劉百奇 車德馨 侯慶露 韓健 潘華興 徐東輝

齊齊哈爾市第一醫(yī)院骨外科，黑龍江 齊齊哈爾 161005

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥( postmenopausal osteoporosis，PMOP) 是絕經(jīng)后婦科臨床上較常見的骨科疾病，主要臨床癥狀為腰背部酸痛、身長縮短以及股骨頸、脊椎等脆性骨折等[1]。骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)和骨折易感性是多因素的，主要受環(huán)境因素和遺傳因素的影響，據(jù)統(tǒng)計60 %至80 %的骨質(zhì)流失加速是由遺傳因素造成的[2]。由于OP是一種多基因疾病，每種骨骼表型(密度、質(zhì)量、代謝率)都是由多基因相互作用的結(jié)果，盡管采用了各種先進的方法，但導(dǎo)致OP的關(guān)鍵基因尚未被確定[3]。

Wnt是骨骼中最重要的信號通路之一，在胚胎發(fā)育過程中對骨發(fā)育至關(guān)重要，在骨量調(diào)節(jié)中具有雙重作用，是蛋白質(zhì)參與影響骨形成和骨吸收[4]。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(LRP5)是Wnt信號通路中最重要的膜受體，它曾在全基因組關(guān)聯(lián)研究中(GWAS)被標(biāo)記為與OP相關(guān)[5]。LRP5基因突變引起的失活導(dǎo)致骨質(zhì)疏松-假性神經(jīng)膠質(zhì)瘤綜合征，從而出現(xiàn)骨量降低和骨折的發(fā)生[6]。此外，還有幾種自然產(chǎn)生的Wnt信號抑制因子，如基因重組蛋白(DKK)和硬化蛋白(SOST)，可以使LRP5受體的信號失活，通過與LRP5協(xié)同受體結(jié)合，拮抗成骨細(xì)胞中的Wnt信號傳導(dǎo)，阻止骨形成[7]。在絕經(jīng)后OP治療中，法尼酰二磷酸合酶(FDPS)是甲羥戊酸途徑關(guān)鍵酶，作為氨基雙膦酸鹽類抗再吸收藥物作用靶點，維持著破骨細(xì)胞的活性，可能影響未接受治療的婦女的骨量，改變破骨細(xì)胞的活性，促進骨密度和骨周轉(zhuǎn)率[8]。

OP的發(fā)病機制是由調(diào)控骨骼和礦物質(zhì)代謝的各種遺傳因素與跌倒風(fēng)險因素、環(huán)境影響和生活方式等因素的相互作用的結(jié)果[9]。本研究的目的是評估絕經(jīng)后婦女中，已被驗證了的二個候選骨質(zhì)疏松癥基因(FDPS rs2297480, LRP5 rs3736228)的基因型和BMD之間的關(guān)系及與骨質(zhì)疏松的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 一般資料

納入2017年6月至2019年8月期間，在我院就診的364名絕經(jīng)后婦女，平均年齡64.9±8.3歲。納入標(biāo)準(zhǔn)為：年齡>45歲，絕經(jīng)>2年，近期診斷骨質(zhì)疏松癥或采用雙能X線骨密度儀(DXA)測量骨密度(BMD)正常的婦女。將其分為兩組：骨質(zhì)疏松癥組(228人)和BMD正常者為對照組(136人)。排除標(biāo)準(zhǔn)：有代謝性骨病病史(如甲狀旁腺功能亢進、骨軟化、Paget病等)、惡性腫瘤、骨轉(zhuǎn)移病史以及使用影響骨代謝藥物(如抗骨質(zhì)疏松藥物、維生素K拮抗劑)治療的患者。臨床資料收集，包括年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、絕經(jīng)年齡及時間、腰椎(L1-4)、股骨頸、髖部總骨密度和骨質(zhì)疏松性骨折風(fēng)險(FRAX)。此外，從每個研究參與者身上采集2 mL血液，用 EDTA真空抗凝管留取，用于基因檢測。該研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2017026)，所有參與者都簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1BMD測定：所有研究對象采用雙能X線骨密度儀完成(單位g/cm2)，測量部位包括腰椎(L1-4)、股骨頸及全髓。由放射科專門測定BMD的技術(shù)人員協(xié)助完成。本研究中BMD的測定分別采用Lunar及Hologic兩種儀器完成。對于絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，基于測定股骨頸、腰椎BMD的T值低于同性別、同種族健康成人的骨峰值2.5個標(biāo)準(zhǔn)差為骨質(zhì)疏松，即T≤-2.5為骨質(zhì)疏松。二種儀器間的系統(tǒng)誤差采用線性回歸方程進行數(shù)據(jù)換算：Hologic BMD值(g/cm2)=0.802×Lunar值+0.318(R=0.991；P<0.001)。

1.2.2SNP基因分型：基因組DNA從EDTA抗凝管提取的外周血中提取，采用天根北京生物科技公司血基因組提取試劑盒。然后進行DNA濃度測定。利用PCR-RELP法對FDPS rs2297480進行基因分型。利用Tapman熒光探針法對LRP5 rs3736228進行基因分型。所有步驟均按廠家說明進行。反應(yīng)混合物中含有10 μL的2×TaqMan基因分型主混合物(Thermo Fisher公司，美國)，0.5，μL匹配40×TaqMan SNP基因分型檢測，約25，ng基因組的DNA和游離核酸酶混合物，最終體積為20 μL。所有基因分型均采用相同的擴增程序，在60 ℃進行30 s預(yù)讀，在95 ℃保持10 min，然后進行PCR，共40個循環(huán)，每個循環(huán)95 ℃ 15 s和60 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s擴增后讀數(shù)。PCR自動循環(huán)儀器 (Bio-Rad公司, 美國)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

共有364名患者符合納入標(biāo)準(zhǔn)，其中228名診斷為OP，另136名BMD正常。臨床一般資料骨質(zhì)疏松組與對照組相比，年齡偏大，體質(zhì)指數(shù)更小，絕經(jīng)年齡更小，閉經(jīng)年限更長，L1-4、股骨頸及髖關(guān)節(jié)BMD更低，骨折風(fēng)險更高(P<0.05)。納入研究女性的主要特征見表1。

表1 納入研究的婦女的臨床特征

FDPS rs2297480、LRP5 rs3736228基因型及等位基因在研究群體(n=364)中的分布頻率見表2。

表2 研究人群中SNP的等位基因和基因型頻率[n=364,n(%)]

攜帶FDPS rs2297480 TT基因型者在腰椎和全髖部的BMD值顯著低于雜合子GT和純合子GG (P=0.006和P=0.03)，在股骨頸的BMD值下降不顯著(P=0.179)。至于LRP5 rs3736228純合子CC 在股骨頸和全髖的BMD值明顯低于CT或TT基因型(P=0.028，P=0.014)，但在腰椎BMD變化不顯著(P=0.717)，見表3。

表3 不同基因型間的骨密度值[n=364，g/cm2, M(P25～P75)]Table 3 BMD values between different genotypes [n=364，g/cm2, M(P25～P75)]

在共顯性模型分析中，rs2297480 SNP的TT基因型發(fā)生OP風(fēng)險最高(OR=2.1；95 %CI：1.4～3.3；P<0.05，雜合子GT基因型風(fēng)險最低(OR=0.4；95 %CI：0.3～0.7；P=0.001)。T等位基因的存在與OP發(fā)生顯著相關(guān)(P=0.005)。rs3736228 SNP的CC基因型發(fā)生OP風(fēng)險最高(OR= 1.5；95 %CI：0.9～2.4；P=0.05)，雜合子CT風(fēng)險最低(OR=0.6；95 %CI：0.3～0.9；P=0.041)。C等位基因與OP沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)(P=0.143)，見表4。

表4 骨質(zhì)疏松癥組與對照組之間的等位基因和基因型分布及相關(guān)性[n(%)]Table 4 Allele and genotype distribution and correlation between the osteoporosis group and the control group[n(%)]

3 討論

目前60歲以上人群中骨質(zhì)疏松癥的患病率有增高趨勢,尤其是絕經(jīng)后婦女[10]。盡管過去在確定涉及BMD、骨折和其他相關(guān)表型的候選基因方面已經(jīng)有了顯著的進展，但大多數(shù)的遺傳變異仍未被發(fā)現(xiàn)或驗證。研究者一直在尋找遺傳因素在骨量丟失發(fā)病機制中的作用，但迄今為止，在這一領(lǐng)域還沒有關(guān)于OP的決定性病因信息。目前已被證實在單核苷酸多態(tài)性(SNPs)中多個基因與BMD有關(guān)，但是結(jié)果不確定或相互矛盾。全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)中研究了60 多個與BMD 相關(guān)基因，證實了BMD 基因的多態(tài)性，BMD在母親與女兒之間存在高度相關(guān)性，主要是由于骨表型的遺傳因素決定了骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[11]。

LRP5基因作為Wnt 信號傳導(dǎo)通路的受體，其基因的多態(tài)性與骨代謝之間的關(guān)系越來越受到重視[12]。LRP5是一種跨膜受體蛋白，屬于低密度脂蛋白受體家族之一，它的編碼基因定位于染色體11q12-13上，是Wnt 配體的輔助受體[13]。有研究表明給予去卵巢的小鼠雌激素處理，其LRP5 的表達(dá)明顯升高，骨密度增加[14]。LRP5是一種跨膜受體，它允許外源性的化學(xué)信號傳遞到細(xì)胞核內(nèi)參與骨的形成。LRP5是Wnt蛋白的輔助受體，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)2誘導(dǎo)的堿性磷酸酶激活依賴于LRP5/Wnt信號通路。LRP5基因突變，尤其是171 位甘氨酸突變所引起的LRP5失活是骨質(zhì)疏松癥-假性膠質(zhì)瘤綜合征的發(fā)病原因，其特點是低骨量和骨折[15]。一些常見的LRP5基因多態(tài)性已被檢測出與骨骼表型相關(guān)，包括骨折風(fēng)險和骨密度，其中LRP5基因的編碼單核苷酸多態(tài)性(SNP) rs3736228 (A1330V)被認(rèn)為對骨質(zhì)疏松具有特殊的易感性[16]。另外研究揭示了FDPS在維持破骨細(xì)胞吸收活性方面的重要作用，F(xiàn)DPS酶的基因多態(tài)性與絕經(jīng)后婦女骨密度的有關(guān)，F(xiàn)DPS酶也是氨基膦酸鹽的主要靶點。一些研究檢測了人類FDPS基因中已驗證的常見多態(tài)性dbSNP：rs2297480也與絕經(jīng)后婦女骨量有關(guān)[17]。Olmos等[18]研究顯示SNP rs2297480與65歲以上絕經(jīng)后婦女的骨密度之間的顯著相關(guān)性。

我們的研究表明，F(xiàn)DPS rs2297480點位的主要等位基因T的存在與骨質(zhì)疏松癥之間存在顯著相關(guān)性(P=0.005)。rs2297480點位基因型TT顯著降低腰椎BMD值和全髖關(guān)節(jié)BMD值(P<0.05)。這些結(jié)果與Levy等[19]的研究結(jié)果一致，他們同樣評估了FDPS的多態(tài)性，還發(fā)現(xiàn)在老年婦女中主要的等位基因C的存在與低BMD之間有很強的相關(guān)性。相反Massart等[20]評估了女性rs2297480多態(tài)性基因型與骨密度的關(guān)系，但未發(fā)現(xiàn)與基線BMD的相關(guān)性。Canto-Cetina等[21]發(fā)現(xiàn)，LRP5 rs3736228多態(tài)性與女性所有BMD位點變異之間存在顯著相關(guān)性。而Falcn-Ramírez等[22]在他們的研究群體中沒有發(fā)現(xiàn)相同位點基因型與BMD的顯著關(guān)聯(lián)。在我們的研究中LRP5 rs3736228位點CC和CT基因型與OP相關(guān)(P=0.05和P=0.041)。此外，攜帶CC基因型的絕經(jīng)后婦女股骨頸和全髖關(guān)節(jié)骨密度顯著降低(P<0.05)。在某些種族人群中，所有BMD位點中LRP5 rs3736228 CC基因型的BMD值往往高于TT基因型[20]。Markatseli等[23]在圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女隊列中報道，CT/TT基因型的存在與腰椎骨密度一致。Ezura等[24]分析了rs3736228基因型與成年女性骨密度的關(guān)系，他們發(fā)現(xiàn)攜帶小T等位基因的純合子BMD得分最低，攜帶大C等位基因的純合子BMD得分較高。這些結(jié)果與本研究的基因型分布相似。但我們的研究結(jié)果表明，骨質(zhì)疏松風(fēng)險基因型可能與絕經(jīng)后女性的rs3736228基因型純合子CC有關(guān)。存在的這些差異可能跟不同地區(qū)、不同種族有關(guān)。

綜上所述，我們的研究得出在絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松癥婦女中，BMD和FDPS基因多態(tài)性之間有很強的相關(guān)性，與LRP5基因多態(tài)性之間存在較低關(guān)聯(lián)。本研究存在幾個局限性，首先，本研究只包括本地區(qū)女性，目前還不清楚該結(jié)果是否可以推斷出不同種族的女性。其次，樣本數(shù)較小，因為遺傳研究需要更多的受試者來實現(xiàn)足夠的統(tǒng)計效力。第三，研究設(shè)計是基于臨床和志愿者，而不是基于人群，因此潛在的偏差仍然存在。這些需要在今后的工作中進一步驗證，使其更具科學(xué)性和實用性。