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黃芪多糖對(duì)黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用

2021-11-12 14:00姜麗麗李沐軒徐宋瑤扈瑞平薛慧婷
關(guān)鍵詞:別嘌呤醇黃嘌呤作圖

李 晶,姜麗麗*,李沐軒,鄧 鳳,徐宋瑤,薛 昕,扈瑞平,薛慧婷

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特010110;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 附屬醫(yī)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特010110)

痛風(fēng)是由持續(xù)的高尿酸血癥引發(fā)的代謝類疾病,表現(xiàn)為炎性反應(yīng),近年來(lái)發(fā)病率呈迅速上升趨勢(shì),嚴(yán)重影響人類健康[1]。黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)是尿酸生成的關(guān)鍵酶,普遍存在于各種生物體中,因其在體內(nèi)發(fā)生氧化作用產(chǎn)生尿酸,時(shí)間長(zhǎng)了還會(huì)引起各種并發(fā)癥[2-3]。臨床上常將黃嘌呤氧化酶抑制劑用作治療高尿酸血癥的藥物。別嘌呤醇是典型的黃嘌呤氧化酶抑制劑,目前廣泛應(yīng)用于痛風(fēng)的臨床治療,但是長(zhǎng)期使用別嘌呤醇會(huì)有肝損害等各種不同程度的毒副作用產(chǎn)生,用藥安全性一直困擾著人們,而安全無(wú)毒的中草藥是目前開(kāi)發(fā)和研究的方向[4]。

黃芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)是黃芪藥材的主要成分之一,屬于大分子有機(jī)化合物,由葡萄糖、鼠李糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等組成,是水溶性的淡黃色粉末,有抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等作用[5-6]。目前多糖在降尿酸的作用方面逐漸被人們發(fā)現(xiàn),文獻(xiàn)報(bào)道的有甘草多糖、鼠尾藻多糖和海帶多糖等,通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶活性阻礙尿酸合成,從而減少體內(nèi)尿酸濃度[3,7]。茯苓多糖可能是通過(guò)上調(diào)高尿酸血癥大鼠的腎臟尿酸相關(guān)有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體 1(rOAT1)的表達(dá)和下調(diào)尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(rURAT1)的表達(dá),從而增加了尿酸的排泄[8]。黃芪多糖對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用及抗高尿酸血癥的機(jī)理研究未見(jiàn)報(bào)道。鑒于當(dāng)前天然產(chǎn)物及活性提取物在痛風(fēng)病中的作用已逐漸成為研究熱點(diǎn),結(jié)合黃芪多糖的功效范圍廣、副作用低、多靶點(diǎn)作用等特點(diǎn),通過(guò)考察黃芪多糖對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用機(jī)理,探討其降尿酸作用的酶反應(yīng)機(jī)制,為今后指導(dǎo)臨床用藥提供新的參考,同時(shí)為開(kāi)發(fā)道地黃芪的生物學(xué)功能及產(chǎn)品的深加工提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取內(nèi)蒙古道地藥材蒙古黃芪的干燥根,粉碎過(guò)篩,60℃烘干至恒質(zhì)量,密封保存?zhèn)溆?。黃嘌呤氧化酶(XOD) ,黃嘌呤(xanthine):Sigma 公司產(chǎn)品;別嘌呤醇(純度98%):羅恩試劑;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、EDTA-2Na、氫氧化鈉:國(guó)藥集團(tuán)藥品。

1.2 儀器與設(shè)備

RE212-B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司制造;Scientz-N型真空冷凍干燥機(jī):寧波新芝生物科技有限公司制造;TU1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):北京普析通用儀器有限公司制造;QE-1000型高速萬(wàn)能粉碎機(jī):上海新諾儀器設(shè)備有限公司制造;DHG-9240A型電熱鼓風(fēng)干燥箱:上海一恒科學(xué)儀器有限公司制造;TD5M型多管架自動(dòng)平衡離心機(jī):上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司制造;SHHW21.600AⅡ型三用恒溫水箱:天津泰斯特儀器有限公司制造;PX224ZH型電子天平:奧豪斯儀器(常州)有限公司制造。

1.3 方法

1.3.1 黃芪多糖的制備 采用水提醇沉法提取黃芪多糖,參考文獻(xiàn)[9-12]優(yōu)化改進(jìn),蒙古黃芪干燥根用粉碎機(jī)粉碎,過(guò)60目篩子后于60℃烘干至恒質(zhì)量,按相應(yīng)液料體積比1∶11加純水,80℃浸提2 h,旋蒸濃縮后,經(jīng)8 g/dL三氯乙酸除蛋白質(zhì)3次,再用無(wú)水乙醇醇沉過(guò)夜,4 000 r/min離心5 min,沉淀經(jīng)無(wú)水乙醇清洗后真空冷凍干燥,得黃芪多糖,用硫酸-苯酚法測(cè)得黃芪多糖提取純度大于70%,密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 黃芪多糖對(duì)XOD抑制作用的測(cè)定 在酶促反應(yīng)過(guò)程中,XOD通過(guò)催化底物黃嘌呤反應(yīng)生成尿酸,尿酸在294 nm處具有特征吸收峰。將文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行改進(jìn),分為4個(gè)處理組,按照表1進(jìn)行加樣。在反應(yīng)體系中依次加入磷酸緩沖液(pH 7.5、0.2 mol/L)、底物黃嘌呤溶液(1 mmol/L)、不同質(zhì)量濃度的黃芪多糖溶液,加樣完畢后于25℃水浴10min,再加入25℃預(yù)溫后的酶液(8 μg/mL),混合均勻,從加入酶液開(kāi)始計(jì)時(shí),反應(yīng)時(shí)間1 min,紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值(A294)。

表1 酶活力測(cè)定體系的組成Table 1 Composition of enzyme reaction system

以公式 I(%)=[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100% 計(jì)算不同質(zhì)量濃度黃芪多糖對(duì)XOD的抑制率(I)。其中:A1~A4為處理組1—4在 294 nm處測(cè)得的吸光度值。以多糖質(zhì)量濃度對(duì)抑制率作圖,線性擬合得擬合方程,計(jì)算抑制率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的黃芪多糖質(zhì)量濃度,即為半抑制濃度(IC50)。

1.3.3 黃芪多糖對(duì)XOD抑制動(dòng)力學(xué)研究 酶活力測(cè)定體系中,設(shè)定底物黃嘌呤溶液濃度為1 mmol/L,加入不同質(zhì)量濃度黃芪多糖溶液 (0.4、0.8、1.2 mg/mL),測(cè)定在不同質(zhì)量濃度酶液(6、8、10、12 μg/mL)反應(yīng)條件下多糖對(duì)酶活力的影響。以加入的酶質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo),酶促反應(yīng)的速率為縱坐標(biāo)作圖,得到一組直線,若直線平行為不可逆抑制;若直線通過(guò)原點(diǎn)則為可逆抑制。

酶活力測(cè)定體系中,酶質(zhì)量濃度(8 μg/mL)不變,加入不同質(zhì)量濃度黃芪多糖溶液(0.4、0.8、1.2 mg/mL),測(cè)定在不同濃度底物黃嘌呤(0.6、0.8、1、1.2 mmol/L)條件下的反應(yīng)速率,通過(guò)雙倒數(shù)作圖法,以底物濃度倒數(shù)對(duì)反應(yīng)速率倒數(shù)作圖,根據(jù)所得曲線的形狀判斷黃芪多糖對(duì)XOD的抑制類型。按照Dixon作圖法,計(jì)算得到抑制常數(shù)Ki值。

1.3.4 黃芪多糖與別嘌呤醇對(duì)XOD的聯(lián)合作用探究 采用等毒法評(píng)價(jià)黃芪多糖與別嘌呤醇對(duì)XOD的聯(lián)合作用效果[14]。首先測(cè)定黃芪多糖和別嘌呤醇單獨(dú)使用時(shí)對(duì)XOD抑制率達(dá)到25%時(shí)各自的質(zhì)量濃度,按照該質(zhì)量濃度配制黃芪多糖和別嘌呤醇,將二者1∶1混合加入反應(yīng)體系,測(cè)定混合物對(duì)XOD的抑制率,并按如下公式計(jì)算得到共毒系數(shù),對(duì)黃芪多糖與別嘌呤醇對(duì)XOD的聯(lián)合作用效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

式中:X表示共毒系數(shù);I實(shí)表示實(shí)測(cè)抑制率。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)中所有樣品平行操作3次,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪多糖對(duì)XOD的抑制作用

黃芪多糖對(duì)XOD表現(xiàn)出抑制作用,當(dāng)黃芪多糖溶液質(zhì)量濃度為0~0.4 mg/mL時(shí),隨著多糖質(zhì)量濃度的增加,黃芪多糖對(duì)XOD的抑制率呈線性逐漸升高,表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系;在0.4~1.4 mg/mL時(shí),抑制率隨著多糖質(zhì)量濃度的增大而增大,但增長(zhǎng)趨勢(shì)變緩;當(dāng)多糖質(zhì)量濃度大于1.4 mg/mL時(shí)抑制率趨于恒定。對(duì)圖1曲線進(jìn)行線性擬合,計(jì)算得黃芪多糖對(duì)XOD的半抑制質(zhì)量濃度為1.37 mg/mL。

圖1 不同質(zhì)量濃度黃芪多糖對(duì)XOD活力的影響Fig.1 Effect of APS concentration on XOD activity

2.2 黃芪多糖對(duì)XOD抑制動(dòng)力學(xué)分析

固定底物濃度不變,在酶活力測(cè)定體系中加入不同質(zhì)量濃度的黃芪多糖,酶促反應(yīng)的速率V隨酶質(zhì)量濃度的變化而變化,以酶質(zhì)量濃度對(duì)反應(yīng)速率作圖,得到一組相交于原點(diǎn)的直線,并且直線斜率隨著多糖溶液質(zhì)量濃度的增大而減小,見(jiàn)圖2。說(shuō)明黃芪多糖對(duì)XOD屬于可逆抑制,黃芪多糖分子是通過(guò)非共價(jià)鍵與XOD結(jié)合導(dǎo)致了酶活性的降低,這種抑制作用是可逆的,使用物理方法可以使酶恢復(fù)活性。

圖2 黃芪多糖對(duì)XOD的抑制作用機(jī)理Fig.2 Inhibition mechanism of APS on XOD

在酶促反應(yīng)過(guò)程中,體系中酶質(zhì)量濃度固定不變,改變底物黃嘌呤溶液的質(zhì)量濃度,測(cè)定不同質(zhì)量濃度多糖溶液加入時(shí)對(duì)酶活力的影響。雙倒數(shù)作圖法得到一組直線,見(jiàn)圖3。隨著多糖質(zhì)量濃度的增大,直線斜率逐漸減小,且縱軸上的截距基本不變,符合酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特征,因此,黃芪多糖為XOD的一種競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制劑。采用Dixon作圖法,選取2個(gè)不同濃度的底物反應(yīng)體系,以黃芪多糖質(zhì)量濃度對(duì)酶反應(yīng)速率倒數(shù)作圖,得到2條直線,見(jiàn)圖4。根據(jù)兩直線的交點(diǎn)坐標(biāo)計(jì)算求得抑制常數(shù) Ki值為 0.59 mg/mL。

圖3 黃芪多糖對(duì)XOD的抑制類型的測(cè)定Fig.3 Determination of inhibition types of APS on XOD

圖4 黃芪多糖對(duì)XOD抑制常數(shù)的測(cè)定Fig.4 Determination of XOD inhibition constants of APS

2.3 黃芪多糖與別嘌呤醇對(duì)XOD的聯(lián)合作用效果評(píng)價(jià)

將黃芪多糖與別嘌呤醇單獨(dú)使用時(shí)對(duì)XOD抑制率達(dá)到25%的劑量混合,混合物對(duì)XOD的聯(lián)合抑制作用結(jié)果見(jiàn)表2。混合物對(duì)XOD的聯(lián)合抑制率為26.67%±1.15%,共毒系數(shù)為-46.66±2.65。根據(jù)共毒系數(shù)理論,黃芪多糖與別嘌呤醇的聯(lián)合作用類型為拮抗作用,說(shuō)明二者同時(shí)使用會(huì)降低各自對(duì)XOD的抑制效果。

表2 混合物對(duì)XOD活性的聯(lián)合作用效果Table 2 Combined effect of mixture on XOD activity

3 結(jié) 語(yǔ)

近年來(lái),有關(guān)中藥提取物對(duì)XOD抑制作用的研究已有相關(guān)報(bào)道,李英等研究了金銀花水提物對(duì)XOD的抑制作用,經(jīng)測(cè)定其IC50為1.95 mg/mL[15];王亞楠等發(fā)現(xiàn)紫蘇葉提取物對(duì)XOD具有抑制作用,IC50為5.8 mg/mL[16]。申啟榮研究了17種中藥的水提物和醇提物對(duì)XOD的抑制作用,這些抑制劑的IC50基本處于0.5~5.5 mg/mL范圍內(nèi)[17]。綜合這些研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),目前中藥來(lái)源對(duì)XOD具有抑制作用的活性物質(zhì)主要集中于水提物或醇提物,多糖對(duì)XOD的抑制作用研究較少。本研究的特色在于采用了三氯乙酸除蛋白質(zhì)3次,有效降低了生物體中主要成分蛋白質(zhì)對(duì)結(jié)果的干擾,更能真實(shí)體現(xiàn)多糖對(duì)XOD的抑制作用。

研究了黃芪多糖在體外對(duì)XOD活性的影響,發(fā)現(xiàn)黃芪多糖對(duì)XOD具有顯著抑制作用,IC50為1.37 mg/mL。與其他中藥提取物相比,黃芪多糖具有較高的XOD抑制活性。對(duì)黃芪多糖的動(dòng)力學(xué)分析表明,黃芪多糖對(duì)XOD的抑制作用類型為競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制,即黃芪多糖與底物黃嘌呤結(jié)構(gòu)相似,二者共同競(jìng)爭(zhēng)酶的結(jié)合部位,抑制劑與酶形成可逆復(fù)合物,但這類復(fù)合物不能分解形成產(chǎn)物尿酸,這種抑制作用可以通過(guò)增加底物黃嘌呤的質(zhì)量濃度得到解除。此抑制類型與別嘌呤醇作用類型相同,但毒副作用卻大大降低,具有開(kāi)發(fā)前景。

作者還探究了黃芪多糖和別嘌呤醇的聯(lián)合抑制作用,結(jié)果顯示黃芪多糖和別嘌呤醇的聯(lián)合抑制作用表現(xiàn)為拮抗作用,說(shuō)明二者合用的效應(yīng)小于它們分別作用的總和,但在臨床治療過(guò)程中有時(shí)也可將具有拮抗作用的藥物有意識(shí)的配伍使用,以糾正主藥的副作用和突出主藥的主要作用?;趧e嘌呤醇在臨床治療痛風(fēng)的過(guò)程中產(chǎn)生的毒副作用較嚴(yán)重,未來(lái)有望將二者同時(shí)使用以減輕別嘌呤醇的毒副作用,具體用量與方法還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,雖然黃芪多糖作為一種XOD抑制劑與目前臨床應(yīng)用的化學(xué)合成類XOD抑制劑類藥物相比抑制活性較低,但是黃芪作為一種本地大量栽培種植的道地中藥材,其來(lái)源廣泛,性溫?zé)o毒副作用,可以考慮用于痛風(fēng)患者的預(yù)防輔助治療。在本研究的基礎(chǔ)上,未來(lái)黃芪多糖在體內(nèi)對(duì)XOD的抑制效果仍需進(jìn)一步驗(yàn)證,同時(shí)多糖相對(duì)分子質(zhì)量的大小及分布對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制率有無(wú)影響也有待于進(jìn)一步研究。

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