宋 揚，于 鐳，梁宛楠，李 倩

（哈藥集團生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

禽流感（Avian influenza，AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的一種以全身性敗血癥和呼吸系統(tǒng)疾病為特征的人獸共患傳染病。根據(jù)致病性和毒力不同，AIV可分為非致病性禽流感（NPAIV）、高致病性禽流感（HPAIV）和低致病性禽流感（LPAIV）。HPAIV以死亡率高和傳播范圍廣為主要特征。H9 亞型禽流感為LPAIV，感染后不會導致群體大批死亡，但是感染率較高，感染后會引起禽類呼吸困難、采食下降、產(chǎn)蛋率下降等臨床癥狀，且易繼發(fā)其他疾病。同時，流感病毒變異速度極快，極有可能由原來的低致病性禽流感進化為致病能力更強的毒株。國際檢驗獸疫局（OIE）已將禽流感定為A類傳染病，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其列為甲類監(jiān)測傳染病。目前禽流感疫苗主要有滅活疫苗和減毒活疫苗。滅活疫苗主要誘導機體產(chǎn)生體液免疫應答，不能抵抗異源毒株的感染，長期使用易導致不同亞型抗原間的重排和抗原變異，常出現(xiàn)免疫失敗的現(xiàn)象。減毒活疫苗仍存在活病毒成分，有返毒風險，且疫苗的保存、成本和運輸條件要求較高。為了彌補傳統(tǒng)疫苗不足，利用基因工程重組技術開發(fā)新型有效的疫苗是十分必要的。

本研究以“禽流感病毒（H9 亞型）258 株”為模板，以AIV 的HA 基因的胞外域與3 個重復串聯(lián)的M2 蛋白胞外域為靶基因，插入真核表達載體pCIGS 中，構建了含有HA-M2e 基因的重組質(zhì)粒，并轉染CHO 細胞，經(jīng)加壓篩選獲得重組高度表達HA-M2e 蛋白的重組CHO 細胞株。以期為禽流感病毒（H9亞型）重組疫苗的研制奠定基礎。

1 材 料

1.1 病毒、細胞、菌株和載體

pUC-HA-M2e 質(zhì)粒載體，由上海桑尼生物科技有限公司對AIV HA-M2e蛋白基因進行優(yōu)化后構建并供應；pCI-GS 質(zhì)粒，由蘇州世諾生物技術有限公司構建并提供；CHO 細胞，購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心；DH5α 感受態(tài)細胞，北京全式金生物技術有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑儀器

低熔點瓊脂糖，BD 公司產(chǎn)品；PVDF 膜（聚偏氟乙烯），Millipore 公司產(chǎn)品；Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶以及DNA Marker均為New England Biolab（北京）有限公司產(chǎn)品；PCR 擴增所用聚合酶，購自天根生化科技（北京）有限公司；pfu PCR Master Mix，購自天根生化科技（北京）有限公司；胎牛血清，購自GIBCO BRL 公司；抗AI VHA-M2e蛋白的單克隆抗體，由哈藥集團生物疫苗有限公司實驗室制備；CHO 細胞無血清無蛋白培養(yǎng)基（CHO-WM 培養(yǎng)基），蘇州市沃美生物技術有限公司產(chǎn)品；胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉，購自國藥試劑有限公司；化學發(fā)光成像儀，上海天能科技有限公司產(chǎn)品。

PCR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及擴增基因見表1。

2 方 法

2.1 HA-M2e基因擴增與純化

在上海桑尼生物科技有限公司合成了密碼子優(yōu)化后的HA-M2e 基因并克隆到pUC-57 載體上，得到pUC-HA-M2e 質(zhì)粒載體。以pUC-HA-M2e 質(zhì)粒作為模板，HA-M2e-F、HA-M2e-R作為上、下游引物進行PCR擴增，擴增體系（25 μL），見表2。

表2 HA-M2e基因擴增體系 μL

擴增條件為：94 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 s，60 ℃復性45 s，72℃延伸2 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保藏。

將PCR 產(chǎn)物進行凝膠電泳驗證目的基因大小，用凝膠回收純化試劑盒進行回收純化。

2.2 HA-M2e基因與pCI-GS質(zhì)粒的連接

將凝膠回收純化PCR 產(chǎn)物和pCI-GS 質(zhì)粒載體使用Xho Ⅰ、 EcoR Ⅰ酶37℃酶切3 h，具體酶切反應體系見表3、表4。

表3 HA-M2e基因酶切反應體系 μL

表4 pCI-GS質(zhì)粒酶切反應體系 μL

將酶切產(chǎn)物進行凝膠電泳，分別使用凝膠回收純化試劑盒純化酶切的pCI-GS 質(zhì)粒以及HA-M2e基因片段。

2.3 連接

將酶切過的pCI-GS 質(zhì)粒和HA-M2e 基因酶切產(chǎn)物使用T4 DNA連接酶16 ℃水浴連接過夜。具體連接反應體系見表5。

表5 HA-M2e基因與pCI-GS質(zhì)粒連接體系

2.4 轉化

將10 μL連接產(chǎn)物加入100 μL的DH5α感受態(tài)細胞中混勻，冰浴30 min，42 ℃水浴熱休克90 s，再冰浴2 min，加入900 μL 不含氨芐西林（Amp）的LB培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)1 h，將1.0 mL 菌液離心濃縮成100 μL 涂布于含有Amp 的LB 固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)16 h。

2.5 重組質(zhì)粒的提取

挑取平板上4 個單菌落分別接種LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)2 h，以菌液作為模板，以HAM2e-F 和HA-M2e-R 為引物進行菌落PCR。反應條件為：94 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 s，60 ℃復性45 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；然后72 ℃延伸10 min，4 ℃保藏。將PCR產(chǎn)物凝膠電泳，EB染色，紫外燈下查看電泳膠。待檢樣品出現(xiàn)一條分子量約為1.7 kb的DNA帶，判為陽性；反之，判為陰性。對鑒定出的陽性克隆進行測序，選擇序列以及連接方向正確的菌株保藏。

2.6 細胞轉染

2.6.1 準備細胞

取對數(shù)生長期的CHO 細胞，取樣計數(shù)，以1×106cells·mL-1的細胞密度繼續(xù)傳代，維持種子，剩余細胞離心，1000 r·min 離心4 min 后棄上清，用20 mL 左右的新鮮CHO-WM 培養(yǎng)基重懸，再次離心，1000 r·min 離心4 min，棄上清后用少量培養(yǎng)基重懸計數(shù)，最終將細胞密度調(diào)整為1.43×107cells·mL-1。

2.6.2 質(zhì)粒與細胞混合

取pCI-HA-M2e-GS重組質(zhì)粒5 μg，加入至EP管中，添加0.7 mL細胞，混合均勻后靜置15 min。

2.6.3 電轉

280 V 20 ms電擊2個脈沖，電擊完成后立刻將細胞轉入至搖瓶中，懸浮培養(yǎng)48 h 后觀察細胞狀態(tài)，換液培養(yǎng)，等細胞密度生長到0.6×106cells·mL-1時，添加50 μmol·L-1MSX（L-methionine sulphoximine）加壓篩選。

2.7 單克隆篩選

2.7.1 重懸

用蘇州沃美生物技術有限公司的CHO 細胞無血清無蛋白培養(yǎng)基CHO-WM細胞培養(yǎng)基+50 μmol·L-1MSX重新懸浮細胞，計數(shù)。

2.7.2 鋪板

稀釋細胞至5 個·mL-1，取200 μL 混勻的細胞加入到96 孔板中，放置到37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育4～6 h。記錄單個細胞的孔。

2.7.3 篩選

待96 孔板中單個細胞的孔長起來時，棄掉培養(yǎng)基， 用PBS 液洗1 次， 100 μL 0.25% trypsin-EDTA室溫消化2 min左右，加入2 mL CHO-WM 培養(yǎng)基（含10% FBS+50 μmol·L-1MSX）終止消化反應，并用移液器將細胞吹散。將細胞轉移至12 孔板，待12 孔板長滿時，取上清液，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測克隆是否為陽性，高效表達的陽性克隆繼續(xù)擴大培養(yǎng)，凍存。

2.8 細胞搖瓶發(fā)酵

2.8.1 傳代培養(yǎng)基的配置

使用CHO-WM培養(yǎng)基添加50 μmol·L-1MSX作為傳代培養(yǎng)基，置于37 ℃水浴鍋預熱至37 ℃。

2.8.2 計數(shù)

從CO2恒溫搖床取出搖瓶細胞，進行計數(shù)。

2.8.3 孵育

稀釋細胞至2.5～3.5×105個cells·mL-1，接種30 mL培養(yǎng)基于一個125 mL搖瓶中。細胞培養(yǎng)瓶放置到37 ℃、5% CO2恒溫搖床中100 r·min-1孵育過夜。

2.8.4 測蛋白

每隔24 h計數(shù)細胞密度以及活力，監(jiān)測葡萄糖濃度，當糖濃度低于2 g·L-1的時候添加葡萄糖到4 g·L-1；每天取1 mL 樣品，上清液用于檢測蛋白質(zhì)表達情況。

2.9 表達HA-M2e蛋白的重組CHO細胞的鑒定

2.9.1 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）檢測

將收獲的上清液進行SDS-PAGE檢測，同時使用空的CHO細胞作為陰性對照。取40 μL收獲的細胞培養(yǎng)物，加入10 μL 的5×上樣緩沖液，沸水浴5 min，12000 r·min-1離心1 min，取上清液進行SDS-PAGE 凝膠（12%濃度）電泳，電泳后取凝膠經(jīng)染色、脫色后觀察目的條帶。

2.9.2 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）鑒定

將SDS-PAGE電泳后的產(chǎn)物轉印到硝酸纖維素（NC）膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h，AIV HA-M2e單克隆抗體陽性血清孵育2 h，漂洗，HRP 標記的羊抗雞多克隆抗體二抗孵育2 h，漂洗，然后滴加增強型化學發(fā)光熒光底物，使用化學發(fā)光成像儀拍照。

2.9.3 瓊擴檢測

在瓊脂糖凝膠板上打梅花孔，在梅花孔中間加入AIV 瓊擴檢測標準血清，周圍分別加入稀釋了20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、210倍的表達抗原。倒置孵育72 h后觀察沉淀線。出現(xiàn)沉淀線的最大稀釋比例為其瓊擴效價。

2.9.4 間接免疫熒光檢測

向96 孔培養(yǎng)板中加入重組CHO 細胞懸液，100 μL·孔-1（細胞濃度為2.5×105～4.0×105個·mL-1），接種4 孔，27 ℃靜置15 min，使重組CHO 細胞貼于培養(yǎng)板底壁，同時設空白細胞對照。細胞置27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72～96 h，棄培養(yǎng)液，冷甲醇∕丙酮（1∶1）固定。首先與雞源抗AIV多抗血清反應，然后與FITC 標記的羊抗雞IgG 反應，倒置熒光顯微鏡觀察結果。

2.9.5 目的蛋白的表達量測定

將收獲的上清用雙抗體夾心ELISA法進行蛋白含量測定。

3 結果與分析

3.1 重組質(zhì)粒pCI-HA-M2e-GS構建及鑒定

以pUC-HA-M2e作為模板，HA-M2e-F、HAM2e-R 作為引物進行PCR 擴增，凝膠電泳結果顯示在約1.7 kb 處出現(xiàn)目的條帶，與預期結果相符，表明HA-M2e 基因片段擴增成功，具體結果見圖1。將擴增成功的HA-M2e 基因片段克隆于pCI-GS 質(zhì)粒，菌落PCR 鑒定在約在1.7 kb 處出現(xiàn)目的條帶，與預期結果相符，具體結果見圖2。表明重組質(zhì)粒pCI-HA-M2e-GS構建成功。

圖1 HA-M2e基因的PCR擴增結果

圖2 pCI-HA-M2e-GS酶切鑒定結果

3.2 重組HA-M2e蛋白的鑒定

3.2.1 SDS-PAGE檢測

將收獲的上清進行SDS-PAGE檢測，同時使用空的CHO 細胞作為陰性對照。結果顯示樣品在66 ku 附近出現(xiàn)明顯條帶，對照未出現(xiàn)相應條帶，具體結果見圖3。

圖3 SDS-PAGE檢測重組病毒表達產(chǎn)物

3.2.2 Western Blot鑒定

將SDS-PAGE 電泳后的產(chǎn)物進行Western Blot鑒定，表達HA-M2e 蛋白的重組CHO 細胞上清樣品有對應條帶，陰性對照沒有目的條帶，說明目的抗原蛋白在CHO 細胞中得到正確表達。具體結果見圖4。

圖4 Western Blot鑒定結果

3.2.3 瓊擴檢測

使用瓊擴方法檢測表達的重組HA-M2e 蛋白，結果表明HA-M2e蛋白瓊擴效價為1∶512。

3.2.4 間接免疫熒光檢測

結果空白細胞對照均無綠色熒光，重組CHO細胞觀察到綠色熒光。具體結果見圖5。

圖5 間接免疫熒光檢測結果

3.2.5 目的蛋白的表達量測定

將收獲的上清液用雙抗體夾心ELISA法進行蛋白含量測定，結果蛋白含量為1.13 mg·mL-1。

4 結論

本研究利用分子生物學操作技術成功構建了表達AIV HA-M2e 蛋白的重組CHO 細胞，即含AIV HA-M2e基因的重組bCHO細胞258株。

通過SDS PAGE 和Western Blot 鑒定，證實了AIV HA-M2e基因在CHO細胞中能夠正確表達，表達蛋白瓊擴效價為1∶512，表達抗原蛋白含量達到1.13 mg·mL-1。以上結果表明，通過基因工程技術構建的含AIV HA-M2e 基因的重組CHO 細胞258株，能特異表達AIV HA-M2e蛋白，與AIV單抗的免疫學反應良好，且在CHO 細胞上能穩(wěn)定增殖，可作為疫苗研制用毒株。