張 成 ，呂雪芹 ，金 柯 ，李江華 ，堵國成 ，劉 龍 *

（1.江南大學(xué) 未來食品科技中心，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

微生物在自然進化過程中，主要通過形成多酶復(fù)合體來生成底物通道，防止有毒中間代謝物擴散至細(xì)胞質(zhì)，以此來提高代謝途徑連續(xù)多步反應(yīng)的催化效率[1]。因此，如何模擬多酶復(fù)合體，將產(chǎn)物合成途徑中的關(guān)鍵酶類進行空間組裝，目前已成為代謝工程領(lǐng)域的一個研究熱點。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)，將途徑酶通過人工構(gòu)建的蛋白質(zhì)支架、DNA支架、RNA支架、微室結(jié)構(gòu)等空間支架進行組裝，可以減少反應(yīng)中間物傳遞壁壘，從而顯著提高反應(yīng)效率[2-7]。為了減少上述外源支架對細(xì)胞造成的代謝負(fù)擔(dān)，課題組前期開展了一系列內(nèi)源性空間支架的研究工作，最終發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌中功能膜微域（FMMs）具有較高的空間和時間穩(wěn)定性，可作為內(nèi)源平臺在基因組水平組裝的多種途徑酶，最終顯著提高產(chǎn)物的合成量[8]。進一步分析顯示，當(dāng)使用質(zhì)粒對途徑酶進行過表達時，由于菌株自身FMMs數(shù)量有限，無法提供足夠的空間滿足途徑酶的組裝，最終導(dǎo)致代謝效率無法進一步提高[9]。針對上述問題，研究者通過對FMMs進行理性改造，提高了質(zhì)膜上FMMs的占比。以GlcNAc合成為例，發(fā)現(xiàn)FMMs的理性改造促使GlcNAc的產(chǎn)量提高了292%[9]。然而，當(dāng)進一步改造FMMs時，菌株形態(tài)發(fā)生彎曲并且菌株生長受到抑制，且GlcNAc產(chǎn)量下降。推測造成該現(xiàn)象的主要原因是質(zhì)膜上FMMs區(qū)和非FMMs區(qū)需要維持一定的平衡，當(dāng)這種平衡被打破時，細(xì)胞的生長等過程即會受到抑制。

細(xì)胞質(zhì)膜主要由磷脂構(gòu)成，磷脂酸（PtdOH）是磷脂合成的前體，同時也是細(xì)胞質(zhì)膜的重要結(jié)構(gòu)成分[10]，因此調(diào)節(jié)PtdOH合成是改造細(xì)胞質(zhì)膜的有效策略[11]。PtdOH在枯草芽孢桿菌中的合成途徑如下：首先，PlsX催化酰基-ACP生成?；?磷酸，之后由PlsY將?；D(zhuǎn)移到甘油-磷酸的1位形成1-?；视?磷酸，最后PlsC將?；D(zhuǎn)移到1-?；视?磷酸的 2 位形成 PtdOH[10，12-13]。 因此 PlsX、PlsY、PlsY是枯草芽孢桿菌細(xì)胞質(zhì)膜改造的關(guān)鍵靶點。該研究以本課題組前期獲取的菌株BSGN6-Y1為出發(fā)菌株，首先通過過表達PlsX、PlsY和PlsC對細(xì)胞質(zhì)膜進行改造；之后，以枯草芽孢桿菌合成GlcNAc為例，將GNA1和YqaB兩個異源途徑酶通過SPFH結(jié)構(gòu)域組裝到FMMs。發(fā)酵結(jié)果顯示，GlcNAc產(chǎn)量得到顯著提高；同時還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)膜改造能夠降低FMMs自身過度修飾對菌株形態(tài)和生長產(chǎn)生的不利影響。這些結(jié)果表明，改造細(xì)胞質(zhì)膜能夠改善FMMs的途徑酶組裝，最終增加GlcNAc的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 本研究中使用的菌株、質(zhì)粒見表1。BSGY1：本研究的出發(fā)菌株，由BSGN6（野生型菌株B.subtilis 168衍生菌株）改造而成；大腸桿菌Escherichia coli JM109 （E.coli JM109）：用于重組DNA實驗；菌株和質(zhì)粒全部保藏在作者所在實驗室。

表1 本研究所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L，NaCl 10 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨6 g/L，酵母粉12 g/L，（NH4）2SO46g/L，KH2PO42.5g/L，K2HPO4·3H2O 12.5 g/L，葡萄糖60 g/L，微量金屬溶液10 mL/L（CaCl24.0 g/L，MnSO4·5H2O 1.0 g/L，CoCl2·6H2O 0.4 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 4.0 g/L，ZnSO4·7H2O 0.2 g/L，CuCl2·H2O 0.1 g/L，AlCl3·6H2O 0.1 g/L，NaMoO4·2H2O 0.2 g/L，H3BO40.05 g/L）。

培養(yǎng)基中添加抗生素的劑量分別為：氨芐青霉素 100 μg/mL，卡那霉素 50 μg/mL，氯霉素 5 μg/mL，壯觀霉素 100 μg/mL。

TaqDNA 聚合酶、Prime STAR （max）DNA 聚合酶、DNA marker：購自TaKaRa公司；試劑和試劑盒：均購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 表達載體的構(gòu)建和異源基因的融合 使用引物F-yisP和R-yisP，從B.subtilis 168基因組上擴增出yisP基因，同時使用引物對F-PHT01和RPHT01將質(zhì)粒pHT01線性化，最后利用Gibosen將yisP基因和線性化質(zhì)粒無縫組裝。將組裝后質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli JM109，次日使用引物F-yisP和R-yisP進行菌落PCR，將條帶大小約為1 200 bp的克隆子測序確認(rèn)，得到重組質(zhì)粒pHT01-YISP，所用引物見表2。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

異源基因的表達采用強啟動子P43，其通過質(zhì)粒P43NMK擴增而來。通過融合聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）將整合位點兩側(cè)的上下游序列 （800～1 000 bp）、lox71-Spec-lox66盒、P43啟動子和目的基因進行連接，將純化后的融合PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。為了避免多重抗性標(biāo)記的影響，在下一輪基因過表達之前，用Cre/lox系統(tǒng)將抗性標(biāo)記消除，所用引物見表2。

1.2.2 GlcNAc搖瓶發(fā)酵 將新鮮轉(zhuǎn)化的單菌落接種到裝有5 mL LB培養(yǎng)基的50 mL離心管中，于37℃、220 r/min培養(yǎng)10 h；取種子液1 mL接種到裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，于37℃、220 r/min培養(yǎng)48 h。

1.2.3 細(xì)胞密度的檢測 通過測量600 nm處的光吸收值（OD600）來檢測細(xì)胞密度。OD600值按公式1 OD600=0.35 g/L換算為細(xì)胞干質(zhì)量（DCW）。

1.2.4 掃描電鏡樣品的制備 先用體積分?jǐn)?shù)5%戊二醛（0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.2）進行預(yù)固定，再用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液漂洗，最后用體積分?jǐn)?shù)1%鋨酸（0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.2）后固定。樣品用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌3次，分別經(jīng)體積分?jǐn)?shù) 20%、40%、60%、80%、100%、100%、100%、100%梯度乙醇洗脫后，樣品在臨界點（LEICA CPD-300）烘干，離子濺射（LEICA，ACE-600）鍍膜后粘貼在樣品臺面上，置于冷場發(fā)射掃描電鏡（HITACHI SU8220）中測試。

1.2.5 中間代謝產(chǎn)物的測定 將新鮮轉(zhuǎn)化后的單菌落接種到裝有5 mL LB培養(yǎng)基的50 mL離心管中，于 37℃、220 r/min培養(yǎng) 8～10 h，然后將 1 mL種子液接種到裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，在 37 ℃和 220 r/min 下培養(yǎng)，并于 12、24、36、48 h分別取3 mL發(fā)酵液，于4℃離心機冷凍離心，棄上清液。然后加入 1.2 mL 萃取液（V乙腈∶V甲醇∶V水=4∶4∶2），于4℃下萃取過夜。10 000 g離心15 min后，取上清液冷凍干燥。向樣品中加入100 μL超純水，1 000 g離心15 min后取上清液測定細(xì)胞內(nèi)代謝物濃度。采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）檢測代謝產(chǎn)物。

1.2.6 GlcNAc的測定方法 使用高效液相色譜法（HPLC）測定發(fā)酵液中GlcNAc質(zhì)量濃度。HPLC檢測條件如下：檢測器為示差折光檢測器；色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H；流動相為硫酸水溶液（5 mmol/L）；流量 0.6 mL/min，溫度 40 ℃，進樣體積10 μL。樣品處理條件：發(fā)酵液經(jīng)10 000 g離心5 min，取上清液用超純水稀釋到一定倍數(shù)，再用0.22 μm濾膜過濾稀釋液。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)膜改造重組菌的構(gòu)建

目前，質(zhì)膜改造策略主要集中在操縱一個或幾個已知的能夠影響質(zhì)膜組分或合成的基因、調(diào)節(jié)因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等方面[14]，通過這些改造能夠改變質(zhì)膜功能[15-16]、質(zhì)膜的生理特性[17-19]和質(zhì)膜形態(tài)[20-21]，達到提高底物利用率、改善細(xì)胞生長性能和提高代謝效率等目的。PtdOH是細(xì)胞質(zhì)膜的重要組成成分，枯草芽孢桿菌PtdOH合成途徑見圖1（a）。PlsX、PlsY和PlsC是該途徑的關(guān)鍵酶，構(gòu)建plsX、plsY和plsC表達盒，見圖1（b）。先后將上述3個重組片段轉(zhuǎn)化到BSGN6-Y1菌株中，結(jié)合抗生素篩選和抗性標(biāo)記消除，最終獲得質(zhì)膜改造菌株BSGN6-Y1M。

圖1 過表達PtdOH合成基因Fig.1 Overexpression of PtdOH synthetic gene

2.2 質(zhì)膜改造對菌株生長的影響

細(xì)胞質(zhì)膜是將細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外環(huán)境分開的保護性屏障[22]，它能夠維持細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)運輸和能量代謝等[23-25]重要細(xì)胞過程，暗示了細(xì)胞質(zhì)膜的不當(dāng)修飾或改造可能不利于菌株生長，因此我們分析了質(zhì)膜改造對菌株生長的影響。為了探究質(zhì)膜改造對FMMs過度修飾菌株生長的影響，我們構(gòu)建了pHT01-YISP質(zhì)粒，并將其與pP43NMK-SPFH質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)化BSGN6-Y1和BSGN6-Y1M，得到BSGN6-Y1PS和BSGN6-Y1MPS，此外將pHT01和pP43NMK-SPFH質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化BSGN6-YI，得到 BSGN6-Y1TS，見圖 2（a）。 如圖 2（b）所示，在菌株培養(yǎng)的前12 h，與對照菌株BSGN6-Y1TS相比，重組菌株BSGN6-Y1PS、BSGN6-Y1MPS的OD600沒有明顯變化，但是12 h后，BSGN6-Y1PS、BSGN6-Y1MPS 的 OD600明顯低于BSGN6-Y1TS。進一步掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，BSGN6-Y1PS、BSGN6-Y1MPS的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了變化，首先細(xì)胞長度從BSGN6-Y1TS的（2.11±0.21）μm 增加 到 BSGN6-Y1PS 的 （3.29±0.33） μm 和BSGN6-Y1MPS 的 （2.58±0.28） μm，見圖 2（c）。BSGN6-Y1PS菌株出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞彎曲現(xiàn)象，見圖2（d），這一結(jié)果與我們前期發(fā)現(xiàn)的yisP高表達能夠影響細(xì)胞生長或細(xì)胞形態(tài)相同[9]。然而BSGN6-Y1MPS菌株12 h后的OD600明顯高于BSGN6-Y1PS，它的細(xì)胞長度低于BSGN6-Y1PS并且細(xì)胞沒有發(fā)生明顯的彎曲，這表明質(zhì)膜改造能夠有效降低yisP高表達對細(xì)胞生長或細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生的不利影響。

圖2 質(zhì)膜改造對菌株生長的影響Fig.2 Effects of plasma membrane modification on strain growth

2.3 質(zhì)膜改造對中間代謝產(chǎn)物的影響

枯草芽孢桿菌以葡萄糖為碳源合成GlcNAc需要經(jīng)由以下步驟：葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸（G6P），再由磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（Pgi）和氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶 （GlmS）催化合成6-磷酸果糖（F6P） 和氨基葡萄糖-6-磷酸 （GlcN6P）。 然后，GlcN6P被異源的氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（GNA1）轉(zhuǎn)化為 N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸（GlcNAc6P），其中 GNA1 是合成 GlcNAc的關(guān)鍵酶[26]。GlcNAc的最終合成需要去磷酸化，大腸桿菌YqaB可以催化GlcNAc6P的去磷酸化[27]。

途徑酶的空間組裝能夠?qū)崿F(xiàn)途徑酶空間上的靠近，強化途徑酶的協(xié)同催化作用，有利于中間代謝產(chǎn)物的加工進而提高產(chǎn)物的合成效率[5，7，9，28]。 為了探究質(zhì)膜改造對G6P、F6P、GlcN6P和GlcNAc6P的影響，我們將前期構(gòu)建的SPFH-yqaB融合基因整合到菌株BSGN6-Y1M中，獲得BSGN6-Y1MY菌株；然后將pHT01質(zhì)粒和pP43NMK-SPFH-GNA1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化前期構(gòu)建的BSGN6-Y1SY，得到BSGN6-Y1SYTA；最后將pHT01-YISP和pP43NMK-SPFHGNA1質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)化 BSGN6-Y1SY、BSGN6-Y1MY，得到 BSGN6-Y1SYPA、BSGN6-Y1MYPA，見圖3（a）。 圖3（b）—（d）中，BSGN6-Y1MYPA 的中間代謝產(chǎn)物G6P、F6P、GlcN6P和GlcNAc6P的質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯低于對照菌株BSGN6-Y1SYTA。上述結(jié)果表明，質(zhì)膜改造能夠促進多酶復(fù)合體對中間代謝產(chǎn)物的加工和利用，減少中間代謝產(chǎn)物向胞質(zhì)內(nèi)的擴散。

圖3 質(zhì)膜改造對中間代謝產(chǎn)物的影響Fig.3 Effects of plasma membrane modification on intermediate metabolites

2.4 質(zhì)膜改造對GlcNAc產(chǎn)量的影響

上述研究顯示，質(zhì)膜改造有利于中間代謝產(chǎn)物的加工，但對菌株生長和GlcNAc合成能力的影響還不清楚。為了確定質(zhì)膜改造對菌株產(chǎn)GlcNAc性能的影響，將BSGN6-Y1SYTA、BSGN6-Y1SYPA和BSGN6-Y1MYPA進行搖瓶發(fā)酵。如圖4（a）所示，發(fā)酵48 h后，菌株BSGN6-Y1MYPA的GlcNAc產(chǎn)量為 （5.18±0.16）g/L，對照菌株BSGN6-Y1SYTA的GlcNAc 產(chǎn)量為（3.65±0.12） g/L，質(zhì)膜改造后GlcNAc產(chǎn)量提升了41.9%；同時BSGN6-Y1MYPA的OD600低于對照菌株BSGN6-Y1SYTA，但是高于BSGN6-Y1SYPA，見圖4（b）。上述結(jié)果表明，細(xì)胞質(zhì)膜改造能降低yisP高表達對菌株生長產(chǎn)生的不利影響，并促進GlcNAc合成的代謝通量。

圖4 質(zhì)膜改造對菌株生長和菌株產(chǎn)GlcNAc能力的影響Fig.4 Effects of plasma membrane modification on strain growth and the ability to produce GlcNAc

3 結(jié) 語

研究了在枯草芽孢桿菌中過表達磷脂酸合成途徑的關(guān)鍵基因，以維持質(zhì)膜上FMMs和非FMMs的平衡。在此基礎(chǔ)上，將GlcNAc合成所需的2個外源途徑酶GNA1和YqaB通過SPFH結(jié)構(gòu)域錨定于FMMs，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)膜改造不僅能夠降低FMMs過度改造對菌株生長產(chǎn)生的不利影響，而且能夠促進中間代謝產(chǎn)物的加工，導(dǎo)致G6P、F6P、GlcN6P和GlcNAc6P的質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯低于對照菌株?；谏鲜鼋Y(jié)果，質(zhì)膜改造后菌株的GlcNAc產(chǎn)量達到（5.18±0.16）g/L，與對照菌株相比提升了41.9%。作者在前期FMMs過度修飾菌株的基礎(chǔ)上，首次通過質(zhì)膜改造來維持FMMs和非FMMs平衡，為降低FMMs過度修飾對菌株生長和產(chǎn)物合成產(chǎn)生的不利影響提供了新思路。