張銀海，關(guān)永暉，羅 成

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆烏魯木齊 835000)

間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征(interstitial cystitis/bladder painful syndrome，IC/BPS)是一種慢性炎癥性疾病，會(huì)導(dǎo)致尿急、夜尿增多和骨盆區(qū)域疼痛[1]，嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量及生活質(zhì)量。有研究表明IC/BPS的發(fā)病率為0.06%～30.00%[2]，男女比例為1∶9[3]，其發(fā)病因素與種族、地區(qū)、性別等多種因素相關(guān)[4]。目前，IC/BPS的發(fā)病機(jī)制、病理生理過(guò)程尚不明確。雖已提出幾種理論，包括糖胺聚糖缺失、隱匿性感染、肥大細(xì)胞的活化和神經(jīng)源性炎癥理論[5]，但是都缺乏明確的證據(jù)。有研究表明自身免疫是IC/BPS發(fā)病過(guò)程中一個(gè)有效的理論[6]。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是迄今為止研究最多、最集中的侵襲性病原體免疫傳感器，主要分布于免疫細(xì)胞，如肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等[7]。TLR4作為T(mén)LRs家族里的明星分子，受到了廣泛關(guān)注[8]。該研究首先通過(guò)膀胱內(nèi)途徑建立雌性SD大鼠IC/BPS模型[9]，測(cè)定實(shí)驗(yàn)組大鼠和對(duì)照組大鼠尿液的組胺水平。然后采用蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)、甲苯胺藍(lán)(tol-uidine blue,TB)染色檢測(cè)人和大鼠膀胱組織中炎癥浸潤(rùn)及肥大細(xì)胞浸潤(rùn)程度，采用免疫組織化學(xué)染色、免疫印跡、實(shí)時(shí)熒光PCR等方法檢測(cè)人和大鼠膀胱組織中TLR4蛋白及基因水平的變化，進(jìn)一步明確TLR4在IC/BPS中的潛在作用，為IC/BPS的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)性IC/BPS大鼠模型的建立及組織準(zhǔn)備自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)入24只、6～8周、體重200～220 g的雌性SD大鼠。將雌性SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，各12只。采用腹腔注射100 g/L的水合氯醛(1 mg/kg)對(duì)大鼠進(jìn)行全身麻醉，固定大鼠，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇和碘酊對(duì)大鼠尿道開(kāi)口消毒，隨后使用無(wú)菌導(dǎo)管經(jīng)尿道插入大鼠膀胱內(nèi)。排空大鼠膀胱尿液，向?qū)嶒?yàn)組大鼠的膀胱先灌注1 mL硫酸魚(yú)精蛋白(protamine sulfate,PS,10 mg/mL)，保留45 min后使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)溶液沖洗；隨后立即向?qū)嶒?yàn)組大鼠膀胱內(nèi)灌注1 mL脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,750 μg/mL)，保留30 min，拔出導(dǎo)管。對(duì)照組用同樣的方法灌注2 mL生理鹽水，兩組大鼠每2 d進(jìn)行1次灌注，為期4周。在最后1次灌注的24 h后，處死各實(shí)驗(yàn)組大鼠。摘除大鼠膀胱，沿著縱軸把膀胱平均分成三個(gè)部分。其中一部分固定于40 g/L多聚甲醛內(nèi)，后續(xù)進(jìn)行HE、TB染色及免疫組織化學(xué)染色；其他2個(gè)部分被及時(shí)儲(chǔ)存在液氮中，后續(xù)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse trans-cription-polymerase chain reaction，RT-PCR)、免疫印跡試驗(yàn)。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物護(hù)理和實(shí)驗(yàn)均按照動(dòng)物研究的生物倫理原理進(jìn)行。

1.2 臨床患者膀胱組織的活檢研究對(duì)象為2018—2020年新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的60例女性患者，平均年齡40～75歲，平均病史6～30個(gè)月。采用病例對(duì)照研究。選取30例患有間質(zhì)性膀胱炎的女性患者作為病例組，臨床表現(xiàn)為6個(gè)月以上的膀胱區(qū)疼痛、尿急、尿頻≥8次/d、排尿后疼痛減輕及憋尿時(shí)加重，膀胱鏡下具有典型的膀胱點(diǎn)狀出血、膀胱壁Hunner潰瘍及相關(guān)組織學(xué)特征，排除神經(jīng)源性膀胱或膀胱逼尿肌無(wú)力、子宮內(nèi)膜異位癥、反復(fù)尿路感染、膀胱癌患者，且均未服影響膀胱功能的藥物。匹配30例性別相同、體重相近(±5 kg)、膀胱鏡下診斷為膀胱癌的患者作為對(duì)照組，排除膀胱鏡下表現(xiàn)為典型間質(zhì)性膀胱炎的患者。在膀胱鏡下采集實(shí)驗(yàn)組患者的膀胱組織和對(duì)照組的癌旁健康膀胱組織后，固定于40 g/L多聚甲醛，后續(xù)行HE染色、TB染色及免疫組織化學(xué)染色。所有參與者均簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 大鼠尿液中組胺的測(cè)定大鼠模型處死前，使用無(wú)菌塑料容器分別采集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠尿液樣本，隨后將尿液于3 000 rpm離心10 min，收集上清并加入生物素抗體工作液50 μL，37 ℃孵育45 min。隨后洗板3次，加入酶結(jié)合物工作液，37 ℃孵育30 min。最后加入顯色劑(鹽酸鹽水合物)，37 ℃避光孵育15 min。孵育結(jié)束后立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(optical density,OD)值。

1.4 HE及TB染色將收集的膀胱組織置于40 g/L多聚甲醛，固定、脫水、包埋制備蠟塊，選擇連續(xù)的切片進(jìn)行染色。HE染色：切片用蘇木精染色10 min，流水下沖洗后，鹽酸分化，伊紅染色2 min，乙醇梯度每組隨機(jī)抽取5個(gè)切片，在200及400倍放大倍數(shù)下觀察所有切片。TB染色：切片入預(yù)熱60 ℃的TB染色液40 min，蒸餾水洗3次，體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇快速分化，脫色。利用Axioplan 2 imaging顯微圖像分析系統(tǒng)(放大倍數(shù)：大鼠模型×200，臨床樣本×400)選擇5個(gè)視野的肥大細(xì)胞，并記錄脫顆粒數(shù)。

1.5 采用RT-PCR檢測(cè)TLR4 mRNA表達(dá)RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組大鼠膀胱組織內(nèi)TLR4 mRNA的表達(dá)。取大鼠膀胱組織，采用Trizol試劑盒提取總RNA，測(cè)定RNA濃度，根據(jù)TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反應(yīng)條件生成對(duì)應(yīng)cDNA模板。引物由上海生工生物公司設(shè)計(jì)并合成：大鼠TLR4上游引物序列：5’-TGG TGGCTGTGGAGACAAAAATGAC-3’，下游引物序列：5’-CTGAAA GGCTTGGGCTTGAATGGAG-3’；以GAPDH為內(nèi)參，其上游引物序列： 5’-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3’，下游引物序列：5’-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3’。每組的引物各加入20 μL反應(yīng)體系，混勻后放入PCR儀。采用2-△△Ct比較樣本mRNA的相對(duì)變化。

1.6 免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)從液氮中取出膀胱組織，在微量天平上稱重，切成小塊(1～2 mm3)。采用PIPA試劑盒(HAT，西安)操作說(shuō)明書(shū)提取組織蛋白，BCA試劑盒(HAT，西安)測(cè)量蛋白質(zhì)濃度，隨后按25 μg/孔行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后250 mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜2 h,洗膜，封閉，進(jìn)行一抗孵育：anti-TLR4抗體(1∶800，Bioss,中國(guó))、anti-β-actin抗體(1∶3 000，Bioss,中國(guó))，4 ℃搖床過(guò)夜，洗膜后于1∶5 000二抗室溫孵育1 h，充分洗膜后，ECL顯色液發(fā)光。

1.7 免疫組織化學(xué)染色將石蠟切片在60 ℃溫度下烤片2 h，二甲苯脫蠟、梯度乙醇入水，使用胃蛋白酶37 ℃孵育1 h，體積分?jǐn)?shù)為0.3%的過(guò)氧化氫孵育30 min，使用血清封閉液封閉組織30 min，隨后切片使用TLR4抗體(1∶200，Bioss,中國(guó))4 ℃孵育過(guò)夜；次日，切片室溫復(fù)溫1 h，滴加酶抗山羊抗兔IgG聚合物孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色，蘇木精染核，鹽酸分化后用中性樹(shù)膠封片。陽(yáng)性細(xì)胞鏡下顯示為黃褐色，用400倍放大倍數(shù)觀察膀胱組織中TLR4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，每個(gè)組織隨機(jī)選取5個(gè)非連續(xù)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)后取均值。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物模型

2.1.1大鼠尿液中的組胺水平 Elisa法檢測(cè)大鼠尿液中組胺表達(dá)水平，結(jié)果顯示IC/BPS組大鼠尿液中組胺水平較對(duì)照組顯著升高(圖1)。

圖1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠尿液中組胺含量(＊P<0.05)

2.1.2各組大鼠膀胱組織炎性變化 HE染色顯示，與對(duì)照組相比，IC/BPS雌性大鼠膀胱黏膜上皮變薄、充血水腫，固有層浸潤(rùn)，膀胱組織可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；對(duì)照組膀胱上皮完整，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2A)。TB染色肥大細(xì)胞呈紫色顯示IC/BPS雌性大鼠膀胱壁上皮嚴(yán)重?fù)p傷，肥大細(xì)胞數(shù)目急劇增多，且多分布于黏膜下層，主要呈脫顆粒狀態(tài)肥大細(xì)胞存在(圖2A)。對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠膀胱組織內(nèi)肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)IC/BPS組大鼠膀胱組織內(nèi)肥大細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組顯著增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2B)。

A:HE染色(×200),TB染色(×200);B：IC/BPS組及對(duì)照組膀胱組織內(nèi)肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)，***P<0.05。圖2 兩組大鼠膀胱HE染色及TB染色結(jié)果

2.1.3實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠膀胱組織TLR4的表達(dá) 本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)TLR4在IC/BPS組大鼠及對(duì)照組大鼠膀胱組織內(nèi)mRNA及蛋白表達(dá)水平。RT-PCR分析顯示，IC/BPS大鼠膀胱中TLR4基因表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3A)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，IC/BPS組TLR4蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05，圖3B)。針對(duì)大鼠膀胱組織標(biāo)本免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(圖3C)，TLR4陽(yáng)性細(xì)胞被染為棕色，主要表達(dá)于膀胱黏膜層，IC/BPS組大鼠膀胱組織內(nèi)TLR4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組顯著增高(P<0.05，圖3D)。

A:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠膀胱組織的TLR4基因水平比較，***P<0.005；B:兩組TLR4蛋白水平比較；C：大鼠膀胱組織標(biāo)本免疫組織化學(xué)染色(×400)；D:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組膀胱組織的TLR4陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，***P<0.05。圖3 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠膀胱組織TLR4的表達(dá)

2.2 臨床樣本

2.2.1HE染色及TB染色 HE染色所見(jiàn)與大鼠IC/BPS模型相一致，IC/BPS患者膀胱組織可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，膀胱黏膜上皮損傷，剝脫并可見(jiàn)組織充血水腫等；與IC/BPS組相比，正常組膀胱上皮完整，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4A)。TB染色發(fā)現(xiàn)，IC/BPS患者膀胱黏膜固有層和逼尿肌中可見(jiàn)肥大細(xì)胞浸潤(rùn)，肥大細(xì)胞脫顆粒現(xiàn)象嚴(yán)重(圖4A)；與對(duì)照組相比，IC/BPS患者膀胱組織中肥大細(xì)胞數(shù)目顯著增多，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4B)。

A：HE及TB染色(×400)；B：對(duì)照組及IC/BPS組患者膀胱組織內(nèi)肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)，***P<0.001。圖4 臨床樣本膀胱組織HE染色及TB染色

2.2.2兩組膀胱黏膜組織中TLR4的表達(dá)情況 為證實(shí)女性IC/BPS患者膀胱組織內(nèi)TLR4的表達(dá)水平，對(duì)女性IC/BPS患者膀胱組織和對(duì)照組癌旁健康膀胱組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。與大鼠模型一致，免疫組織化學(xué)染色顯示，間質(zhì)性膀胱炎組TLR4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，***P<0.05，圖5。

A：TLR4陽(yáng)性染色細(xì)胞免疫組化染色呈現(xiàn)黃棕色(×400);B：IC/BPS組患者膀胱組織及對(duì)照組癌旁健康膀胱組織中TLR4陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，***P<0.001。圖5 臨床樣本膀胱組織中TLR4的表達(dá)

3 討 論

歐洲間質(zhì)性膀胱炎研究學(xué)會(huì)(European Society for Study of interstitial cystitis，ESSIC)指出IC/BPS的臨床診斷為6個(gè)月以上的與膀胱相關(guān)的骨盆疼痛或不適，并至少伴有一種尿道癥狀，如尿急或尿頻[10]。值得注意的是，近年來(lái)，我國(guó)IC/BPS的確診率不斷上升，對(duì)患者的身心健康造成極為消極的影響。臨床診療中，IC/BPS的治療包括：神經(jīng)調(diào)節(jié)、膀胱沖洗、手術(shù)及藥物治療等，但均未獲得滿意的臨床療效[11]。因此，研究IC/BPS的發(fā)病機(jī)制并尋找新的治療方法具有重要的臨床意義。TLR4已被證實(shí)表達(dá)于人和鼠的膀胱組織[12]，并在膀胱腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了重要作用[13-14]。近年來(lái)，TLR4在心肌、肝臟及腦缺血等非生物性炎癥損傷研究較多[15]，而在IC/BPS發(fā)病機(jī)制中的作用尚未可知。

有研究表明間質(zhì)性膀胱炎患者的膀胱活檢標(biāo)本中可見(jiàn)抗核抗體，這提示IC/BPS可能是一種自身免疫性疾病。IC/BPS與自身免疫性疾病還具有很多相似點(diǎn)，如好發(fā)于中年女性、部分患者有過(guò)敏史，患者中罹患類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等概率明顯高于正常人，免疫抑制劑治療有效[16]。TLR4受體是TLR家族的成員之一，屬于Ⅰ類跨膜受體，參與機(jī)體免疫應(yīng)答啟動(dòng)環(huán)節(jié)[17]。該受體以病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associat-ed molecular patterns，PAMP)識(shí)別配體，如革蘭陰性菌細(xì)胞壁成分的脂多糖、脂寡糖、細(xì)菌內(nèi)毒素和病毒、真菌等，還以危險(xiǎn)/損害相關(guān)分子模式(danger/damage-associated molecular patterns，DAMP)識(shí)別內(nèi)源性配體，如對(duì)感染產(chǎn)生的各種內(nèi)源性分子，啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而參與機(jī)體的固有免疫與獲得性免疫造成組織損傷[18-19]。TLR4的激活是機(jī)體抵抗外界的第一道防線，但信號(hào)的過(guò)度活化也會(huì)導(dǎo)致高水平炎性細(xì)胞因子的分泌，從而加重細(xì)胞的損傷，打破機(jī)體對(duì)自身抗原的免疫耐受，促進(jìn)自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[20]。在本研究中，通過(guò)建立IC/BPS大鼠模型和臨床收集女性IC患者的膀胱組織，證實(shí)在IC/BPS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中TLR4受體表達(dá)水平顯著上調(diào)，因此推測(cè)TLR4在IC/BPS發(fā)病過(guò)程中具有一定作用。

迄今為止尚無(wú)診斷IC/BPS的金標(biāo)準(zhǔn)[21]。因?yàn)槿鄙偬禺愋员憩F(xiàn)，IC/BPS的診斷更多傾向于臨床癥狀。美國(guó)泌尿外科指南建議采取排除性診斷方法來(lái)診斷IC/BPS，必要時(shí)可行膀胱鏡檢查和病理活檢。有研究顯示IC/BPS的主要病理變化是肥大細(xì)胞在膀胱肌層和黏膜下層活化和聚集[22]，肥大細(xì)胞的功能是釋放炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子。它的胞質(zhì)中含有大量的分泌顆粒，當(dāng)受到刺激應(yīng)答時(shí)，肥大細(xì)胞就會(huì)脫顆粒釋放多種血管活性物質(zhì)參與免疫應(yīng)答，例如組胺、前列腺素、白三烯、血小板活化因子等。這些生物活性物質(zhì)可導(dǎo)致神經(jīng)元致敏和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，進(jìn)一步刺激肥大細(xì)胞，這種惡性循環(huán)可能導(dǎo)致了IC/BPS慢性疼痛的癥狀[23]。本研究中IC/BPS建模時(shí)先向膀胱內(nèi)灌注1 mL硫酸魚(yú)精蛋白破壞大鼠的膀胱黏膜屏障，再灌注1 mL脂多糖，進(jìn)一步通過(guò)損傷的膀胱黏膜滲透入膀胱基質(zhì)，從而造成一系列的炎癥反應(yīng)。有研究表明肥大細(xì)胞分布有廣泛的TLR4受體[19]，當(dāng)膀胱肌層肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)超過(guò)20個(gè)/mm2，IC/BPS的診斷特異度和敏感度分別為88%和95%[24]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR、蛋白免疫印跡、免疫組織化學(xué)染色等證實(shí)IC/BPS大鼠膀胱組織中TLR4 mRNA及蛋白水平的變化，較對(duì)照組顯著增高(P<0.05)。臨床樣本中，IC/BPS患者膀胱組織中TLR4蛋白水平急劇增高(P<0.05)。因此，我們推測(cè)靶向TLR4治療可能會(huì)為IC/BPS的臨床診療提供新的視角。

TLR4與配體結(jié)合后形成TLR4/MD-2復(fù)合物并二聚化，與MyD88的TIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合后激活MyD88，形成有活性的TLR4/MyD88復(fù)合物，激活I(lǐng)L-1R相關(guān)激酶4(IL-1R-associated kinase4，IRAK4)，使IRAK1和IRAK2磷酸化后與TRAF6結(jié)合，活化IκB激酶(inhibitor of nuclear factor-κB kinase，IKK)，促使NF-κB抑制因子(inhibitor of nuclearfactor-κB，IκB)磷酸化后從NF-κB上脫落，使NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核并激發(fā)后續(xù)反應(yīng)[25]，最終導(dǎo)致細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的釋放，引起免疫應(yīng)答反應(yīng)。下一步的研究將通過(guò)測(cè)定TLR4啟動(dòng)免疫反應(yīng)后的下游分子NF-κB、P-NF-κB和MyD88的表達(dá)水平，進(jìn)一步探討TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路在間質(zhì)性膀胱炎的潛在作用。

綜上所述，對(duì)TLR4受體在間質(zhì)性膀胱炎作用機(jī)制的進(jìn)一步研究，將有助于闡明固有免疫的啟動(dòng)與機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)性損傷之間的聯(lián)系，并指出抑制TLR4的表達(dá)水平可能對(duì)患者IC/BPS的治療有益。相信隨著對(duì)TLR4研究的不斷深入，會(huì)為臨床疾病的治療帶來(lái)新思路。

本研究局限性在于：①本實(shí)驗(yàn)例數(shù)較少，需更大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證；②本研究提示TLR4在IC/BPS發(fā)病過(guò)程中具有一定作用。針對(duì)其具體的分子機(jī)制尚未說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)尚在進(jìn)行中，后期將會(huì)整理并發(fā)表。