劉洋 孫權(quán) 楊砥 秧榮昆 徐遠坤

貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550002

中醫(yī)認為骨性關(guān)節(jié)炎屬于痹癥與痿證，肝腎虧虛、長期勞損與外感風(fēng)寒濕邪為其主要病機。右歸丸出自《景岳全書》，主要成分有熟地黃、附子(炮附片)、肉桂、山藥、山茱萸(酒炙)、菟絲子、鹿角膠、枸杞子、當(dāng)歸、杜仲(鹽炒)，具有溫陽補腎、填精補髓之功效。研究證實，右歸丸對骨性關(guān)節(jié)炎具有治療作用，可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性和炎癥因子表達來抑制軟骨退變[1]，但其對骨性關(guān)節(jié)炎的作用機理仍需要探討。

國內(nèi)外的研究主要從細胞因子、免疫反應(yīng)及基質(zhì)金屬蛋白酶等幾方面探討骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制，但尚未形成統(tǒng)一的觀點[2-4]。近年來，人們將研究的重點集中到對軟骨生物學(xué)標(biāo)志物的研究，同時與其相關(guān)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也成為探討骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制的重要手段。目前的研究證實 Smad 轉(zhuǎn)導(dǎo)的 TGF-β家族信號可以通過多種機制對軟骨細胞的增殖、分化和成熟進行精密調(diào)控[5-6]。本研究采用經(jīng)典的Hulth法建立膝骨性關(guān)節(jié)炎模型，并給予右歸丸灌胃干預(yù)，進一步探討右歸丸對骨性關(guān)節(jié)炎軟骨的保護作用及可能的作用機理。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

右歸丸購自北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠(國藥準(zhǔn)字Z11021040，批號11030027)，由熟地黃 24 g、山藥 12 g、山茱萸 9 g、枸杞子 9 g、鹿角膠 12 g、菟絲子 12 g、杜仲 12 g、當(dāng)歸9 g、肉桂 6 g、制附子 6 g 等組成。換算成大鼠用量為：111 g ×0.018×5≈10 g/kg，以此為中劑量，預(yù)實驗比較了5、10、20 g/ kg的治療效果，其中20 g/kg治療效果最好，所以實驗選擇了此濃度進行實驗；TGF-β/Smad通路抑制劑(SB431542，批號：SF7890，碧云天生物技術(shù)有限公司)；腫瘤壞死因子α ELISA檢測試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，批號：ARB13479)；白細胞介素1β ELISA檢測試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司，批號：SBJ-R0024)；兔抗鼠COL-Ⅱ多克隆抗體(武漢云克隆科技股份有限公司，批號：PAA572Rb51)；兔抗鼠MMP-13多克隆抗體( 上海生工生物工程股份有限公司，批號：D120098-0025)；兔抗鼠TGF-β1(武漢菲恩生物科技有限公司，批號：FNab08638)；兔抗鼠Smad2(武漢菲恩生物科技有限公司，批號：FNab07993)；(武漢益普生物科技有限公司，批號：ATA37717)；兔抗鼠p-Smad2(上海信裕生物科技有限公司，批號：IC195026)；兔抗鼠p-Smad3(上海鈺博生物科技有限公司，批號：IC187103)。

1.2 實驗動物

成年SD大鼠64只，由貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證證號：SCXK(黔)2018-0001，雌雄各半，體重200～230 g，SPF級，單籠飼養(yǎng)，自由進食水，自然光線照射，相對濕度為50 %～60 %，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(23±2) ℃，飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心實驗動物中心。

1.3 動物分組與處理

將64只SD大鼠利用隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、右歸丸組、抑制劑組，每組15只。正常組不做任何處理，模型組、右歸丸組、抑制劑組采用經(jīng)典的Hulth法[7]建立膝骨性關(guān)節(jié)炎模型。術(shù)后6周制作右膝關(guān)節(jié)軟骨病理切片證實造模成功。造模6周后，右歸丸組灌服20 g/kg的右歸丸(右歸丸常規(guī)水煎制成2 g/mL的藥液，灌服體積為10 mL/kg)[8]；抑制劑組腹腔注射1.2 mg/kg的SB431542[9]，同時灌服20 g/kg的右歸丸；模型組灌服等劑量的生理鹽水；3組每天給藥1次，連續(xù)給藥8周。

1.4 軟骨組織病理形態(tài)觀察

末次給藥24 h后麻醉大鼠，取右膝關(guān)節(jié)軟骨組織，其中一部分置于-80 ℃環(huán)境中保存，另一部分置于體積分數(shù)10 %甲醛中固定。固定24 h后取出關(guān)節(jié)軟骨組織，脫鈣處理后依次進行水合、透明、石蠟包埋處理，切片，切片厚度約5 μm，常規(guī)HE染色。同時番紅O染色后進行Mankin 評分，評分低說明關(guān)節(jié)軟骨損傷程度低。

1.5 ELISA法檢測軟骨組織中炎癥因子水平

取出-80 ℃保存的軟骨組織，在1 mg軟骨組織中添加9 mg/L的生理鹽水，置于勻漿器內(nèi)制備勻漿液，5 000g離心10 min后收集上清液，利用ELISA檢測試劑盒檢測腫瘤壞死因子α與白細胞介素1β水平。

1.6 免疫組化染色

將切片置于枸櫞酸緩沖液盒中進行微波修復(fù)2 min，加入3 %過氧化氫溶液室溫孵育半小時，加入5 %山羊血清封閉抗原半小時，采用免疫組化染色觀察軟骨組織中Ⅱ型膠原蛋白與基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)陽性表達。

1.7 RT-PCR檢測

采用RT-PCR法檢測軟骨組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達。將50 mg冷凍的軟骨組織置于液氮中研磨成粉末，制成勻漿液；加入氯仿后混勻，4 ℃ 12 000g離心10 min；按照 RNeasy? Lipid Tissue Mini Kit 試劑盒說明書操作提取總RNA。取各組樣品總RNA 1 μL，利用核酸蛋白分析儀檢測總RNA水平。PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser說明書操作進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將合成的cDNA進行RT-PCR反應(yīng)，引物序列見表1。

表1 RT-PCR反應(yīng)引物序列Table 1 Primer sequence of RT-PCR

1.8 Western blot檢測

取軟骨組織，將50 mg軟骨組織放入研磨皿中裂解，將勻漿組織液12 000g離心3 min，取上清，95 ℃煮沸10 min變性，-20 ℃保存。采用BCA法檢測蛋白濃度。取20 μL蛋白樣品，加入5 μL的6×蛋白上樣緩沖液混勻，加熱5 min后冷卻；按預(yù)定的順序上樣、恒壓電泳，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂牛奶封閉1 h，加入稀釋的一抗(兔抗鼠TGF-β1、未磷酸化Smad2、未磷酸化Smad3、p-Smad2、p-Smad3，稀釋度分別為1∶1 000、1∶10 000、1∶5 000、1∶10 000、1∶5 000)4 ℃孵育過夜；加入二抗羊抗兔IgG(稀釋度分別為1∶2 000)室溫孵育1 h，以β-actin為內(nèi)參；ECL顯影、曝光。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

利用SPSS 22.0 軟件對所有實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較差異采用t或t’檢驗。實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模動物一般情況

實驗期間造模動物無死亡。造模后，大鼠飲食、精神狀態(tài)及活動情況較差，膝關(guān)節(jié)腫脹。

2.2 軟骨組織病理形態(tài)觀察

HE染色顯示，正常組軟骨組織表層細胞較小呈梭形，排列密集，中間層可見呈圓形或橢圓形的細胞，排列不規(guī)律，潮線清晰完整；模型組軟骨表面不規(guī)則，大部分軟骨表層細胞消失，軟骨細胞數(shù)量顯著減少，潮線紊亂甚至消失。抑制劑組與右歸丸組軟骨細胞形態(tài)與數(shù)量較模型組均有不同程度的改善，其中右歸丸組軟骨細胞大致趨于正常，潮線較完整。各組具體HE染色結(jié)果見圖1。

注：a、b 正常組；c、d 模型組；e、f 抑制劑組；g、h 右歸丸組。圖1 軟骨組織形態(tài)學(xué)觀察(200×，n=15)Fig.1 Histological Observation of cartilage(200×，n=15)

番紅-O染色顯示，正常組潮線清晰完整；模型組潮線破壞較嚴重，不完整；抑制劑組潮線欠完整；右歸丸組潮線較清晰且較完整。各組番紅-O染色結(jié)果見圖1。Mankin 評分評估結(jié)果顯示，模型組評分明顯高于正常組(P<0.05)，抑制劑組、右歸丸組低于模型組(P<0.05)，右歸丸組低于抑制劑組(P<0.05)，見表2。

2.3 軟骨組織中炎癥因子濃度

與正常組比較，模型組軟骨組織中腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，抑制劑組、右歸丸組腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β水平顯著降低(P<0.05)；與抑制劑組比較，右歸丸組腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β水平顯著降低(P<0.05)，具體結(jié)果見表2。

表2 軟骨組織Mankin 評分與炎癥因子濃度(n=15)

2.4 免疫組化染色

正常組軟骨組織中Ⅱ型膠原蛋白陽性染色廣泛分布、著色深，MMP-13陽性染色較少、著色淺；模型組軟骨組織中Ⅱ型膠原蛋白陽性染色顯著減少、著色淺，MMP-13陽性染色廣泛分布、著色深；抑制劑組、右歸丸組Ⅱ型膠原蛋白陽性染色較模型組廣泛、著色深，MMP-13陽性染色明顯減少、著色變淺，見圖2與圖3。

圖2 軟骨組織內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白陽性表達(免疫組化，400×，n=15)Fig.2 Positive expression of type II collagen in cartilage (immunohistochemistry, 400×，n=15)

圖3 軟骨組織內(nèi)MMP-13陽性表達(免疫組化，400×，n=15)Fig.3 MMP-13 positive expression in cartilage tissue (immunohistochemistry, 400×，n=15)

模型組Ⅱ型膠原蛋白累積光密度值低于正常組，而MMP-13累積光密度值高于正常組(P<0.05)；抑制劑組Ⅱ型膠原蛋白累積光密度值高于模型組，MMP-13累積光密度值低于模型組(P<0.05)；右歸丸組Ⅱ型膠原蛋白累積光密度值高于抑制劑組，MMP-13累積光密度值低于抑制劑組(P<0.05)，具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 軟骨組織Ⅱ型膠原蛋白與MMP-13累積光密度值(n=15)

2.5 RT-PCR檢測

模型組TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達較正常組顯著降低(P<0.05)，抑制劑組TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 mRNA表達高于模型組(P<0.05)，右歸丸組TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達高于抑制劑組(P<0.05)，具體數(shù)據(jù)見表4。

表4 軟骨組織內(nèi)TGF-β1、Smad2、Smad3表達(n=15)Table 4 The expression of TGF - β 1, Smad2 and p-Smad3 in cartilage tissue(n=15)

2.6 Western blot檢測

Western blot檢測結(jié)果顯示，4組間未磷酸化Smad2、Smad3蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義；模型組TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 蛋白表達較正常組顯著降低(P<0.05)，抑制劑組TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 蛋白表達高于模型組(P<0.05)，右歸丸組TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白表達高于抑制劑組(P<0.05)，具體數(shù)據(jù)見表4。4組未磷酸化Smad2、未磷酸化Smad3、TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白條帶見圖4。

圖4 軟骨組織內(nèi)TGF-β1/Smads信號通路蛋白表達條帶(n=15)Fig.4 The Expression of TGF - β1 / Smads signaling pathway protein in cartilage(n=15)

3 討論

本研究采用經(jīng)典的Hulth法建立膝骨性關(guān)節(jié)炎模型，該方法主要通過手術(shù)破壞關(guān)節(jié)力學(xué)穩(wěn)定性，進而導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎，發(fā)病機制與臨床類似。本實驗結(jié)果顯示，造模后大鼠的軟骨退變評分明顯升高，病理組織形態(tài)學(xué)顯示軟骨表面不規(guī)則，結(jié)構(gòu)紊亂，軟骨細胞數(shù)量明顯減少，潮線消失，Mankin 評分明顯升高，與以往研究中骨性關(guān)節(jié)炎動物模型病理改變相似[10-11]，證實本實驗造模成功。

《內(nèi)經(jīng)》中記載“腎主骨、肝主筋”, 依據(jù)這一中醫(yī)理論, 認為骨性關(guān)節(jié)炎的主要病機特點是“肝腎虧虛為本，氣滯、血瘀、痰濕凝聚為標(biāo)”，中醫(yī)宜采用“補肝腎、強筋骨、活血、祛瘀、止痛” 等中藥治療骨性關(guān)節(jié)炎。右歸丸作為一種補腎方藥含有多種有效成分，多藥共同作用可溫腎陽而兼顧陰陽，滋補肝脾腎，用于多種疾病的治療。該方中附子、肉桂、鹿角膠培補腎中元陽里祛寒，為君藥；熟地黃、山茱萸、枸杞子、山藥滋陰益腎，養(yǎng)肝補脾，填精補髓，取“陰中求陽” 之義，為臣藥；再用菟絲子、杜仲補肝腎，強腰膝，配以當(dāng)歸養(yǎng)血和血，共補肝腎精血，為佐藥。諸藥合用，以溫腎陽為主而陰陽兼顧，肝脾腎并補，妙在陰中求陽，使元陽得以歸原。研究證實，補腎中藥可減緩大鼠膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的退變，起到保護膝關(guān)節(jié)的作用[12-13]。本研究結(jié)果表明，相較于模型組，右歸丸組關(guān)節(jié)軟骨退變Mankin 評分顯著降低，軟骨組織病理形態(tài)明顯改善，證實右歸丸可抑制軟骨退變，減輕軟骨損傷，具有治療作用。

多型膠原、關(guān)節(jié)液與細胞外基質(zhì)共同組成了關(guān)節(jié)軟骨細胞微環(huán)境，其中Ⅱ型膠原蛋白是其中含量最高的膠原之一，生理狀態(tài)下的軟骨細胞主要分泌Ⅱ型膠原蛋白，但當(dāng)軟骨受損會影響細胞微環(huán)境，導(dǎo)致Ⅱ型膠原蛋白含量增加，進而破壞軟骨結(jié)構(gòu)[14]。另外，促炎癥因子活化后加重炎癥反應(yīng)，通過降低軟骨組織內(nèi)的Ⅱ型膠原蛋白含量而誘導(dǎo)基質(zhì)中的基質(zhì)金屬蛋白酶13釋放，進一步降解Ⅱ型膠原蛋白。本研究結(jié)果顯示，右歸丸可減輕軟骨組織內(nèi)的炎癥反應(yīng)，平衡細胞外基質(zhì)膠原表達，保護關(guān)節(jié)軟骨組織。

TGF-β1在關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育中具有重要的作用。正常情況下，內(nèi)環(huán)境中的TGF-β1通過與細胞表面的特異性受體結(jié)合來引發(fā)下游Smad家族的活化，引發(fā)一系列的信號傳遞，或者是與一些轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合體，活化或抑制特定基因的表達。TGF-β1信號通路可以調(diào)控正常細胞的周期，調(diào)節(jié)其生長、增殖與分化等，并促進衰老細胞凋亡，維持機體正常狀態(tài)。TGF-β1可促進軟骨細胞中Ⅱ型膠原蛋白與蛋白聚糖的合成與分泌，提示TGF-β1在關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[15]，對骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨發(fā)揮保護作用。此外，也有一些研究者認為TGF-β1可誘發(fā)骨性關(guān)節(jié)炎[16]。所以，對于TGF-β1在骨性關(guān)節(jié)炎中的作用及其相關(guān)的信號通路仍有待更深入的探討與研究。本研究結(jié)果顯示，右歸丸可能通過激活TGF-β1/Smads信號通路來發(fā)揮關(guān)節(jié)軟骨保護作用的。為了進一步驗證實驗推測，本實驗采用TGF-β1/Smads信號通路抑制劑對右歸丸干預(yù)骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠進行處理，結(jié)果顯示：軟骨形態(tài)損傷加重，軟骨組織病理評分升高，軟骨組中的炎癥因子腫瘤壞死因子α與白細胞介素1β水平升高，基質(zhì)金屬蛋白酶13陽性表達增加，Ⅱ型膠原蛋白陽性表達減少，提示右歸丸可能通過激活TGF-β1/Smads信號通路延緩骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨退變，減輕軟骨炎癥反應(yīng)，維持軟骨細胞外基質(zhì)平衡，進而發(fā)揮軟骨保護作用。遺憾的是本研究未設(shè)置骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠單獨TGF-β1/Smads信號通路抑制劑干預(yù)組，因此對于TGF-β1/Smads信號通路在骨性關(guān)節(jié)炎中作用機制仍需進一步明確。

綜上，右歸丸可減輕軟骨組織內(nèi)的炎癥反應(yīng)，平衡細胞外基質(zhì)膠原表達，保護關(guān)節(jié)軟骨組織，其作用機制可能與TGF-β1/Smads信號通路有關(guān)。