潘學(xué)瑋 ，孫長(zhǎng)皓 ，尤甲甲 ，徐美娟 ，張 顯 ，邵明龍 ，楊套偉 ，饒志明 *

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

靈菌紅素（Prodigiosin，PG）作為一種具有3個(gè)吡咯環(huán)的甲氧基吡咯骨架結(jié)構(gòu)類物質(zhì)，是一種微生物次級(jí)代謝產(chǎn)生的重要天然紅色素[1]。研究發(fā)現(xiàn)，靈菌紅素具有抗細(xì)菌、抗瘧疾、抗腫瘤和免疫抑制等重要功能，在醫(yī)藥開發(fā)、環(huán)境治理和染料制備等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用價(jià)值[2-6]。目前，靈菌紅素的制備方法主要包括化學(xué)合成法和微生物法。由于化學(xué)合成法反應(yīng)步驟多、產(chǎn)率低，難以實(shí)現(xiàn)靈菌紅素的大規(guī)模生產(chǎn)。而微生物法生產(chǎn)靈菌紅素具有環(huán)境友好、條件溫和、成本低和易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，因此近年來微生物法生產(chǎn)靈菌紅素已成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)。而自然界中產(chǎn)靈菌紅素的微生物種類主要包括：沙雷氏菌屬 （Serratia Sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas Sp.）、河氏菌屬（Hahella Sp.）、弧菌屬（Vibrio Sp.）和海洋新細(xì)菌（Zooshikella rubidu）等[7-11]，其中研究最為廣泛的為黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens），該菌又被稱為靈桿菌，是一種常見的革蘭氏陰性菌，廣泛存在于土壤、水、植物、昆蟲和食品等環(huán)境中。

對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究發(fā)現(xiàn)，黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素受多個(gè)基因的共同調(diào)控，這些基因可被分為兩大類：靈菌紅素生物合成途徑所必須基因以及編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相關(guān)基因。其中，黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素的代謝途徑見圖1。該代謝途徑由pig基因簇上14個(gè)基因所控制，通過兩個(gè)分支途徑合成靈菌紅素，這兩個(gè)分支途徑分別合成靈菌紅素的兩個(gè)前體物質(zhì)2-甲基-3-戊基吡咯（MAP）和 4-甲氧基-2，2-二吡咯-5-羧甲基乙醛（MBC），兩者經(jīng)縮合酶PigC作用生成靈菌紅素。其中，MAP以2-辛烯醛為起始前體，在基因pigD、pigE和pigB的催化下氧化脫氫形成MAP。MBC的合成以L-脯氨酸為起始底物，在基因 pigI、pigG、pigA、pigJ、pigH、pigM、pigF 和 pigN 的作用下生成MBC[12]。在黏質(zhì)沙雷氏菌中，靈菌紅素的合成也受到多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的直接或間接調(diào)控，包括靈菌紅素合成負(fù)調(diào)控因子MetR[13]、SpnR[14]和 SmaR[15]，以及正調(diào)控因子 EepR[16]、PigP[17]和RbsR[18]。盡管這些基因參與調(diào)控黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素，但是我們對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素背后的調(diào)控機(jī)制的了解依然有限。

圖1 黏質(zhì)沙雷氏菌中靈菌紅素合成途徑Fig.1 Prodigiosin biosynthesis pathway in S.marcescens

以作者所在實(shí)驗(yàn)室先前分離至土壤中的黏質(zhì)沙雷氏菌JNB5-1為研究對(duì)象[13，19]，構(gòu)建轉(zhuǎn)座子插入突變文庫發(fā)現(xiàn)，DeoR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PsrB正調(diào)控黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素。通過RT-qPCR、融合報(bào)告基因的構(gòu)建及EMSA等實(shí)驗(yàn)證實(shí)，轉(zhuǎn)錄因子PsrB通過直接與黏質(zhì)沙雷氏菌靈菌紅素合成基因簇pig基因簇結(jié)合，刺激pig基因簇的轉(zhuǎn)錄水平，最終影響?zhàn)べ|(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素。該研究探索了黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素的調(diào)控機(jī)制，并為代謝工程改造黏質(zhì)沙雷氏菌生產(chǎn)靈菌紅素提供了一種新的策略。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

黏質(zhì)沙雷氏菌 （Serratia marcescens）JNB5-1：作者所在實(shí)驗(yàn)室先前從土壤中篩選得到[13，19]；K8-61:本研究篩選得到的靈菌紅素合成能力顯著下降Tn5G轉(zhuǎn)座子插入突變株；ΔPsrB：本研究構(gòu)建得到基因psrB缺失突變株；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 和 BL21（DE3）：購自生工生物工程（上海）股份有限公司；質(zhì)粒pUCP18和pDN19lacΩ：作者所在實(shí)驗(yàn)室保存；重組質(zhì)粒pXW1906和pXW1905等：本研究構(gòu)建。本研究使用的菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 本研究所用的菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 試劑

質(zhì)粒DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：購自上海捷瑞生物工程有限公司；ClonExpress?II One Step Cloning Kit、2×Phanta?Max Master Mix、HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）和 ChamQTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix：購自南京諾唯贊生物科技有限公司；RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit：購自天根生化科技（北京）有限公司；EcoR I、BamH I和Hind III等限制性內(nèi)切核酸酶：購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；慶大霉素、氨芐青霉素和硫酸安普霉素等抗生素：購自上海阿拉丁生化科技有限公司；其他試劑：均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

大腸桿菌采用LB培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH 7.0），于37℃下180 r/min進(jìn)行培養(yǎng)；黏質(zhì)沙雷氏菌采用LB培養(yǎng)基于30℃下180 r/min進(jìn)行培養(yǎng)；黏質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素時(shí)，培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基或特定的發(fā)酵培養(yǎng)基（蔗糖 20 g/L、牛肉膏 15 g/L、CaCl210 g/L、脯氨酸 7.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L 和 FeSO4·7H2O 0.06 g/L，pH 7.0）。在培養(yǎng)大腸桿菌時(shí)，將向培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度為10 μg/mL的慶大霉素、25 μg/mL的硫酸鏈霉素、25 μg/mL 的壯觀霉素、50 μg/mL 的卡那霉素或50 μg/mL氨芐青霉素；培養(yǎng)黏質(zhì)沙雷氏菌時(shí)，將向培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的慶大霉素、25 μg/mL 的硫酸鏈霉素、25 μg/mL 的壯觀霉素、50 μg/mL的硫酸安普霉素或150 μg/mL氨芐青霉素。

1.4 轉(zhuǎn)座子插入突變文庫的構(gòu)建以及突變株SK8-61的篩選

以大腸桿菌E.coli/pRK2013 Tn5G為供體菌，黏質(zhì)沙雷氏菌S.marcescens JNB5-1為受體菌，利用接合轉(zhuǎn)移的方式構(gòu)建Tn5G轉(zhuǎn)座子插入突變文庫，得到黏質(zhì)沙雷氏菌Tn5G轉(zhuǎn)座子插入突變文庫[13]。突變文庫中的突變子經(jīng)在含抗生素慶大霉素（50 μg/mL）和氨芐青霉素（50 μg/mL）的雙抗平板上過夜培養(yǎng)24 h后，觀察菌落的顏色，挑取菌落顏色顯著下降的突變株作為靈菌紅素合成能力顯著下降的潛在突變株。然后將這些突變株及野生型菌株JNB5-1接種至LB培養(yǎng)基中進(jìn)行過夜培養(yǎng)后（16 h），按照體積分?jǐn)?shù)4%接種至新鮮的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以進(jìn)一步確定突變株合成靈菌紅素能力，最終篩選得到靈菌紅素合成能力顯著下降的突變株SK8-61。

1.5 突變株SK8-61中Tn5G轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的鑒定

突變株SK8-61中Tn5G轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的鑒定按照文獻(xiàn)[24]的反向PCR方法進(jìn)行。提取得到菌株SK8-61基因組DNA后，用限制性內(nèi)切酶TaqⅠ酶切突變株基因組DNA，之后DNA連接酶自連得到環(huán)狀的DNA片段。然后以環(huán)狀的DNA片段為模板，利用引物OTn1和OTn2進(jìn)行反向PCR得到DNA片段。擴(kuò)增得到的DNA片段經(jīng)測(cè)序后與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)（http：//www.ncbi.nml.nih.gov/），以確定Tn5G轉(zhuǎn)座子的插入位點(diǎn)。為進(jìn)一步驗(yàn)證被阻斷基因的功能，以黏質(zhì)沙雷氏菌JNB5-1基因組DNA為模板，PsrB-F1和PsrB-R1為引物擴(kuò)增得到被破壞基因的完整序列并克隆至載體pUCP18上得到重組質(zhì)粒pXW1906。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至突變株SK8-61中進(jìn)行功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，以證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子PsrB對(duì)于黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素的重要性。本研究中所用到的引物見表2。

表2 本研究所用到的引物Table 2 Primers used in this study

續(xù)表2

1.6 psrB缺失突變株ΔPsrB及psrB過表達(dá)菌株JNB5-1/pXW1906的構(gòu)建

如采用基因替換的方法對(duì)菌株JNB5-1的psrB基因進(jìn)行失活[13]。通過對(duì)引物擴(kuò)增得到靶基因psrB基因的上下游片段和aacC3抗性基因的DNA片段。通過重疊延伸PCR將aacC3基因整合到目標(biāo)基因上下游片段的中間，然后將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆至pUTKm載體中得到重組質(zhì)粒pUTKm-PsrB。將得到的質(zhì)粒pUTKm-PsrB轉(zhuǎn)化至大腸桿菌S17-1中得到重組菌株S17-1/pUTKm-PsrB。最后以大腸桿菌E.coli S17-1/pUTKm-PsrB為供體菌、黏質(zhì)沙雷氏菌JNB5-1為受體菌，通過接合轉(zhuǎn)移的方法對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌JNB5-1的psrB基因進(jìn)行敲除。psrB過表達(dá)菌株JNB5-1/pXW1906的構(gòu)建方法，是將構(gòu)建得到的攜帶有psrB基因的重組質(zhì)粒pXW1906導(dǎo)入至菌株JNB5-1中得到重組菌株JNB5-1/pXW1906。

1.7 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

測(cè)定菌株 JNB5-1、SK8-61、SK8-61/pXW1906、ΔPsrB、ΔPsrB/pXW1906 及 JNB5-1/pXW1906的生長(zhǎng)曲線。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（OD600=0.8）轉(zhuǎn)接至新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，于30℃、180 r/min下連續(xù)培養(yǎng)，每隔 0、2、4、6、8、10、12、24 h 檢測(cè)培養(yǎng)液的光密度A600nm，繪制得到菌株 JNB5-1、SK8-61、SK8-61/pXW1906、ΔPsrB、ΔPsrB/pXW1906 及 JNB5-1/pXW1906的生長(zhǎng)曲線[13]。

1.8 RNA的提取和RT-qPCR

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子PsrB對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌靈菌紅素合成基因簇pig基因簇基因表達(dá)水平的影響，將過夜培養(yǎng)的黏質(zhì)沙雷氏菌野生型菌株JNB5-1及psrB突變株ΔPsrB，以4%的接種體積分?jǐn)?shù)分別接種于新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，于30℃、180 r/min培養(yǎng) 12 h，取 1 mL樣品用 RNAprepPure Cell/Bacteria Kit（DP430）試劑盒（TiangenBiotech，China）提取樣品總 RNA，然后利用 HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（R223-01）試劑盒（Vazyme Biotech，China）對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再利用StepOnePlus熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）進(jìn)行 RT-qPCR 分析，以分析基因pigABCDEFGHIJKLMN在菌株JNB5-1及SK8-61中的表達(dá)水平。RT-qPCR具體操作參照ChamQTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix（Q311）試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃ 10 s，60℃ 30 s，共 40個(gè)循環(huán)，然后 95℃ 15 s，60℃60 s，95℃ 15 s。每個(gè)目的基因均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，計(jì)算平均閾值循環(huán)。編碼16S rDNA的基因被作為內(nèi)參基因進(jìn)行定量，最后使用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

1.9 轉(zhuǎn)錄融合報(bào)告基因的構(gòu)建

參考文獻(xiàn)[25-26]的方法構(gòu)建轉(zhuǎn)錄融合報(bào)告基因[25-26]。首先根據(jù)黏質(zhì)沙雷氏菌UMH8基因組序列（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP018927.1），設(shè)計(jì)引物PigA-F和PigA-R，以黏質(zhì)沙雷氏菌JNB5-1基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到攜帶有pig操縱子啟動(dòng)子區(qū)域的DNA片段，然后將該DNA片段連接至載體pDN19lacΩ中得到重組質(zhì)粒pXW1905。重組質(zhì)粒pXW1905轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含硫酸鏈霉素（50 μg/mL）和壯觀霉素（50 μg/mL）的雙抗平板上篩選得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒，經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切后驗(yàn)證重組菌株E.coli DH5α/pXW1905是否構(gòu)建成功。為檢測(cè)野生型菌株JNB5-1及psrB缺失突變株SK8-61中pig基因簇的表達(dá)差異，重組質(zhì)粒pXW1905將通過電轉(zhuǎn)的方式分別轉(zhuǎn)移至菌株JNB5-1及SK8-61中得到重組菌株JNB5-1/pXW1905和SK8-61/pXW1905。為體內(nèi)證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子PsrB與pig基因簇啟動(dòng)子區(qū)域間的直接相互作用，質(zhì)粒pXW1906和pUCP18將分別轉(zhuǎn)移至菌株E.coli DH5α/pXW1905中，得到重組菌株E.coli DH5α/pUCP18/pXW1905 和 E.coli DH5α/pXW1906/pXW1905。

1.10 β-半乳糖苷酶酶活的測(cè)定

將過夜培養(yǎng)的菌株S.marcescens JNB5-1/pXW1905 和 SK8-61/pXW1905、E.coliDH5α/pUCP18/pXW1905和 DH5α/pXW1906/pXW1905分別轉(zhuǎn)接至新鮮的液體LB培養(yǎng)基，30℃或37℃振蕩培養(yǎng)至A600nm為3.0，按照標(biāo)準(zhǔn)的Miller方法檢測(cè)由lacZ基因編碼的β-半乳糖苷酶酶活，即取上述菌液于試管中，向試管中加入80 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%SDS，80 μL 氯仿，3 mL Z-buffer，800 μL ONPG（4 g/L），待反應(yīng)液變黃后，加入1 mol/L碳酸鈉溶液終止反應(yīng)并記錄反應(yīng)時(shí)間。將反應(yīng)液離心，吸取上清測(cè)定A420nm下的吸光值，利用公式Mnit=（1 000×A420nm）/（T×A600nm）計(jì)算酶活。

1.11 凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）

參照文獻(xiàn)[25]報(bào)道的EMSA實(shí)驗(yàn)方法，證明轉(zhuǎn)錄因子PsrB是否直接與pig操縱子啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合[25]。EMSA實(shí)驗(yàn)的流程為：1）以黏質(zhì)沙雷氏菌JNB5-1基因組DNA為模板，表2中所列的引物對(duì)PsrB-F2/PsrB-R2為引物，擴(kuò)增得到psrB基因，并將PCR產(chǎn)物克隆至攜帶有His標(biāo)簽的pET28a（+）表達(dá)載體中得到重組菌株 BL21/pET28a（+）-PrsB，該菌株經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)psrB基因表達(dá)后，純化得到PsrB蛋白；2）以黏質(zhì)沙雷氏菌JNB5-1基因組DNA為模板，表2中所列的引物對(duì)PigA-F/PigA-R為引物，擴(kuò)增得到攜帶有pig操縱子啟動(dòng)子區(qū)域的DNA片段；3）將純化的攜帶有pig操縱子啟動(dòng)子區(qū)域的DNA片段與PsrB蛋白的系列稀釋液在添加有2×結(jié)合緩沖液（40 mmol/L Tris HCl、4 mmol/L MgCl2、100 mmol/L NaCl、10%甘油、2 mmol/L DTT、0.2 mg/mL BSA 和 1 mmol/L EDTA）的EP管中一起室溫靜置30 min；4）在5 g/dL的非變性PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，用溴化乙啶染色，以顯示PsrB蛋白是否能與攜帶有pig操縱子啟動(dòng)子區(qū)域的DNA片段結(jié)合。

1.12 黏質(zhì)沙雷氏菌 JNB5-1、SK8-61、ΔPsrB及JNB5-1/pXW1906發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素能力分析 參照文獻(xiàn)[27]的方法[27]，對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌 JNB5-1、SK8-61、SK8-61/pXW1906、ΔPsrB/pXW1906 及 JNB5-1/pXW1906于LB培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素能力進(jìn)行分析。上述菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期（OD600=0.8）細(xì)胞以4%的接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基中，間隔相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取樣，溶于酸性乙醇（pH 3.0）中，然后室溫靜置8 h，離心取上清液，測(cè)定波長(zhǎng)A535下樣品的吸光值，最后根據(jù)公式Y(jié)=1.193 6X-0.001計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)各菌株產(chǎn)靈菌紅素量（Y表示發(fā)酵液溶于酸性乙醇（pH 3.0）時(shí)，于波長(zhǎng)A535下測(cè)定得到的吸光值；X表示菌株產(chǎn)靈菌紅素的量）。

2 結(jié)果與分析

2.1 PsrB對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素的影響

為篩選得到黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素相關(guān)基因，按照?qǐng)D2（a）所示的方法，以大腸桿菌E.coli/pRK2013 Tn5G為供體菌，黏質(zhì)沙雷氏菌S.marcescens JNB5-1為受體菌，構(gòu)建Tn5G轉(zhuǎn)座子插入突變文庫，篩選得到了黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素能力顯著下降突變株SK8-61。反向PCR鑒定突變株SK8-61被阻斷基因發(fā)現(xiàn)，突變株SK8-61被阻斷基因?yàn)锽VG90_04085，轉(zhuǎn)座子Tn5G插入位點(diǎn)位于基因BVG90_04085編碼區(qū)第94 bp和第95 bp之間，見圖2（b）。進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，基因BVG90_04085編碼的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子BVG90_04085在其N端具有一個(gè)螺旋轉(zhuǎn)角螺旋（HTH）的DNA結(jié)合域，C端具有一個(gè)DeoRC的結(jié)構(gòu)域。

圖2 黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素相關(guān)基因psrB的發(fā)現(xiàn)Fig.2 Identification of prodigiosin biosynthesis related gene psrB in S.marcescens

搖瓶發(fā)酵分析突變株SK8-61及野生型菌株JNB5-1于LB培養(yǎng)基中合成靈菌紅素能力發(fā)現(xiàn)，較野生型菌株JNB5-1相比，突變株SK8-61合成靈菌紅素能力顯著降低，發(fā)酵24 h后，野生型菌株JNB5-1可合成51.22 mg/L的靈菌紅素，而突變株SK8-61僅合成11.21 mg/L的靈菌紅素，為野生型菌株的0.22倍，見圖3。在功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中，將基因BVG90_04085整合至載體pUCP18中，得到重組質(zhì)粒pXW1906，并轉(zhuǎn)移至突變株SK8-61中得到重組菌株SK8-61/pXW1906。搖瓶發(fā)酵分析重組菌株SK8-61/pXW1906合成靈菌紅素能力發(fā)現(xiàn)，重組菌株SK8-61/pXW1906發(fā)酵24 h，靈菌紅素產(chǎn)量可達(dá)50.20 mg/L，顯著高于突變株 SK8-61（11.21 mg/L），接近于野生型菌株JNB5-1（51.22 mg/L），表明轉(zhuǎn)錄因子編碼基因BVG90_04085參與黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素。鑒于轉(zhuǎn)錄因子BVG90_04085編碼基因BVG90_04085具有影響?zhàn)べ|(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素的能力，將該基因命名為psrB（Prodigiosin synthesis related gene B）。為進(jìn)一步驗(yàn)證基因psrB的功能，構(gòu)建了psrB缺失突變株ΔPsrB和psrB過表達(dá)菌株JNB5-1/pXW1906。搖瓶發(fā)酵分析菌株ΔPsrB和JNB5-1/pXW1906發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素能力發(fā)現(xiàn)，菌株ΔPsrB和JNB5-1/pXW1906發(fā)酵24 h，可分別合成13.28 mg/L和108.46 mg/L的靈菌紅素。上述結(jié)果表明，PsrB為黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素刺激因子。

圖3 搖瓶發(fā)酵分析菌株 JNB5-1，SK8-61，SK8-61/pXW1906，ΔPsrB，ΔPsrB/pXW1906和JNB5-1/pXW1906合成靈菌紅素能力Fig.3 Shake flask fermentation to determine the ability of JNB5-1，SK8-61，SK8-61/pXW1906，ΔPsrB，ΔPsrB/pXW1906 and JNB5-1/pUCP16 strains to synthesize prodigiosin

2.2 PsrB對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

為分析轉(zhuǎn)錄因子PsrB正調(diào)控黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素的原因，首先分析PsrB是否影響?zhàn)べ|(zhì)沙雷氏菌的細(xì)胞生長(zhǎng)速率。如圖4所示，測(cè)定野生型菌株JNB5-1、psrB突變株SK8-61和ΔPsrB、功能互補(bǔ)菌株SK8-61/pXW1906和ΔPsrB/pXW1906和psrB過表達(dá)菌株JNB5-1/pXW1906細(xì)胞生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，5株菌株生長(zhǎng)無明顯差異，表明PsrB不影響細(xì)胞生物量的合成，因而不影響?zhàn)べ|(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素。

圖4 菌株JNB5-1、SK8-61、ΔPsrB、SK8-61/pXW1906、ΔPsrB/pXW1906和JNB5-1/pXW1908的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curves of JNB5-1，SK8-61，ΔPsrB，SK8-61/pXW1906，ΔPsrB/pXW1906 and JNB5-1/pXW1908 strains

分析菌株JNB5-1、SK8-61、ΔPsrB、SK8-61/pXW1906、ΔPsrB/pXW1906 和 JNB5-1/pXW1906單個(gè)細(xì)胞合成靈菌紅素能力發(fā)現(xiàn)，較野生型菌株JNB5-1相比，psrB突變株SK8-61和ΔPsrB合成靈菌紅素能力顯著降低，而psrB過表達(dá)菌株JNB5-1/pXW1906合成靈菌紅素能力顯著提高，見圖5。表明轉(zhuǎn)錄因子PsrB可能通過影響靈菌紅素合成關(guān)鍵基因簇的表達(dá)水平來影響?zhàn)べ|(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素。

圖5 菌株 JNB5-1、SK8-61、ΔPsrB、SK8-61/pXW1906、ΔPsrB/pXW1906和JNB5-1/pXW1906單個(gè)細(xì)胞合成靈菌紅素能力Fig.5 Analysis of unit cell to synthesize prodigiosin in JNB5-1，SK8-61，ΔPsrB，SK8-61/pXW1906，ΔPsrB/pXW1906 and JNB5-1/pXW1906 strains

2.3 PsrB對(duì)靈菌紅素合成基因簇pig基因簇的轉(zhuǎn)錄水平的影響

黏質(zhì)沙雷氏菌中靈菌紅素的合成途徑由位于同一操縱子上的 pigA、pigB、pigC、pigD、pigE、pigF、pigG、pigH、pigI、pigJ、pigK、pigL、pigM 和 pigN 等 14個(gè)基因組成，見圖6（a）。為進(jìn)一步解析PsrB如何促進(jìn)黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素，作者通過RT-qPCR分析了野生型菌株JNB5-1及psrB缺失突變株ΔPsrB中靈菌紅素合成基因簇pig基因簇的表達(dá)水平。如圖6（b）所示，相比于野生型菌株JNB5-1，突變株ΔPsrB中，基因pigABCDEFGHIJKLMN的表達(dá)水平均顯著下降，分別下調(diào)5.81～22.93倍，表明PsrB參與調(diào)控靈菌紅素合成基因簇pig基因簇的表達(dá)水平。

圖6 PsrB正調(diào)控靈菌紅素合成基因簇pig基因簇的轉(zhuǎn)錄水平Fig.6 The transcription of pig gene cluster positively regulated by PsrB

為進(jìn)一步確定PsrB參與調(diào)控pig基因簇的表達(dá)水平，作者以黏質(zhì)沙雷氏菌JNB5-1基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到了含有pig基因簇啟動(dòng)子區(qū)域的DNA片段，并將其置于不含啟動(dòng)子的lacZ基因的前面，構(gòu)建得到了攜帶有融合報(bào)告基因PpigA-lacZ的重組質(zhì)粒 pXW1905（pDN19lacΩ-PpigA），并分別導(dǎo)入菌株JNB5-1及ΔPsrB中得到重組菌株JNB5-1/pXW1905和ΔPsrB/pXW1905，最終通過測(cè)定菌株JNB5-1及ΔPsrB中β-半乳糖苷酶的酶活，分析了野生型菌株JNB5-1及psrB突變株ΔPsrB中pig基因簇的表達(dá)差異。如圖6（c）所示，在野生型菌株JNB5-1中，β-半乳糖苷酶的酶活顯著高于psrB突變株ΔPsrB，表明PsrB正調(diào)控黏質(zhì)沙雷氏菌pig基因簇的表達(dá)水平。綜上所述，PsrB正調(diào)控靈菌紅素合成基因簇pig基因簇的表達(dá)水平。

2.4 PsrB與靈菌紅素合成基因族pig基因簇間的相互作用

研究轉(zhuǎn)錄因子PsrB是否直接作用于pig基因簇以影響pig基因簇的表達(dá)水平，并進(jìn)而影響?zhàn)べ|(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素。通過凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（EMSA assay）分析了PsrB與pig基因簇啟動(dòng)子間的相互結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子PsrB的加入將阻礙DNA片段PpigA的遷移，見圖7（a）。表明轉(zhuǎn)錄因子PsrB可直接作用于靈菌紅素合成基因簇pig，進(jìn)一步證實(shí)PsrB與pig基因簇間的直接相互作用。將攜帶有psrB基因的重組質(zhì)粒pXW1906和pUCP18質(zhì)粒分別導(dǎo)入至大腸桿菌E.coli DH5α中得到了重組菌株DH5α/pXW1906和DH5α/pUCP18，并將重組質(zhì)粒 pXW1905分別導(dǎo)入至菌株 DH5α/pXW1906和DH5α/pUCP18 得到了重組菌株 DH5α/pUCP18/pXW1905和 DH5α/pXW1906/pXW1905，測(cè)定了兩株菌中β-半乳糖苷酶的酶活。如圖7（b）所示，在攜帶有SmPsrB的大腸桿菌 DH5α/pXW1906-pXW1905中，β-半乳糖苷酶的酶活明顯高于SmPsrB缺失的大腸桿菌DH5α/pUCP18/pXW1905，表明PsrB可直接作用于pig基因簇，并正調(diào)控pig基因簇的表達(dá)水平。綜上所述，轉(zhuǎn)錄因子PsrB通過直接作用于pig基因簇啟動(dòng)子區(qū)域，正調(diào)控靈菌紅素合成基因簇的轉(zhuǎn)錄水平，最終達(dá)到正調(diào)控黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素的目的。

圖7 PsrB直接調(diào)控pig基因簇的表達(dá)水平Fig.7 Synthesis of prodigiosin genes directly regulated by PsrB

2.5 轉(zhuǎn)錄因子PsrB對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子PsrB對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素的影響，作者分析了野生型菌株JNB5-1、psrB突變株ΔPsrB、功能互補(bǔ)菌株ΔPsrB/pXW1906及psrB過表達(dá)菌株JNB5-1/pXW1906發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素能力。如圖8所示，與野生型菌株JNB5-1相比，psrB過表達(dá)菌株JNB5-1/pXW1906發(fā)酵72 h后可合成8.61 g/L的靈菌紅素，為出發(fā)菌株JNB5-1（5.53 g/L）的1.56倍。而psrB缺失突變株ΔPsrB發(fā)酵72 h僅可合成1.46 g/L的靈菌紅素，為出發(fā)菌株的0.26倍。這些結(jié)果再次證實(shí)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PsrB正調(diào)控黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素，為代謝工程改造黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素提供了一種新的策略。

圖8 發(fā)酵培養(yǎng)基中菌株JNB5-1、ΔPsrB、ΔPsrB/pXW1906和JNB5-1/pXW1906發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素分析及生長(zhǎng)曲線的測(cè)定Fig.8 Analysis of prodigiosin production and growth curves of JNB5-1，ΔPsrB，ΔPsrB/pXW1906 and JNB5-1/pXW1906 strains in fermentation medium

3 結(jié) 語

靈菌紅素是一種由黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)生的天然紅色線狀三吡咯色素，具有免疫抑制、抗細(xì)菌和抗腫瘤等生物活性[12]。研究表明，黏質(zhì)沙雷氏菌靈菌紅素的生物合成受到多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的調(diào)控，包括正調(diào)控因子 EepR[16]、PigP[17]、GumB[28]和 RbsR[18]，以及負(fù)調(diào)控因子 MetR[13]、CopA[29]、CRP[30]、HexS[31]、RssB[32]、SmaR[15]和 SpnR[14]。 其中，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子HexS、EepR、PigP和RssB直接與靈菌紅素合成基因簇pig基因簇的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素[16-17，31-32]。CRP通過與轉(zhuǎn)錄因子EepR的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，間接調(diào)節(jié)黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素[33]。轉(zhuǎn)錄因子MetR通過與靈菌紅素合成正調(diào)控因子PigP的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，負(fù)調(diào)控黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素[13]。盡管這些轉(zhuǎn)錄因子已被報(bào)道參與調(diào)控黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素，但是我們對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理解依然有限。通過構(gòu)建一個(gè)隨機(jī)的轉(zhuǎn)座子插入突變體文庫，發(fā)現(xiàn)DeoR家族轉(zhuǎn)錄因子PsrB是一個(gè)靈菌紅素合成正調(diào)控因子。與野生型菌株JNB5-1相比，psrB過表達(dá)菌株JNB5-1/pXW1906在LB培養(yǎng)基中的產(chǎn)量是野生型菌株的2.12倍。分析靈菌紅素合成基因族pig基因族上pigABCDEFGHIJKLMN的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，psrB缺失突變株 ΔPsrB中基因pigABCDEFGHIJKLMN的表達(dá)水平顯著下調(diào)。EMSA分析轉(zhuǎn)錄因子PsrB與pig基因簇啟動(dòng)子區(qū)域間的相互作用發(fā)現(xiàn)，PsrB可直接與pig基因簇的啟

動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。因此，轉(zhuǎn)錄因子PsrB正調(diào)控黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素的分子機(jī)制是PsrB直接與pig基因簇的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，刺激pig基因簇的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而提高黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素。從黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素發(fā)酵培養(yǎng)基[27]中發(fā)酵菌株JNB5-1/pXW1906產(chǎn)靈菌紅素中發(fā)現(xiàn)，菌株JNB5-1/pXW1906發(fā)酵72 h，可合成8.61 g/L的靈菌紅素，為出發(fā)菌株JNB5-1（5.53 g/L）的1.56倍。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明，轉(zhuǎn)錄因子PsrB正調(diào)控黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素。同時(shí)，本研究也為代謝改造黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素提供了一種新的思路。