馮科森，焦健華,，張景良，秦衛(wèi)軍

(1.中國人民解放軍61035部隊衛(wèi)生隊，北京昌平 102205；2.空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710032)

前列腺癌是男性最常見惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率在全球及國內(nèi)均迅速上升[1-2]。目前，手術(shù)是治療前列腺癌最有效的方法之一，而根治性前列腺癌切除術(shù)和盆部淋巴結(jié)清掃術(shù)是最常用術(shù)式[3]。根治性前列腺癌切除術(shù)中，術(shù)者確定切緣范圍主要依靠術(shù)前影像學檢查、術(shù)中肉眼所見及探查、術(shù)者自身經(jīng)驗和術(shù)中冰凍病理檢查。手術(shù)切除范圍過大會損傷正常組織，影響尿控等正常功能；而切除范圍過小會導致陽性切緣，患者容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)。在盆部淋巴結(jié)清掃術(shù)中，術(shù)者也很難在手術(shù)中實時分辨淋巴結(jié)是否已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。目前，歐洲泌尿外科學會(European Association of Urology，EAU)和美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)指南均推薦對高風險患者進行擴大盆部淋巴結(jié)清掃術(shù)[3]。但淋巴結(jié)清掃范圍越大，導致相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生的可能性也越高[4]。因此，如何在手術(shù)中盡可能保留正常組織和功能，同時對前列腺癌侵犯區(qū)域進行徹底切除是臨床醫(yī)生經(jīng)常需要面對和解決的問題。靶向熒光術(shù)中導航技術(shù)正是解決這一問題的良方，本文就前列腺癌中前列腺特異性膜抗原(prostate membrane specific antigen,PSMA)靶向近紅外熒光(near-infrared fluorescence，NIRF)手術(shù)導航技術(shù)的研究進展進行綜述。

1 靶向NIRF手術(shù)導航技術(shù)的基本概念

1.1 光學分子影像學光學分子影像學源自1999年WEISSLEDER教授最早提出的分子影像學(mo-lecular imaging)技術(shù)[5]，是利用生物體自發(fā)熒光對分子和分子作用途徑檢測的一種無創(chuàng)技術(shù)，成像依靠不同波長熒光[6]。該技術(shù)常用波長為400～1 000 nm，包括可見光波段(波長：400～650 nm)和NIRF波段(波長>650 nm)[6]。與可見光波段相比，NIRF具有波長較長、組織穿透力較強、散射較小等優(yōu)點，更適合進行體內(nèi)成像。

1.2 靶向光學分子影像手術(shù)導航靶向光學分子影像手術(shù)導航是一種基于光學分子影像學技術(shù)，對腫瘤進行細胞及分子層面靶向?qū)崟r在體成像的技術(shù)[7]。在靜脈注射腫瘤靶向NIRF染料后，腫瘤靶向熒光染料通過配體-受體結(jié)合作用實現(xiàn)體內(nèi)自動尋靶。施術(shù)者利用高敏感度的熒光采集設(shè)備及快速圖像融合計算，實現(xiàn)術(shù)中實時熒光成像以精準切除腫瘤組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[7]。

1.3 靶向NIRF染料靶向NIRF染料通過將NIRF染料與靶向惡性腫瘤特異性標志物的配體，如抗體、多肽、小分子化合物相結(jié)合從而實現(xiàn)熒光染料在手術(shù)中對惡性腫瘤的靶向成像。傳統(tǒng)非靶向NIRF染料如吲哚菁綠(indocyanine green,ICG)等主要依靠實體惡性腫瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention,EPR)進行成像，不連接腫瘤靶向特異性配體，不具有針對惡性腫瘤特異靶向性，因而難以在手術(shù)中準確分辨前列腺癌和正常組織。與這些傳統(tǒng)NIRF染料相比，靶向NIRF染料可通過配體-受體特異性結(jié)合作用，精準識別惡性腫瘤，因此具有靶向性更好、特異性更高、與惡性腫瘤結(jié)合時間更長等優(yōu)點。靶向NIRF染料的使用與否也是靶向NIRF手術(shù)導航技術(shù)與非靶向NIRF手術(shù)導航技術(shù)的區(qū)別所在。

1.4 PSMAPSMA是一種具有葉酸水解酶和N-乙?；?鍵酸性二肽酶(N-acetylated a-linked acidic dipeptidase，NAALADase)活性的Ⅱ型跨膜糖蛋白，在前列腺癌細胞中顯著高表達且其表達量為生理表達量的100倍以上[8]。有研究表明，PSMA可在絕大多數(shù)原發(fā)性前列腺癌和98%前列腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中高表達[9]，并且其表達量隨Gleason分期升高而增加[10]。因此，PSMA作為一種前列腺癌特異性高表達膜蛋白，便于和靶向染料結(jié)合，是靶向NIRF染料的理想靶點。

2 常用設(shè)備

靶向NIRF手術(shù)導航技術(shù)所使用的設(shè)備一般是具有近紅外波段熒光成像功能的熒光手術(shù)設(shè)備。國外研究中常用的設(shè)備包括Artemis、FDPM imager、FLARE、Fluobeam、HyperEye、熒光腹腔鏡Karl Strorz/PINPOINT、Kit-FLARE、Mini-FLARE、Photodynamic Eye(PDE)、Munich/SurgOptix原型攝像系統(tǒng)、Goggle系統(tǒng)、加裝NIRF成像模塊的達芬奇手術(shù)機器人等設(shè)備[11-12]。目前國內(nèi)報道的臨床研究中所使用的設(shè)備有：楊曉峰等[13]在前列腺癌根治性切除術(shù)和擴大盆腔淋巴結(jié)清掃中使用的熒光腹腔鏡系統(tǒng)。以上具有近紅外波段成像功能的設(shè)備均可進行靶向NIRF手術(shù)導航，因此靶向NIRF染料的研發(fā)也就成為該研究領(lǐng)域的熱點。與傳統(tǒng)的非靶向NIRF成像相比，PSMA靶向NIRF染料是PSMA靶向NIRF手術(shù)的關(guān)鍵技術(shù)，能夠極大提高前列腺癌病灶的信噪比，為減少陽性切緣和精準清除轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)提供重要保證。下面我們進一步對PSMA靶向NIRF染料研究進展進行綜述。

3 靶向熒光染料

根據(jù)靶向PSMA的配體種類不同，可以將PSMA靶向NIRF染料分為抗體靶向染料、小分子靶向染料、可激活靶向染料和雙模靶向染料(圖1)。

圖1 PSMA靶向NIRF染料結(jié)構(gòu)示意圖

3.1 抗體PSMA靶向NIRF染料抗體PSMA靶向NIRF染料是指將全抗體或抗體片段偶聯(lián)NIRF染料構(gòu)成的PSMA靶向NIRF染料。J591是1種PSMA靶向人源化單克隆抗體，其以良好的特異性最早應(yīng)用于PSMA抗體靶向染料的合成。2011年，NAKAJIMA等[15]首先將J591抗體連接吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)，構(gòu)建首個PSMA抗體靶向NIRF染料。但在該染料中，ICG連接于J591抗體后便發(fā)生熒光淬滅，只有在與PSMA陽性前列腺癌細胞結(jié)合并內(nèi)化后才能再次發(fā)出熒光[15]。這種連接配體后易發(fā)生熒光淬滅的缺點限制了ICG在合成靶向熒光染料中的應(yīng)用，但這一缺點在商業(yè)化NIRF染料IRDye800CW中得以克服。2016年，約翰斯·霍普金斯大學醫(yī)學院團隊MUKHERJEE等[16]首次將J591抗體連接NIRF染料IRDye800CW構(gòu)建J591-IRDye800CW(又名ProstaFluor)，并且在PSMA+LMD前列腺癌細胞荷瘤裸鼠模型中證明該染料對PSMA+前列腺癌在注射后24～120 h具有良好的成像效果，且目前ProstaFluor已進入臨床試驗。同時，NAGAYA等[17]通過將PSMA單抗連接IR-700DX構(gòu)建Anti-PSMA-IR700同時實現(xiàn)了NIRF成像和光熱治療的效果。

隨著近年來抗體技術(shù)發(fā)展，單鏈抗體等新抗體的研發(fā)也進一步推進了抗體PSMA靶向NIRF染料的發(fā)展。2016年，MAZZOCCO等[18]將PSMA單鏈抗體ScFvD2B連接于近紅外染料X770構(gòu)建PSMA靶向NIRF染料X770-ScFvD2B，并順利用該染料對PSMA陽性前列腺癌細胞(LNCaP細胞)荷瘤鼠在靜脈注射后24～ 240 h進行體內(nèi)成像。在另一項研究中，本課題組HAN等[19]從大型酵母展示單鏈抗體庫中篩選出一株人源PSMA單鏈抗體gy1并連接近紅外染料IRDye800CW構(gòu)建首個人源PSMA單鏈抗體NIRF染料，并使用該靶向染料順利對PSMA+PC3前列腺癌細胞荷瘤鼠進行體內(nèi)成像且取得較好效果。在此工作基礎(chǔ)上，研究人員進一步將單鏈抗體gy1構(gòu)建為PSMA人源性全抗體PSMAb，將其連接至IRDye800CW上構(gòu)建出PSMAb-IRDye800CW，它是首個靶向PSMA人源全抗體NIRF染料，同時該研究順利對PSMA+PC3前列腺癌細胞荷瘤鼠進行了體內(nèi)成像[20]。

目前，抗體偶聯(lián)的NIRF探針在前列腺癌術(shù)中顯像具有獨特優(yōu)勢，一方面是由于抗體代謝相對較慢，可在3～7 d達到術(shù)中成像的最佳信噪比，為手術(shù)提供了較為充裕的時間；另一方面是由于抗體分子量相對較大，主要經(jīng)肝臟代謝而非腎臟代謝，其熒光在尿液中含量較少，避免了術(shù)中尿液滲漏導致的手術(shù)視野熒光污染。與PSMA靶向小分子配體相比，PSMA靶向抗體臨床試驗的進度相對較慢，在臨床試驗方面仍需努力。

3.2 小分子PSMA靶向NIRF染料小分子PSMA靶向NIRF染料是通過化學合成PSMA小分子化合物配體或抑制劑后偶聯(lián)NIRF染料構(gòu)成的靶向染料。2005年，HUMBLET等[21]通過合成一種PSMA靶向小分子化合物GPI，并且連接四磺化七甲川吲哚菁綠類染料IRDye78構(gòu)建首個小分子PSMA靶向近紅外染料GPI-78并順利將其用于PSMA+LNCaP前列腺癌細胞荷瘤鼠的體內(nèi)成像。

Cy5.5和IRDye800CW等商業(yè)化NIRF染料的出現(xiàn)及使用促進了PSMA小分子靶向染料迅速發(fā)展。一項研究將PSMA小分子抑制劑CTT-54.2與NIRF染料Cy5.5連接構(gòu)建成Cy5.5-CTT-54.2，其在體外實驗中顯示出對PSMA+前列腺癌細胞較強靶向性[22]。另一項研究通過合成一種PSMA靶向小分子抑制劑YC-27 3與IRDye800CW連接構(gòu)建小分子PSMA靶向NIRF染料并且成功用于PSMA+前列腺癌PC3pip細胞荷瘤鼠模型體內(nèi)成像[23]。此外，一項研究通過合成一種靶向PSMA小分子化合物PSMA-1，并將其分別與IRDye800CW和Cy5.5相連接，構(gòu)建2種PSMA靶向近紅外染料，PSMA-1-IRDye800CW和PSMA-1-Cy5.5[24]。2種PSMA靶向熒光染料均在注射4 h后在對PSMA+PC3pip前列腺癌細胞荷瘤鼠進行活體成像中達到較好的成像效果[24]。另一項研究通過化學合成PSMA小分子抑制劑SCE(一種尿素化合物)并連接IRDye800CW構(gòu)建PSMA靶向近紅外染料SCE-IRDye800CW，并用該染料順利對PSMA+LNCaP細胞荷瘤鼠進行體內(nèi)成像[25]。

除IRDye800CW和Cy5.5外，一些新的NIRF染料也進入臨床前期研究。一項研究通過合成PSMA小分子抑制劑賴氨酸尿素谷氨酸鹽(Lysine-urea-glutamate，KUE)連接一種含鋅NIRF染料ZW800-1(zwitterionic fluorophores)并用KUE-ZW800-1成功對PSMA+前列腺癌LNCaP細胞荷瘤鼠進行體內(nèi)成像[26]。同時，目前將PSMA靶向小分子配體KUE連接Cy5.5、Cy7、Cy7.5等陸續(xù)進入臨床前研究階段[26-27]。另一項研究設(shè)計PSMA靶向近紅外染料OTL78，該染料包括一個PSMA小分子配體DUPA和一種NIRF染料S0456，應(yīng)用于PSMA+前列腺癌22Rv1和LNCaP細胞荷瘤鼠的體內(nèi)成像并獲得信噪比5∶1的良好效果[28]。此外，還有研究將BODIPY熒光染料與PSMA小分子配體連接，構(gòu)建PSMA靶向NIRF染料[29]。

近年來，小分子PSMA靶向NIRF染料的快速發(fā)展得益于以PSMA小分子配體為基礎(chǔ)的PSMA正電子發(fā)射型計算機斷層顯像(positron emission computed tomography，PET)在臨床中的快速應(yīng)用和發(fā)展。但小分子配體分子量較小，主要經(jīng)腎臟代謝，術(shù)中尿液滲漏可能導致的術(shù)野熒光污染問題有待進一步地研究。

3.3 可激活NIRF染料靶向染料具有“開關(guān)”效應(yīng)，即平時保持關(guān)閉狀態(tài)不發(fā)出熒光，只有在與靶分子結(jié)合時才發(fā)出熒光。該染料利用靶分子酶活性，可在降低背景熒光的同時增加與靶分子結(jié)合熒光信號，以顯著提高信噪比[12]。由于PSMA具有葉酸水解酶和谷氨酸羧肽酶活性，因此可被設(shè)計為可激活NIRF染料的靶點。KAWATANI等[30]利用PSMA谷氨酸羧肽酶活性設(shè)計首個可激活PSMA靶向NIRF染料5GluAF-2MeTG。在5GluAF-2MeTG中，2MeTG是一種可以被PSMA的谷氨酸羧肽酶活性催化水解的底物，5GluAF是一種近紅外染料。當二者結(jié)合時2MeTG可通過最低未被占據(jù)分子軌道使5GluAF發(fā)生熒光淬滅，從而實現(xiàn)“關(guān)閉”熒光；在與PSMA結(jié)合后，PSMA谷氨酸羧肽酶活性將2MeTG解離，5GluAF重新發(fā)出強熒光從而實現(xiàn)“打開”熒光，以實現(xiàn)對PSMA+前列腺癌的成像。同時，另一項研究將前列腺癌PSMA靶向和腫瘤位置相對缺氧結(jié)合，合成了PSMA靶向與缺氧協(xié)同的多功能探針，用于前列腺癌的精準成像[31]。

3.4 多模態(tài)染料多模態(tài)染料是指將NIRF染料、核素等同時連接同一個配體從而實現(xiàn)同一靶向染料在多種成像方式下均可成像。由于每種成像方式都具有其自身獨特優(yōu)勢和缺陷，因此同時組合多種成像方式有望結(jié)合多種成像方式的優(yōu)勢，克服單一成像方式的缺陷。

有研究構(gòu)建了可同時進行單光子發(fā)射計算機斷層成像術(shù)(SPECT/CT)和NIRF成像的PSMA靶向雙模態(tài)染料。一項研究通過合成一種PSMA靶向的新的化合物“1”并將其分別連接111In和IRDye800CW，構(gòu)建了首個PSMA靶向的雙模態(tài)染料并成功用于PSMA+LNCaP前列腺癌細胞荷瘤鼠模型的SPECT/CT和NIRF成像[32]。另一項研究將PSMA胞外段結(jié)合的抗體D2B與111In和IRDye800CW連接構(gòu)建了PSMA靶向雙模染料111In-DTPA-D2B-IRDye800CW，并將該染料成功用于PSMA+LNCaP前列腺癌細胞皮下荷瘤鼠模型和PSMA+LS174T前列腺癌細胞腹腔荷瘤鼠模型的SPECT/CT和NIRF成像[33]。在靜脈注射111In-DTPA-D2B-IRDye800CW后48～168 h，NIRF成像可取得較高信噪比及較好成像效果[33]。同時，該課題組進一步嘗試IRDye700DX構(gòu)建111In-DTPA-D2B-IRDye700DX用于PSMA靶向成像和光熱治療[34]。

一些研究構(gòu)建可同時進行PET和NIRF成像的PSMA靶向雙模態(tài)染料。在已應(yīng)用于前列腺癌患者診斷檢查的68Ga-PSMA-11 PET的基礎(chǔ)上，該研究分別將FITC、AlexaFluor488、DyLight800和IRDye800CW 4種熒光染料連接68Ga-PSMA-11，首次構(gòu)建了4種可同時進行術(shù)前68Ga-PSMA PET和術(shù)中熒光手術(shù)導航的PSMA靶向雙模態(tài)染料[35]。其中68Ga-PSMA-11-DyLight800和68Ga-PSMA-11-IRDye800CW 2種染料所使用熒光波段均為NIRF，更適合體內(nèi)成像，且68Ga-PSMA-11-IRDye800CW在接種PSMA陽性LNCaP前列腺癌細胞荷瘤裸鼠中的信噪比更高，熒光成像效果更好[35]。因此該研究在大型動物實驗中，將68Ga-PSMA-11-IRDye800CW 按照30 μg/kg注射給2只2～3月齡小豬，并在1 h后對它們順利使用達芬奇手術(shù)機器人進行NIRF引導下前列腺切除術(shù)，進一步驗證68Ga-PSMA-11-IRDye800CW應(yīng)用于臨床的可行性[35]。鑒于68Ga-PSMA-11 PET/CT已在臨床中應(yīng)用及IRDye800CW在臨床試驗中的廣泛應(yīng)用，68Ga-PSMA-11-IRDye800CW有望快速向臨床應(yīng)用進行轉(zhuǎn)化。

3.5 納米染料目前，隨著納米材料的快速發(fā)展，多個納米材料相關(guān)的PSMA靶向染料正在進行臨床前研究。一方面，有研究使用納米材料包裹ICG后在材料表面修飾PSMA靶向短肽從而實現(xiàn)ICG的PSMA靶向前列腺癌成像[36]；另一方面，有研究以聚乳酸-聚乙二醇納米顆粒為載體，通過表面修飾PSMA靶向肽，從而構(gòu)建111In和IRDye800CW標記的雙模探針[37]。另外，研究人員還嘗試使用量子點熒光染料進行PSMA靶向成像，將J591抗體連接量子點近紅外染料Quantum dot 800并用該染料順利對PSMA+前列腺癌C4-2細胞荷瘤鼠進行體內(nèi)成像[38]。但目前納米材料的潛在體內(nèi)毒性等問題導致目前尚無PSMA靶向NIRF納米染料進入臨床試驗。

4 臨床試驗

目前已申請進入臨床試驗的PSMA靶向熒光染料有2項，均為PSMA抗體NIRF染料。一項為ProstaFluor，即HuJ591-IRDye800CW，由Spectros公司申請開展一期、二期臨床試驗(NCT01173146)。另一項為美國希望之城醫(yī)療中心申請的PSMA單克隆抗體MDX1201連接熒光染料A488用于ⅡB/Ⅲ/Ⅳ期前列腺癌患者的熒光引導下腹腔鏡前列腺癌根治術(shù)的臨床試驗(NCT02048150)。

5 挑戰(zhàn)與展望

近年來，PSMA靶向NIRF手術(shù)導航技術(shù)發(fā)展迅速，正處在由臨床前科研階段向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵階段。隨著更多PSMA靶向染料研發(fā)和更多大規(guī)模臨床試驗開展，今后在手術(shù)中實時精準辨別前列腺癌與正常組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和正常淋巴結(jié)將不再困難?？杉せ罴岸嗄B(tài)PSMA靶向近紅外染料有望進一步降低染料信噪比并不斷豐富靶向染料的功能。目前，近紅外Ⅱ區(qū)染料也在迅速發(fā)展，有望為熒光手術(shù)注入新的動力。我們相信隨著人們對靶向NIRF染料的不斷研究，前列腺癌PSMA靶向熒光手術(shù)導航技術(shù)將取得新的突破。