程 繼,王志剛,付 國(guó),董青川

(陜西省人民醫(yī)院泌尿外科,陜西 西安 710068)

前列腺癌(Prostate cancer)是常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率均呈逐年上升趨勢(shì)，手術(shù)切除、放療和化療是目前常用的臨床治療手段[1-2]。但常規(guī)化療藥物和放射治療引起的不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響了患者術(shù)后的康復(fù)和生活質(zhì)量[3-5]。姜黃素(Curcumin)是從姜黃、郁金等姜科植物中提取的一種多酚類物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多種藥理作用[6]。研究[7-8]發(fā)現(xiàn),姜黃素的水溶性差、難吸收、易降解,導(dǎo)致其生物利用度低,限制了臨床的進(jìn)一步應(yīng)用。因此，制備姜黃素的脂質(zhì)體、膠束等納米微粒,有望提高姜黃素的生物利用度，對(duì)于臨床姜黃素的廣泛應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。普朗尼克(Pluronic)是由聚氧乙烯(PEO)、聚氧丙烯(PPO)聚合而成的兩親性三嵌段共聚物，可自組裝形成膠束,具有良好的生物相容性[9-11]。本實(shí)驗(yàn)以姜黃素為研究對(duì)象,選擇Pluronic-P123為載體材料,包裹姜黃素制備膠束,評(píng)價(jià)姜黃素@普朗尼克膠束的理化性質(zhì)及對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞的體內(nèi)外抗腫瘤活性,通過(guò)構(gòu)建高效的遞藥系統(tǒng),改善姜黃素生物利用度,為臨床前列腺癌的化療提供新的策略和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自中國(guó)上海力申公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；激光粒度儀購(gòu)自英國(guó)Malvern公司；透射電鏡購(gòu)自日本Olympus公司。人前列腺癌PC-3細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；Pluronic-P123購(gòu)自德國(guó)BASF公司；裸鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；姜黃素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 姜黃素@普朗尼克膠束的制備 通過(guò)溶劑揮發(fā)法制備姜黃素載藥膠束：姜黃素150 mg，溶于三氯甲烷，再加入三乙胺(姜黃素∶三乙胺=1∶3,摩爾比)，磁力攪拌器避光攪拌4 h；再加入5 g Pluronic-P123和100 ml蒸餾水,超聲分散均勻，室溫下避光繼續(xù)攪拌2 h,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中去除有機(jī)溶劑，真空干燥過(guò)夜，得到的膠束溶液通過(guò)0.8 μm濾膜過(guò)濾，冷凍干燥即得姜黃素@普朗尼克載藥膠束。通過(guò)激光粒度儀測(cè)定姜黃素@普朗尼克載藥膠束的粒徑分布，透射電鏡觀察載藥膠束形態(tài)。

1.3 姜黃素@普朗尼克膠束的載藥量和包封率 稱取50 mg姜黃素@普朗尼克載藥膠束凍干粉末,溶于無(wú)水乙醇，水浴超聲10 min，通過(guò)高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)姜黃素含量，按下式計(jì)算載藥量和包封率。HPLC檢測(cè)條件為：色譜柱(C18,250 mm×4.6 mm,5 μm,Diamonsil),流動(dòng)相組成為0.01 mol/L甲醇∶醋酸鈉∶冰醋酸(70∶29∶1),流速1 ml/min，進(jìn)樣量20 μl，柱溫25 ℃。載藥量=(姜黃素在載藥膠束中的量/載藥膠束量)×100%。包封率=(姜黃素在載藥膠束中的量/姜黃素投藥量)×100%。

1.4 姜黃素@普朗尼克膠束體外釋藥性研究 姜黃素@普朗尼克膠束(2 mg/ml,姜黃素濃度)溶于磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中,置于透析袋中,將透析袋置于200 mlPBS中，37 °C孵育72 h，選擇不同的時(shí)間點(diǎn),于 0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72 h分別取樣20 μl,每次取樣后立即補(bǔ)充等體積PBS,HPLC檢測(cè)姜黃素@普朗尼克膠束體外釋藥性能，檢測(cè)方法同1.3。

1.5 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 常規(guī)培養(yǎng)人前列腺癌PC-3細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，密度為5×103/孔,分別給予0.5、1、5、10、50、100 μmol/L(姜黃素濃度)的姜黃素、姜黃素@普朗尼克膠束及P123空白膠束處理。48 h后收集細(xì)胞，加入5 mg/ml的MTT 20 μl,37 °C孵箱放置4 h，棄去上清液,PBS沖洗3次,每孔加入150 μl 二甲基亞砜(DMSO)，振蕩溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(570 nm),觀察細(xì)胞存活情況,計(jì)算IC50,評(píng)價(jià)姜黃素@普朗尼克膠束對(duì)PC-3細(xì)胞增殖的影響。

1.6 PC-3細(xì)胞對(duì)載藥膠束的攝取 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前列腺癌PC-3細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞接種密度為 1×105個(gè)/孔，培養(yǎng)過(guò)夜后加入10 μmol/L(姜黃素濃度)的姜黃素和載藥膠束，分別孵育0.5、2、8 h后吸去培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，胰酶消化細(xì)胞，離心提取后，通過(guò)高效液相色譜(HPLC)法分析細(xì)胞對(duì)藥物的攝取。

1.7 載藥膠束的體內(nèi)抗腫瘤活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前列腺癌PC-3細(xì)胞懸液(1×107)，裸鼠皮下注射腫瘤細(xì)胞，建立PC-3荷瘤模型，觀察接種部位變化，至腫瘤體積生長(zhǎng)至100 mm×100 mm×100 mm后，隨機(jī)分為模型組、姜黃素組、姜黃素@普朗尼克膠束組，分別靜脈注射生理鹽水、姜黃素和姜黃素@普朗尼克膠束(5 mg/kg)，每4 d給藥1次，給藥5次。每?jī)商煊涗浡闶篌w重并用游標(biāo)卡尺測(cè)量記錄腫瘤體積和裸鼠體重。治療結(jié)束后，處死動(dòng)物，剝離腫瘤組織，稱重并計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率。腫瘤體積計(jì)算公式為：V=L(長(zhǎng))×W(寬)2/2。腫瘤生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-給藥組腫瘤重量/生理鹽水組腫瘤重量)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 膠束的表征 溶劑揮發(fā)法制備得到的膠束為膠體微粒分散系統(tǒng)，該姜黃素@普朗尼克膠束的平均粒徑為322 nm，呈圓球狀(圖1、2)。通過(guò)HPLC檢測(cè)姜黃素含量，計(jì)算姜黃素@普朗尼克膠束的載藥量為(15.7±0.3)%和包封率為(89.4±1.2)%。

圖1 姜黃素@普朗尼克膠束電鏡圖(×20 000)

2.2 膠束的體外釋藥性能 通過(guò)HPLC法檢測(cè)姜黃素@普朗尼克膠束在磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中的釋藥性能，結(jié)果顯示構(gòu)建的姜黃素@普朗尼克膠束具有一定的緩釋效應(yīng)，24 h后約50%游離藥物釋放，而72 h后，體外釋藥率可達(dá)80%，提示載藥膠束具有長(zhǎng)循環(huán)特性，見(jiàn)圖3。

圖2 姜黃素@普朗尼克膠束粒徑分布

圖3 姜黃素@普朗尼克膠束體外釋藥曲線

2.3 膠束的細(xì)胞毒性 MTT法檢測(cè)膠束對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞的抑制作用，結(jié)果顯示姜黃素和姜黃素@普朗尼克膠束均可抑制PC-3細(xì)胞增殖，呈劑量依賴性。與游離姜黃素相比，姜黃素@普朗尼克膠束細(xì)胞增殖抑制作用顯著增加，提示構(gòu)建的膠束具有一定的抗腫瘤效應(yīng)，可以在體外顯著抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖，見(jiàn)表1。分別計(jì)算姜黃素和姜黃素@普朗尼克膠束的IC50值，見(jiàn)表2，結(jié)果顯示姜黃素@普朗尼克膠束的IC50值顯著低于姜黃素組，證實(shí)姜黃素@普朗尼克膠束的細(xì)胞毒性強(qiáng)于姜黃素，說(shuō)明姜黃素@普朗尼克膠束可顯著提高游離姜黃素的體外抗腫瘤活性，其作用機(jī)制可能與增加姜黃素在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的聚集有關(guān)。而空白膠束的IC50值很大，表明空白膠束幾乎無(wú)細(xì)胞毒性，生物相容性好，提示選擇的載藥膠束材料，安全性好。

表1 姜黃素@普朗尼克膠束對(duì)PC-3細(xì)胞存活率的影響(%)

表2 姜黃素@普朗尼克膠束的細(xì)胞毒性(μmol/L)

2.4 PC-3細(xì)胞對(duì)膠束的攝取作用 HPLC法檢測(cè)PC-3細(xì)胞對(duì)姜黃素@普朗尼克膠束的攝取，結(jié)果見(jiàn)表3。藥物與細(xì)胞孵育0.5 h后，姜黃素膠束和游離藥物均可被腫瘤細(xì)胞攝取并進(jìn)入細(xì)胞，但膠束組和游離姜黃素組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。但隨著時(shí)間增加，膠束處理組細(xì)胞攝取率明顯增加，孵育2、8 h后其細(xì)胞攝取率分別是游離姜黃素組的1.7和2.4 倍，呈現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。上述結(jié)果提示，腫瘤細(xì)胞對(duì)膠束的攝取表現(xiàn)出時(shí)間依賴性增強(qiáng)，呈現(xiàn)出緩釋趨勢(shì)，孵育2 h后，膠束的細(xì)胞攝取率明顯高于姜黃素組，證實(shí)膠束可有效增加藥物的胞內(nèi)濃度，提高治療效果。

表3 姜黃素@普朗尼克膠束在PC-3細(xì)胞中的攝取率(%)

2.5 膠束的體內(nèi)抗腫瘤作用 通過(guò)腫瘤體積、腫瘤生長(zhǎng)抑制率分析膠束的體內(nèi)抗腫瘤效果，結(jié)果見(jiàn)圖4。生理鹽水處理組腫瘤生長(zhǎng)迅速，治療結(jié)束時(shí)腫瘤體積可達(dá)6257 mm3，而游離姜黃素和膠束處理組腫瘤生長(zhǎng)顯著抑制(P<0.01)，治療結(jié)束時(shí)腫瘤體積分別為4855 mm3和3218 mm3，且姜黃素膠束顯著增加了姜黃素的腫瘤抑制作用(P<0.05)。姜黃素對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制率為(32.1±2.3)%，而姜黃素@普朗尼克膠束可以顯著增加對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制率為(60.4±0.2)%。腫瘤生長(zhǎng)抑制率結(jié)果顯示姜黃素及其膠束均可抑制腫瘤生長(zhǎng)，與游離姜黃素相比，姜黃素@普朗尼克膠束的腫瘤抑制率顯著提高(P<0.01)。

圖4 三組荷瘤裸鼠腫瘤體積變化

3 討 論

姜黃素作為一種傳統(tǒng)的植物藥，已在中國(guó)和印度有超過(guò)2000年的應(yīng)用歷史。2016年，美國(guó)營(yíng)養(yǎng)保健品市場(chǎng)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，含有姜黃素的營(yíng)養(yǎng)保健品增長(zhǎng)率超過(guò)21%。在加拿大，因姜黃素的抗氧化效應(yīng)和抗炎效應(yīng)，已被認(rèn)定為天然的健康保健品[12-13]。姜黃素是一種天然多酚類物質(zhì)，安全性好，具有抗炎、抗氧化等多種藥理作用，是一種極具潛力的抗腫瘤活性物質(zhì)。但姜黃素水溶性差、半衰期短、導(dǎo)致其生物利用度低，極大限制了其的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用。如何針對(duì)姜黃素，有效延長(zhǎng)半衰期，提高生物利用度，是其研究的熱點(diǎn)。

兩親性的高分子材料或嵌段共聚物可自組裝形成聚合物膠束，呈核-殼狀結(jié)構(gòu)。聚合物膠束具有高度的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，在體內(nèi)可保護(hù)膠束不被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識(shí)別和攝??；其內(nèi)核具有一定的載藥容量，可包裹難溶性的小分子化療藥物，發(fā)揮增溶作用[14-15]。聚合物膠束可有效增加難溶性藥物溶解度，增加循環(huán)時(shí)間，提高生物利用度并呈現(xiàn)一定的緩釋效果；同時(shí)，依據(jù)腫瘤高滲透長(zhǎng)滯留效應(yīng)，還可實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向作用，使聚合物膠束聚集于腫瘤組織，更好發(fā)揮治療作用[16-17]。因此，設(shè)計(jì)制備姜黃素聚合物膠束可實(shí)現(xiàn)靶向、高效、長(zhǎng)循環(huán)等作用，有效提升姜黃素生物利用度。Pluronic-P123為兩親性嵌段共聚物，可包裹藥物自組裝形成聚合物膠束，增加難溶性藥物溶解度，延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物有效濃度，實(shí)現(xiàn)其在靶部位的高效聚集。且Pluronic-P123為P糖蛋白底物，能抑制P糖蛋白參與的藥物外排，與逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥(MDR)作用機(jī)制相關(guān)，呈現(xiàn)出一定的逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用[11，18]。

我們以Pluronic-P123為載體材料，采用溶劑揮發(fā)法成功制備了姜黃素聚合物膠束，結(jié)果顯示膠束大小均一，平均粒徑為322 nm，具有良好的生物相容性。體外釋藥顯示，姜黃素膠束呈現(xiàn)出一定的緩釋效果，可持續(xù)釋放姜黃素發(fā)揮藥效作用。MTT結(jié)果顯示空白膠束幾乎無(wú)細(xì)胞毒性，證實(shí)膠束生物相容性好，為安全的納米載體；而載藥膠束呈現(xiàn)出良好的體外抗腫瘤活性，與游離姜黃素相比，細(xì)胞毒性明顯增加。細(xì)胞攝取結(jié)果顯示，載藥膠束與游離藥物相比，姜黃素膠束可被PC-3細(xì)胞高效攝取，入胞效率明顯增加，說(shuō)明聚合物膠束可有效增加藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)蓄積，從而發(fā)揮更強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用，提示姜黃素的高效濃集是載藥膠束抗腫瘤活性增加的原因之一。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)姜黃素膠束可有效抑制腫瘤增長(zhǎng)，腫瘤生長(zhǎng)抑制率顯著優(yōu)于游離姜黃素，具有良好的抗腫瘤作用。

此外，前期研究還顯示，姜黃素能夠影響血管生成，調(diào)控腫瘤血管生成的過(guò)程。姜黃素還可調(diào)控p53、NF-κB、MAPK、Nrf2等信號(hào)通路，影響前列腺癌等惡性腫瘤的病理進(jìn)程，并能阻止NF-κB亞單位p65的核轉(zhuǎn)錄作用，減少IL-6和IL-11等細(xì)胞因子的分泌，抑制NF-κB活性，從而影響腫瘤細(xì)胞的凋亡、增殖等過(guò)程[19-20]。因此，我們將在后續(xù)的研究中，繼續(xù)探討姜黃素聚合物膠束誘導(dǎo)凋亡、調(diào)控血管生成等作用的相關(guān)機(jī)制和通路。本研究成功構(gòu)建了一種粒徑小、大小均一、生物相容性高的姜黃素聚合物膠束，與游離姜黃素相比，膠束可明顯提高細(xì)胞攝取率，呈現(xiàn)良好的體內(nèi)外抗腫瘤活性，并具有一定的緩釋效果，可能為臨床前列腺癌的治療提供新的策略和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。