肖銳 周芳麗 萬春虎 華水生 李韶輝

江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬洪都中醫(yī)院，江西 南昌 330000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)屬于低骨量且骨微結(jié)構(gòu)被損傷導(dǎo)致的骨折風(fēng)險系數(shù)上升的骨代謝病，其發(fā)病原因呈現(xiàn)多樣化，根據(jù)發(fā)病原因的不同分為原發(fā)性和繼發(fā)性。OP臨床發(fā)病人數(shù)正逐年上升，因此受到醫(yī)學(xué)界的重點關(guān)注[1]。骨代謝紊亂是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松等骨代謝疾病的主要原因，許多研究[2-3]表明，microRNA(miRNA)在骨代謝的各個過程中都起到一定的作用。其中miR-214近年來被發(fā)現(xiàn)在骨代謝中起著重要的作用[4]，與老年性骨質(zhì)疏松以及絕經(jīng)后骨質(zhì)骨質(zhì)疏松密切相關(guān)[4-5]。miRNA通過靶向作用于骨吸收因子、成骨因子及其他骨代謝調(diào)控因子，參加BMSCs、OB、破骨細胞(osteoclast，OC)的增殖和分化過程，對骨代謝過程進行調(diào)控。BMP-2/Smad通路是骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)向成骨細胞(osteoblast，OB)誘導(dǎo)分化的主要信號通路之一。BMP-2和其他骨形態(tài)形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMPs)家族成員在骨和軟骨的發(fā)育過程中起著重要作用，同時Smad4是骨形態(tài)發(fā)生中重要的介導(dǎo)因子之一，并且在BMPs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有重要作用[6]。因此我們推測，miR-214可能通過靶向調(diào)控Smad4和BMP2對骨質(zhì)疏松產(chǎn)生一定的影響，為了驗證我們的推測，我們進行了以下實驗。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠。雌性，2～3月齡，體重200±20 g，購于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物許可證號SCXK(粵)2018-0085，實驗動物合格證號：44002100012977。環(huán)境：2只/籠，溫度：20±2 ℃，空氣濕度：50 %～60 %，12 h明暗交替光照，飼料由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，大鼠自由飲水和進食。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM(L)培養(yǎng)液(上海恒斐生物科技有限公司 貨號：31600)，BMP-2抗體、SMAD4抗體、GAPDH抗體(美國 BIOYK 貨號：YKA-AP51012、YKA-AP51526、YKA-AP50864)，SYBR qPCR試劑盒(RT-PCR兩步法試劑盒)EzOmicsTM SYBR qPCR Kit(百奧邁科生物技術(shù)有限公司 貨號：BK2200-2203)，Lipofectamine 2000(美國 Invitrogen 貨號：11668019)，miR-214 mimics(miR-214模擬物)及anti-miR-214(miR-214抑制劑)由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司合成，ROS1728/大鼠成骨細胞購于廣州弗爾博生物科技有限公司(貨號：FB624)，F(xiàn)ACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)，MK3酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)。

1.3 模型制備

參照張春麗等[7]建模方法建立大鼠骨質(zhì)疏松模型。在大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠隨機分為2組，每組10只，分為假手術(shù)和雙側(cè)卵巢結(jié)扎摘除術(shù)(手術(shù))組。2組大鼠使用1 %戊巴比妥鈉(4 mL/kg)麻醉后，對大鼠進行背側(cè)切口，位于腋中線、最末肋下、距脊柱外側(cè)2 cm左右處，使用碘伏進行切口及周邊消毒，逐層切開脂肪肌肉組織，分離脂肪團，能夠看到粉紅或黃紅色的卵巢器官，手術(shù)組結(jié)扎輸卵管并進行卵巢摘除，最后縫合肌肉、皮膚，再次使用碘伏進行消毒，術(shù)后給予青霉素肌肉注射預(yù)防感染。同法摘除另一卵巢。假手術(shù)僅切除卵巢旁邊相同大小脂肪組織。術(shù)后定量喂食，自由飲水。在術(shù)后第8周，處死大鼠，各組大鼠取靜脈血分離血清，用BK-800全自動生化分析儀進行檢測，采用上海紀(jì)寧實業(yè)有限公司提供的Ca2+、P、ALP試劑盒測定血清骨代謝指標(biāo)：血清中鈣離子、磷及堿性磷酸酶(ALP)水平；血Ca2+、P、ALP水平可作為臨床上的骨質(zhì)疏松癥有效監(jiān)測指標(biāo)，既可觀測絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防、嚴(yán)重程度、預(yù)后以及觀察療效血清骨代謝指標(biāo)。取大鼠雙側(cè)股骨進行病理切片觀察股骨組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，分離并檢測脛骨骨密度(BMD)。

1.4 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)培養(yǎng)

在術(shù)后處死各組大鼠后，在無菌條件下分離出雙側(cè)股骨、脛骨，去除附著于骨表面的軟組織，浸泡于L-DMEM培養(yǎng)液中。剪切除兩端骨骺，顯露骨髓腔，L-DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，以沖出骨髓，直至骨髓腔變白后停止。收集骨髓懸液于離心管中，1 000 r/min室溫下離心3～5 min；去上清，用含10 %胎牛血清的L-DMEM完全培養(yǎng)液重懸細胞，制成單細胞懸液，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。約3 h后首次換液，以后每48 h換液1次，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)與生長情況。待細胞密度達到80 %～90 %時，進行傳代，吸去培養(yǎng)液，以預(yù)熱的PBS輕輕沖洗后，去掉PBS。加入適量胰蛋白酶消化后，于培養(yǎng)箱中溫育1～2 min，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，待細胞之間突起消失、變圓后，加入含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，用吸管反復(fù)吹打3～5次后轉(zhuǎn)移至離心管，1 000 r/min室溫下離心5 min，棄上清，用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，用吸管吹打成細胞懸液3～5次，接種于新的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5 %的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每48 h換液1次，此時細胞初代細胞。細胞傳代至第3代時，取各組 BMSCs細胞，將細胞濃度調(diào)整為1×105個/mL，將細胞接種至96孔板，每孔100 μL細胞懸液、每組設(shè)置6個復(fù)孔。在接種后，每48 h換液一次，并在第 0、2、4、6 天使用CCK8法檢測各組細胞在450 nm波長處的吸光度值，同時檢測細胞的增殖能力。在接種培養(yǎng)后第4天時，取部分細胞移除培養(yǎng)基，裂解細胞后通過全自動生化分析儀測定每組細胞的 ALP 水平。

1.5 qPCR檢測各組大鼠BMSCs中miR-214表達情況

將第3代各組BMSCs使用Trizol法提取總RNA，并檢測總RNA的純度，再以400 ng的RNA為模板使用SYBR qPCR試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將反轉(zhuǎn)錄的cDNA樣品適當(dāng)比例稀釋后，進行熒光定量PCR，按照qPCR擴增反應(yīng)試劑盒進行操作。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR RT-PCR Master Mix 10 μL，Plus solution 2 μL，H2O 6 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，共循環(huán)40次。以GAPDH作為內(nèi)參，擴增結(jié)果用2-ΔΔCq法進行分析。擴增相關(guān)引物見表1。

表1 擴增相關(guān)引物Table 1 Amplification related primers

1.6 Western blot檢測各組大鼠BMSCs中BMP-2、Smad4表達情況

收集第3代各組大鼠BMSCs，提取細胞總蛋白，用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。定量好的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫封閉2 h，加入Smad4、BPM-2和GAPDH一抗(1∶1000)，4 ℃孵育過夜。TBST重復(fù)洗膜3次，加入二抗(1∶1000)，室溫孵育1 h。TBST洗膜后，ECL發(fā)光液曝光顯影，凝膠圖像分析系統(tǒng)采集圖像，Image J2x軟件分析條帶的灰度值，實驗重復(fù) 3 次后進行統(tǒng)計分析。

1.7 ROS1728/大鼠成骨細胞的轉(zhuǎn)染與檢測

將ROS1728/大鼠成骨細胞分為3組，對照組、過表達組和抑制組。采用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染法將miR-214 mimics(miR-214模擬物)及anti-miR-214(miR-214抑制劑)分別轉(zhuǎn)入表達組和抑制組，轉(zhuǎn)染48 h后，提取總RNA檢測轉(zhuǎn)染是否成功。在檢測轉(zhuǎn)染成功后將細胞計數(shù)并接種于96孔板中，之后每48 h使用CCK8法檢測細胞增殖能力，同時檢測使用流式細胞儀檢測細胞凋亡程度。使用1.5，1.6的方法提取細胞總RNA和總蛋白，檢測相關(guān)RNA及蛋白表達水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中鈣離子、磷、ALP水平及骨密度情況

檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，手術(shù)組大鼠血鈣、ALP水平及BMD明顯下降，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時手術(shù)組大鼠與假手術(shù)組相比血磷水平明顯上升，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 提示造模成功。見表2。

表2 各組大鼠血清中鈣離子、磷、ALP濃度及骨密度情況Table 2 Serum calcium ion, phosphorus, ALP concentration and bone mineral density of rats in each group

2.2 大鼠股骨病理切片

從大鼠股骨病理切片可以看出，假手術(shù)組股骨近段骺板軟骨細胞呈柱狀，同時增值層、靜止層級肥大層軟骨細胞分界清晰，與假手術(shù)組相比，手術(shù)組股骨近段骺板軟骨層變狹窄，軟骨細胞數(shù)量明顯減少且排列無規(guī)則。見圖1。

注：A 假手術(shù)組；B 手術(shù)組；40×。圖1 兩組大鼠股骨病理切片F(xiàn)ig.1 Pathological sections of femurs of two groups of rats

2.3 大鼠BMSCs相關(guān)檢測結(jié)果

對體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs進行檢測發(fā)現(xiàn)，兩組大鼠的BMSCs增長速率相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。同時對BMSCs中ALP水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組大鼠ALP水平顯著高于手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。與假手術(shù)組(0.98±0.21)相比較，手術(shù)組(3.36±1.17)miR-214表達量明顯上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時假手術(shù)組大鼠BMSCs中BMP-2及Smad4表達水平都高于手術(shù)組，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4、表3。

表3 各組大鼠BMSCs中Smad4和BMP2相關(guān)蛋白表達灰度值比較

圖2 大鼠BMSCs體外培養(yǎng)細胞增殖能力檢測結(jié)果Fig.2 Test results of cell proliferation ability of rat BMSCs cultured in vitro

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05。圖3 大鼠BMSCs中ALP水平檢測結(jié)果Fig.3 The detection results of ALP concentration in rat BMSCs

圖4 各組大鼠BMSCs中Smad4和BMP-2相關(guān)蛋白表達情況Fig.4 The expression of Smad4 and BMP-2 related proteins in BMSCs of rats in each group

2.4 ROS1728/大鼠成骨細胞細胞轉(zhuǎn)染效率

在對轉(zhuǎn)染后的ROS1728/大鼠成骨細胞中miR-214進行檢測后，結(jié)果顯示，對照組(0.82±0.14)及過表達組(4.46±1.29)均有miR-214表達，抑制組(0.126±0.028)中miR-214表達顯著降低，同時過表達組miR-214表達水平顯著高于對照組，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，轉(zhuǎn)染率大于95 %，說明RNA轉(zhuǎn)染成功。

2.5 ROS1728/大鼠成骨細胞增殖能力和細胞凋亡程度檢測結(jié)果

通過對體外培養(yǎng)的ROS1728/大鼠成骨細胞增殖能力進行檢測后發(fā)現(xiàn)，在4 d后，過表達組與對照組相比，細胞增殖能力明顯下降，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時抑制組細胞增殖情況在8 d后顯著高于對照組及過表達組，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。使用流式細胞儀對ROS1728/大鼠成骨細胞的細胞凋亡情況進行檢測后發(fā)現(xiàn)，過表達組細胞凋亡情況顯著高于對照組和抑制組，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時過表達組與對照組相比較，過表達組細胞凋亡程度低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

注：與對照組比較，*P<0.05；與過表達組比較，#P<0.05。圖5 ROS1728/大鼠成骨細胞增殖情況Fig.5 Proliferation of ROS1728/rat osteoblasts

圖6 ROS1728/大鼠成骨細胞細胞凋亡情況Fig.6 Apoptosis of ROS1728/rat osteoblasts

2.6 ROS1728/大鼠成骨細胞相關(guān)蛋白表達情況

ROS1728/大鼠成骨細胞各組，對照組和抑制組BMP-2及Smad4表達水平均高于過表達組，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對照組與抑制組相比較，抑制組中BMP-2及Smad4表達水平高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖7、表4。

圖7 各組大鼠成骨細胞中Smad4和BMP-2相關(guān)蛋白表達情況Fig.7 The expression of Smad4 and BMP-2 related proteins in rat osteoblasts in each group

表4 各組大鼠成骨細胞中Smad4和BMP-2相關(guān)蛋白表達灰度值比較

3 討論

成骨細胞由間質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)分化而來，成骨細胞經(jīng)過增殖、分化、成熟和礦化等階段逐漸凋亡或成為骨細胞(osteocyte)、骨襯細胞(bone lining cell)。成骨細胞的分化在不同的階段受到不同的調(diào)節(jié)因子的調(diào)控，并表達不同的產(chǎn)物。成骨細胞直接參與骨的形成，在生物體中起至關(guān)重要的作用[7]。有大量的實驗[8-10]證實，miRNA參與骨代謝的各個過程，miRNA能夠與其靶基因進行特異性結(jié)合，控制下游的蛋白翻譯或者剪切降解特定的mRNA序列從而調(diào)控靶基因的后續(xù)表達。miRNA能夠靶向?qū)俏找蜃印⒊晒且蜃蛹捌渌蜃舆M行調(diào)控，參加BMSCs、OB、破骨細胞(osteoclast，OC)的增殖和分化過程，對骨代謝過程進行調(diào)控。

近年來，miR-214發(fā)現(xiàn)在骨代謝過程中起關(guān)鍵作用。有研究[11]發(fā)現(xiàn)，miR-214能通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子(activating transcription factor 4，ATF4)抑制其蛋白的表達進而抑制骨的生成，同時miR-214能靶向作用于Osterix，使骨分化過程被抑制[4]。在BMSCs分化為成骨細胞及胞外基質(zhì)過程中，BMP-2/Smad信號通路發(fā)揮了極其重要的作用。Smad家族是TGF-β信號介導(dǎo)成員之一，能將TGF-β信號從細胞膜轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞核內(nèi)。Smads被磷酸化后，與通常介導(dǎo)分子Smad4相互作用形成三聚體，轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)進而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄[12]。實驗表明，BMPs在OB分化過程中至關(guān)重要，BMPs通過抑制BMSCs分化成為肌肉細胞和脂肪細胞，達到促進成骨細胞分化和骨形成的結(jié)果[13]。BMP-2是公認(rèn)的成骨細胞轉(zhuǎn)化促進因子，BMP-2與細胞膜上的受體結(jié)合后激活細胞內(nèi)相關(guān)因子磷酸化，與Smad4相結(jié)合由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細胞核。在本研究中，與手術(shù)組相比較，假手術(shù)組BMSCs細胞中miR-214表達明顯上升；同時假手術(shù)組大鼠BMSCs中BMP-2及Smad4表達水平都高于手術(shù)組。這一結(jié)果提示，在BMSCs向成骨細胞分化過程，過表達的miR-214會抑制骨分化過程，反之能促進骨分化過程的進行，與此前研究[14]相符。有學(xué)者[15]通過運用miR-214激活劑和拮抗劑轉(zhuǎn)染小鼠成骨細胞系MC3T3-E1，研究表明，高表達miR-214組與空白對照組、拮抗miR-214組相比能夠一定程度降低骨鈣素和ALP水平的同時下調(diào)相應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度，降低ALP的染色效果，并阻止鈣化結(jié)節(jié)生成，而且發(fā)現(xiàn)此抑制效應(yīng)會持續(xù)地存在于成骨細胞基質(zhì)礦化過程當(dāng)中。本研究中，通過對大鼠成骨細胞轉(zhuǎn)染miR-214 mimics及anti-miR-214后，過表達組較對照組細胞增殖能力顯著降低、細胞凋亡數(shù)量明顯上調(diào)，同時抑制組細胞增殖情況在8 d后顯著高于對照組及過表達組，也佐證了此前研究結(jié)果。對大鼠成骨細胞中BMP-2和Smad4相關(guān)蛋白檢測后發(fā)現(xiàn)，對照組和抑制組BMP-2及Smad4表達水平均高于過表達組，對照組與抑制組相比較，抑制組中BMP-2及Smad4表達水平高于對照組。

綜上所述，miR-214能靶向抑制BMP-2與Smad4進而抑制成骨細胞的增殖，從而發(fā)生或發(fā)展成骨質(zhì)疏松癥。骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機制復(fù)雜，本研究為miR-214對骨代謝影響的進一步研究提高了一定參考依據(jù)。