間接調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)。mTOR可通過(guò)改變翻譯調(diào)節(jié)因子真核細(xì)胞啟動(dòng)因子4E結(jié)合蛋白 (4E-BP1)和核糖體p70S6激酶1(p70S6K1)的磷酸化狀態(tài)啟動(dòng)HIF-1α翻譯過(guò)程，而HIF-1α的一種下游靶基因產(chǎn)物REDD1卻可以抑制mTOR的活性，從而下調(diào)HIF-1α的表達(dá)水平，這也是HIF-1α自身的一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制[17]。Brooke等[18]認(rèn)為低氧條件下p38MAPK的激活有賴于線粒體產(chǎn)生的ROS，ROS可以使MAPK的上游激酶(MAPKKK)的絲氨酸和蘇氨酸位點(diǎn)的磷酸化進(jìn)而激活p38MAPK信號(hào)通路[19-20]。因此也可以推斷出這樣一個(gè)結(jié)論，即抗氧化劑NAC可使膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HIF-1α mRNA表達(dá)下降，進(jìn)而可使HIF-1α生成減少，使得膠質(zhì)瘤細(xì)胞適應(yīng)低氧應(yīng)激反應(yīng)的能力下降，可以起到抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

本研究明確了膠質(zhì)瘤細(xì)胞在低氧條件下ROS表達(dá)水平及HIF-1α mRNA表達(dá)水平明顯高于常氧條件，但是應(yīng)用ROS干預(yù)劑NAC之后低氧條件下SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HIF-1α mRNA表達(dá)下降，提示ROS在促進(jìn)HIF-1α mRNA表達(dá)中起某種重要作用，而抗氧化劑NAC可阻斷這種作用，因此也提示在腦膠質(zhì)瘤的其他輔助治療中抗氧化劑也可以起到抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，這為進(jìn)一步研究抗氧化劑在膠質(zhì)瘤輔助治療中的應(yīng)用提供了新的思路。