商海濱 廉由之 郭海玲 楊光月 鄧真 艾有利 陳蓓 李國(guó)中 趙詠芳*

1.上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院寶山分院，上海 201999 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院石氏傷科醫(yī)學(xué)中心，上海 201203 3.上海市中醫(yī)藥研究院骨傷科研究所，上海 201203

世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)提出“健康老齡化”的概念，不僅要求壽命延長(zhǎng)，更要求壽命質(zhì)量的提高。肌少癥(sarcopenia)可導(dǎo)致肌肉量及肌肉強(qiáng)度下降，骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)可引起骨量及骨骼功能的下降，嚴(yán)重影響了老年人的生活質(zhì)量。由于目前對(duì)于肌少癥的相關(guān)研究仍處于初步階段。若探尋到骨質(zhì)疏松癥與肌少癥的共同發(fā)病機(jī)制，那對(duì)于骨質(zhì)疏松癥與肌少癥的治療將起到事半功倍的效果。鑒于骨質(zhì)疏松癥與肌少癥均為多基因通路調(diào)控，涉及多器官、多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)的全身代謝性疾病。利用分子生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)多組基因數(shù)據(jù)整合分析，探討骨質(zhì)疏松癥并發(fā)肌少癥的發(fā)病機(jī)制具有極為重要的現(xiàn)實(shí)意義，這將為同時(shí)治療兩種疾病的藥物的精確研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件

CTD數(shù)據(jù)庫(kù)[1]、Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)[2](2020年V7.0版)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)[3]、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)[4]、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)[5]、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)[6]、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)[7]，STRING網(wǎng)站[8]，Perl軟件、R語(yǔ)言軟件，UniProt知識(shí)庫(kù)，Cytoscape 3.7.2軟件[9]。

1.2 方法

分別以“Osteoporosis”、“Sarcopenia”為關(guān)鍵詞，檢索目前公認(rèn)的主要的疾病數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)獲得骨質(zhì)疏松癥與肌少癥相關(guān)靶點(diǎn)，其中包括CTD、Disgenet、TTD、OMIM、GeneCards、Drugbank、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)。分別獲得影響該疾病的靶點(diǎn)基因。隨后，將所獲得靶點(diǎn)分別進(jìn)行匯總、篩選、去重后即得到該疾病的靶點(diǎn)基因。利用R語(yǔ)言軟件將Osteoporosis靶點(diǎn)基因與Sarcopenia靶點(diǎn)基因取交集，得到Osteoporosis-Sarcopenia共同靶點(diǎn)基因，利用STRING網(wǎng)站對(duì)Osteoporosis-Sarcopenia共同靶點(diǎn)基因進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，并進(jìn)行基因GO富集分析和KEGG通路分析。

2 結(jié)果

2.1 基因篩選結(jié)果

CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中骨質(zhì)疏松癥和肌少癥相關(guān)基因分別為807和113個(gè)；Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)中1 098和164個(gè)；TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中24和0個(gè)；OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中69和4個(gè)；GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中346和200個(gè)；Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)中24和0個(gè)；KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中13和0個(gè)。匯總數(shù)據(jù)、刪除重復(fù)基因，最終得到骨質(zhì)疏松癥相關(guān)基因1 782個(gè)，肌少癥相關(guān)基因429個(gè)。

2.2 兩種疾病靶點(diǎn)的交集分析

利用R語(yǔ)言軟件將Osteoporosis靶點(diǎn)基因與Sarcopenia靶點(diǎn)基因取交集，得到Osteoporosis-Sarcopenia共同靶點(diǎn)基因共計(jì)171個(gè)，形成兩種疾病靶點(diǎn)基因的韋恩圖(見(jiàn)圖1) 。其中，骨質(zhì)疏松癥與肌少癥的共同靶點(diǎn)基因，見(jiàn)表1。

表1 骨質(zhì)疏松癥與肌少癥的共同靶點(diǎn)基因列表Table 1 The list of the common target genes of osteoporosis and sarcopenia

圖1 骨質(zhì)疏松癥與肌少癥的共同靶點(diǎn)基因的韋恩圖Fig.1 Venny diagram of the common target genes of osteoporosis and sarcopenia

2.3 靶點(diǎn)基因/蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

利用STRING網(wǎng)站對(duì)Osteoporosis-Sarcopenia共同靶點(diǎn)基因進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，其中，置信度設(shè)置為0.90，隱藏獨(dú)立靶點(diǎn)，形成了蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析的(詳見(jiàn)圖2)PPI分析圖(左)并利用R語(yǔ)言軟件計(jì)算得到barplot圖(右)。由于靶基因之間的節(jié)點(diǎn)數(shù)目反映該基因在此過(guò)程中發(fā)揮作用的強(qiáng)弱，AKT1、PI3K在骨質(zhì)疏松癥和肌少癥發(fā)病過(guò)程中可能發(fā)揮了重要作用。

2.4 GO分析與Pathway富集分析

本研究采用了cluego插件，對(duì)骨質(zhì)疏松癥與肌少癥以及共同靶點(diǎn)基因中的關(guān)鍵靶點(diǎn)及信號(hào)通路進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析。其中，節(jié)點(diǎn)的大小代表了該信號(hào)通路的顯著性，信號(hào)通路的顯著性越高，節(jié)點(diǎn)越大，說(shuō)明該通路的重要性越高。其中，骨質(zhì)疏松癥GO分子功能富集分析見(jiàn)表2左側(cè)，肌少癥GO分子功能富集分析見(jiàn)表2右側(cè)，共同靶點(diǎn)基因GO分析結(jié)果見(jiàn)圖3。在KEGG通路富集分析過(guò)程中，其中，骨質(zhì)疏松癥KEGG通路富集分析見(jiàn)表3左側(cè)，肌少癥KEGG通路富集分析見(jiàn)表3右側(cè)，共同靶點(diǎn)基因KEGG通路富集分析結(jié)果見(jiàn)圖4。

注：左 PPI分析圖；右 barplot圖圖2 骨質(zhì)疏松與肌少癥共同靶點(diǎn)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析的Fig.2 The PPI plot (left) and bar plot (right) of protein interaction network analysis of the common target genes of osteoporosis and sarcopenia

表2 骨質(zhì)疏松癥與肌少癥各自GO分子功能富集分析結(jié)果表Table 2 Results of GO enrichment analysis of osteoporosis and sarcopenia

續(xù)表2

圖3 骨質(zhì)疏松癥與肌少癥共同靶點(diǎn)GO分析結(jié)果圖Fig.3 Results of GO analysis of the common targets of osteoporosis and sarcopenia

表3 骨質(zhì)疏松癥與肌少癥各自靶點(diǎn)KEGG通路富集分析結(jié)果列表Table 3 The list of KEGG pathway analysis results of the common targets of osteoporosis and sarcopenia

圖4 骨質(zhì)疏松癥與肌少癥共同靶點(diǎn)KEGG通路富集分析結(jié)果Fig.4 Enrichment analysis results of KEGG pathway of the common target of osteoporosis and sarcopenia

3 討論

2019年亞洲肌少癥工作組(Asian Working Group for Sarcopenia, AWGS)最新共識(shí)[10]指出，亞洲老年肌少癥的患病率在5.5 %至25.7 %之間，而中國(guó)療養(yǎng)院中老年肌少癥患病率在31.4 %以上[11]。骨質(zhì)疏松癥和肌少癥均為增齡性疾病，2013年，Binkley[12]提出將肌少癥伴有骨質(zhì)疏松癥作為一種疾病——“活動(dòng)障礙綜合征”(dysmobility syndrome)。本病可導(dǎo)致老年人機(jī)體平衡能力下降，易跌倒發(fā)生脆性骨折，最終導(dǎo)致老年人的生活質(zhì)量降低[13]。2018年中國(guó)與歐洲在骨質(zhì)疏松與肌少癥的診斷、治療方面進(jìn)行了相互交流[14]，但尚未有明確結(jié)果。本研究基于生物信息學(xué)以及現(xiàn)代大數(shù)據(jù)信息技術(shù)，通過(guò)檢索大型疾病數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行綜合分析，最終使骨質(zhì)疏松癥與肌少癥之間的共同靶點(diǎn)基因信息可視化。

圖表分析可知，骨質(zhì)疏松癥主要涉及PI3K-Akt、MAPK、Ras、Rap1、TNF、cAMP、JAK-STAT、FoxO、Chemokine、NOD樣受體以及HIF-1等信號(hào)通路。其中多數(shù)通路已被廣泛研究。如本研究中靶基因數(shù)最多的通路為PI3K-Akt信號(hào)通路，以往研究表明該通路與成骨和破骨通路緊密聯(lián)系，調(diào)控著成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞存活、分化過(guò)程從而維持骨量和骨轉(zhuǎn)換平衡[15]。朱云艷等[16]發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體通路過(guò)表達(dá)可引起MAPK以及Akt 磷酸化水平的下降。田愛(ài)現(xiàn)等[17]在骨質(zhì)疏松關(guān)聯(lián)性分子信號(hào)通路的論述中，PI3K-Akt、TNF等多種信號(hào)通路均有涉及。李近等[18]綜合分析認(rèn)為FoxOs可調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡進(jìn)而影響骨組織的微結(jié)構(gòu)和骨質(zhì)量。鐘航等[19]認(rèn)為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中破骨細(xì)胞內(nèi)HIF-1信號(hào)通路的上調(diào)可能與Akt、ERK等信號(hào)通路有關(guān)。肌少癥主要涉及PI3K-Akt、JAK-STAT、MAPK、長(zhǎng)壽調(diào)控、FoxO、AMPK、Insulin、HIF-1、mTOR等信號(hào)通路。多數(shù)通路已被廣泛研究，但關(guān)于具體信號(hào)通路與肌少癥如何發(fā)病的相關(guān)研究較少。楊明等[20]認(rèn)為肌少癥與IGF/PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，維生素D及多種激素均有密切關(guān)系，但關(guān)于肌少癥相關(guān)的信號(hào)通路的研究仍有待進(jìn)一步深化。

我們分析得到骨質(zhì)疏松癥與肌少癥的部分信號(hào)通路是重疊的，這表明兩種疾病之間可能存在共同的發(fā)病機(jī)制。其主要包括PI3K-Akt、長(zhǎng)壽調(diào)控、FoxO，AGE-RAGE、HIF-1、AMPK、JAK-STAT、MAPK、Insulin、TNF以及Apoptosis過(guò)程。已有研究提示，在PI3K/Akt通路中，IGF-1通過(guò)PI3K/Akt和MAPK/ERK信號(hào)通路激活I(lǐng)GF-1R[21]。IGF-1可誘導(dǎo)肌肉肥大，進(jìn)而促進(jìn)骨骼發(fā)育和骨量的保存，然而GH的缺乏則會(huì)導(dǎo)致肌肉和骨量減少。同時(shí)，血清IGF-1水平與瘦體量和骨折風(fēng)險(xiǎn)降低呈正相關(guān)。Demontiero等[22]的研究表明肌少癥與骨質(zhì)疏松癥患者的IL-6 和TNF-α水平較高相關(guān)。由于肌肉和骨骼組成人體的肌骨運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)，兩者緊密關(guān)聯(lián)。肌肉是調(diào)節(jié)骨骼潛在細(xì)胞、信號(hào)的重要來(lái)源，骨骼的內(nèi)分泌或旁分泌作用可調(diào)控肌肉發(fā)育、肌量與肌力。骨質(zhì)疏松癥與肌少癥均為復(fù)雜代謝性疾病，涵蓋眾多差異表達(dá)基因，均擁有龐大的疾病基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，涉及眾多信號(hào)通路，并且網(wǎng)絡(luò)之間密不可分。對(duì)于這兩種疾病的防治應(yīng)針對(duì)骨骼和骨骼肌之間的相互關(guān)系和共同作用靶點(diǎn)，運(yùn)用綜合有效的干預(yù)措施。

本研究擬探尋骨質(zhì)疏松癥與肌少癥疾病過(guò)程中存在的高度重合的差異基因表達(dá)以及相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)而針對(duì)共同靶點(diǎn)或通路進(jìn)行調(diào)控，為臨床治療骨質(zhì)疏松癥與肌少癥提供理論依據(jù)。當(dāng)然，本研究存在一定弊端，基因的正向負(fù)向調(diào)控表達(dá)與激活程度未在數(shù)據(jù)庫(kù)中顯示，這需要生物信息學(xué)以及疾病數(shù)據(jù)庫(kù)后續(xù)的不斷完善。同時(shí)，本研究結(jié)果仍需要后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與支持，使理論更加可靠。