張峪涵，付暉，劉翠娟，廖成鉅，羅昊棟

(1.東莞市松山湖中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，廣東 東莞 523326; 2. 廣東醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 東莞 524023)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種與衰老有關(guān)的神經(jīng)退行性疾病[1]。其主要病理特征是相關(guān)腦區(qū)中神經(jīng)纖維纏結(jié)和由β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)組成的老年斑沉積[2]。Aβ寡聚體沉積具有神經(jīng)毒性，可促發(fā)神經(jīng)元凋亡，是引發(fā)AD的重要機(jī)制之一[3]。微小RNA(miRNAs)是一類長(zhǎng)21～23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，廣泛存在于人類大腦組織中，與神經(jīng)元凋亡、增殖、分化等有關(guān)[4]。miR-223是miRNA的一種,因在很多惡性腫瘤或炎癥組織中呈低表達(dá)而受到普遍關(guān)注[5]。2020年，Serpente等[6]通過(guò)研究AD進(jìn)展過(guò)程中miRNAs網(wǎng)絡(luò)的變化發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，miR-223在AD患者腦脊液和血液樣本中表達(dá)量顯著下調(diào)。但是，miR-223的特異性作用機(jī)制，如AD的相關(guān)靶點(diǎn)和通路尚未完全清楚。本研究以寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元為研究模型，通過(guò)調(diào)控miR-223和RhoB的表達(dá)來(lái)觀察其對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響，為AD的預(yù)防或治療提供新的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)新生1 d的SD雄性大鼠12只，購(gòu)自山西省腫瘤研究所。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(晉)2017-0001。

1.2 主要儀器及試劑

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Forma Scientific公司，倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó) Beckman Coulter公司，0.25%胰酶/EDTA、Aβ1-42、多聚右旋賴氨酸購(gòu)自Sigma公司，PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，Bcl-2單克隆抗體、Bax單克隆抗體、caspase-3單克隆抗體、RhoB單克隆抗體、β-actin單克隆抗體和二抗均購(gòu)自賽信通(上海)生物試劑有限公司, miR-223 mimics、mimics control、si-RhoB和si-con均購(gòu)自百奧邁科生物技術(shù)有限公司,轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購(gòu)自上海陽(yáng)光生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海馬神經(jīng)元細(xì)胞分離和培養(yǎng) 用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒SD大鼠，腹腔注射10%水合氯醛(5 ml·kg-1)麻醉后，斷頭取全腦，在無(wú)菌條件下分離海馬組織。本研究得到了醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。將海馬組織置于預(yù)冷磷酸鹽緩沖液中，去除血管和筋膜后切成1 mm3小塊。用含15% 胎牛血清的DMEM/F12懸浮海馬神經(jīng)元。以1 000 r·min-1離心5 min后，將海馬神經(jīng)元重新分散于DMEM/F12(15%FBS)中，密度為3× 105ml-1。將海馬神經(jīng)元接種至多聚賴氨酸預(yù)先包被的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24、72 h。后更換為含有阿糖胞苷(質(zhì)量濃度為2.5 mg·L-1)的新鮮培養(yǎng)基代替(阿糖胞苷能抑制成纖維細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng))。連續(xù)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元7 d，倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化。

1.3.2 海馬神經(jīng)元細(xì)胞免疫熒光染色 將海馬神經(jīng)元接種于6孔板中，孵育7 d后用4%多聚甲醛固定20 min。10%山羊血清白蛋白阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)30 min，4 ℃條件下用小鼠抗大鼠微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated protein-2，MAP-2)單克隆抗體孵育12 h，加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二級(jí)抗體室溫培養(yǎng)2 h。用Hoechst 33258(50 g·ml-1)逆染1 h。清洗3次，干燥過(guò)量液體后倒置熒光顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元。在同一視野內(nèi)，用不同的激發(fā)光分別獲得神經(jīng)元和神經(jīng)元核的熒光圖像。使用Image Pro 6.0軟件測(cè)量每個(gè)視野海馬神經(jīng)元的最長(zhǎng)神經(jīng)突長(zhǎng)度。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的神經(jīng)元細(xì)胞隨機(jī)分為空白組(不作任何轉(zhuǎn)染處理)、陰性組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-223-m組(轉(zhuǎn)染miR-223 mimics)、miR-223-m+LV組(轉(zhuǎn)染miR-223 mimics+慢病毒骨架)、miR-223-m+LV-RhoB組(轉(zhuǎn)染miR-223 mimics+RhoB過(guò)表達(dá)載體)。參照脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000 說(shuō)明書操作步驟轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.4 寡聚態(tài)Aβ1-42的制備及應(yīng)用 參考文獻(xiàn)[4]制備寡聚態(tài)Aβ1-42：取1 mg凍干粉Aβ1-42經(jīng)有機(jī)溶劑HFIP室溫孵育1 h處理后真空風(fēng)干，用少量DMSO助溶后溶解于無(wú)血清的DMEM-F12低糖培養(yǎng)基中,配成100 μmol·L-1濃度的母液，4 ℃孵育24 h后，每組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞加入Aβ1-42寡聚肽片段30.0 μmol·L-1孵育48 h。

1.3.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 將密度為1×103ml-1海馬神經(jīng)元接種于96孔板上，每孔接種100 μl(含2.5 mg·L-1阿糖胞苷)。培養(yǎng)24 h后，用不同濃度的Aβ1-42(0、10、20、30、40、50 μmol·L-1)誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元。以0 μmol·L-1Aβ1-42為陰性對(duì)照。培養(yǎng)48 h后加入20 μl·孔-1MTT溶液(5 mg·ml-1)，37 ℃培養(yǎng)4 h，加入150 μl二甲基亞砜，振動(dòng)10 min，促進(jìn)紫晶完全溶解。在微板閱讀器上檢測(cè)每個(gè)孔490 nm的吸光度(OD490 nm)值，計(jì)算每組海馬神經(jīng)元的存活率。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 每組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞加入Aβ1-42寡聚肽片段30.0 μmol·L-1孵育48 h。將各組細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，離心收集，加入200 μl緩沖液制備細(xì)胞懸液。分別加入5 μl 的Annexin V-/FITC和PI混合均勻，室溫避光孵育15 min后，再次加入200 μl緩沖液，置于流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.3.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 構(gòu)建 WT-RhoB(含RhoB 3′UTR片段)和MUT-RhoB(含RhoB 3′UTR片段突變體)的熒光素酶報(bào)告載體，采用LipofectamineTM2000分別將WT-RhoB及MUT-RhoB與miR-223 mimics、miR-223 inhibitor或miR-NC共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒技術(shù)說(shuō)明書操作，記錄螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶激發(fā)值，以兩者的比值評(píng)價(jià)RhoB基因的激活程度。

1.3.8 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 用TRIzol液裂解細(xì)胞后，提取總的RNA。取1 μg RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書用于合成cDNA。取1.0 μg cDNA用Fast Start Universal SYBR Green Master mix試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)變性95 ℃ 10 min，隨后40個(gè)循環(huán)(變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 34 s)。miR-223引物：正向5′-TCCGAAGTGTACCTCAAC-3′，反向5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。U6 mRNA引物：正向5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。RhoB mRNA引物：正向5′-AGTAAGGACGAGTTCCCCGA-3′，反向5′-GGTGAAGGGCGAACATCTGA-3′。GAPDH引物：正向5′-GGTGCTGAGTATGTCGTGGAGT-3′，反向5′-CAGTCTTCTGAGTGGCAGTGATG-3′。miR-223表達(dá)歸一化為U6， RhoB mRNA表達(dá)歸一化為GAPDH。采用2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.3.9 Western blotting實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞加入適量RIPA裂解液裂解后，提取總蛋白，并用BCA法測(cè)定神經(jīng)元中的蛋白量。提取的蛋白與loading buffer充分混合后，置于100 ℃煮沸5 min，變性后進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳。電泳后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉2 h后，加入Ⅰ抗[caspase-3(1∶500)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、RhoB(1∶500)、GAPDH(1∶1 000)]4 ℃ 孵育過(guò)夜。次日，Ⅱ抗37 ℃孵育2 h后顯影。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 21.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用雙尾t檢驗(yàn)；多組間比較采用方差分析或單因素重復(fù)測(cè)量的方差分析，然后采用SNK-q法進(jìn)行兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 海馬神經(jīng)元分離培養(yǎng)和鑒定

培養(yǎng)4～6 h，大部分海馬神經(jīng)元粘連形成突觸。相鄰神經(jīng)細(xì)胞突觸間的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在3～7 d形成。海馬神經(jīng)元分布均勻，胞體完全伸展，呈錐體狀，有長(zhǎng)軸突和1～2個(gè)樹突。用神經(jīng)元特異性標(biāo)志物(MAP-2)進(jìn)行熒光標(biāo)記后，顯示海馬神經(jīng)元純度達(dá)(94.2±3.6)%，可滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的要求(圖1)。

A. 接種后3 d、4～6 h、7 d時(shí)海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察； B. 免疫熒光雙染法觀察大鼠海馬神經(jīng)元特征

2.2 Aβ1-42對(duì)海馬神經(jīng)元存活率的影響

經(jīng)MTT法檢測(cè)，不同濃度的Aβ1-42(0、10、20、30、40、50 μmol·L-1)誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元48 h時(shí)，隨著作用濃度的升高，細(xì)胞存活率逐漸降低。當(dāng)濃度超過(guò)30 μmol·L-1時(shí)，海馬神經(jīng)元的活力明顯受到抑制，存活率<80%(F=118.530，P<0.05)(圖2A)。

2.3 Aβ1-42對(duì)海馬神經(jīng)元miR- 223和RhoB表達(dá)的影響

經(jīng)qRT-PCR和Western blotting法檢測(cè)，不同濃度的Aβ1-42(0、10、20、30、40、50 μmol·L-1)誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元48 h時(shí)，隨著作用濃度的升高，細(xì)胞miR-223相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，同時(shí)RhoB蛋白表達(dá)逐漸升高(F值分別為39.849、77.243，均P<0.05，圖2B和圖2C)。但是當(dāng)Aβ1-42≥30 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞miR-223表達(dá)變化不是很明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.983，P>0.05)，因此選擇Aβ1-4230μmol·L-1用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 過(guò)表達(dá)miR- 223對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響

經(jīng)qRT-PCR法檢測(cè)，miR-223-m組細(xì)胞miR-223相對(duì)表達(dá)量較空白組和陰性組升高(F=68.215，P<0.05)；而與miR-223-m組及miR-223-m+LV組相比，miR-223-m+LV-RhoB組RhoB mRNA相對(duì)表達(dá)量也升高(F=129.650，P<0.05)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)，經(jīng)Aβ1-42寡聚肽片段30.0 μmol·L-1孵育48 h后，與空白組及陰性組相比，miR-223-m組細(xì)胞凋亡率降低；而與miR-223-m組及miR-223-m+LV組相比，miR-223-m+LV-RhoB組細(xì)胞凋亡率升高(F=11.915，P<0.05)(圖3)。

2.5 過(guò)表達(dá)miR- 223對(duì)海馬神經(jīng)元RhoB蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blotting法檢測(cè)，空白組、陰性組、miR-223-m組、miR-223-m+LV組和miR-223-m+LV-RhoB組RhoB、Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為27.815、18.790、21.331、7.843，P<0.05)；與空白組及陰性組相比，miR-223-m組細(xì)胞RhoB、Bax和caspase-3蛋白表達(dá)降低，同時(shí)Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，而與miR-223-m組及miR-223-m+LV組相比，miR-223-m+LV-RhoB組細(xì)胞RhoB、Bax和caspase-3蛋白表達(dá)升高，同時(shí)Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖4。

A. MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活情況；B. qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞miR-223相對(duì)表達(dá)量；C. Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞RhoB蛋白表達(dá)情況

2.6 miR- 223與RhoB的靶向關(guān)系

通過(guò)miRcode預(yù)測(cè)到RhoB 3′UTR存在2個(gè)與miR-223相結(jié)合的位點(diǎn)。雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-223 mimics分別和含有兩個(gè)假定的miR-223結(jié)合序列的熒光素酶構(gòu)建的RhoB 3′-UTR共轉(zhuǎn)染后，熒光活性顯著降低(F=165.73，P<0.05)，同樣，miR-223 inhibitor與RhoB 3′-UTR共轉(zhuǎn)染后，熒光活性顯著升高(F=89.435，P<0.05)，表明它們之間存在直接相互作用。見圖5。

3 討 論

隨著近年來(lái)對(duì)AD發(fā)病機(jī)制的深入研究，Aβ寡聚體觸發(fā)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡引起了大量學(xué)者的關(guān)注[7]。據(jù)報(bào)道，Aβ1-42主要用于建立AD細(xì)胞模型。本研究原代海馬神經(jīng)元被成功地分離和培養(yǎng)，而經(jīng)Aβ1-42處理后可抑制海馬神經(jīng)元活動(dòng)，并以劑量依賴性方式促進(jìn)其凋亡。綜合考慮細(xì)胞存活率、miR-223表達(dá)量的差異，選用30 μmol·L-1的Aβ1-42以成功地誘導(dǎo)AD細(xì)胞模型。miR-223在Aβ1-42轉(zhuǎn)導(dǎo)的海馬神經(jīng)元中表達(dá)下調(diào)，同時(shí)RhoB表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步的深入研究表明，miR-223通過(guò)靶向抑制RhoB蛋白的表達(dá)，阻止了海馬神經(jīng)元的凋亡。

RhoB作為GTPase信號(hào)分子家族中的一個(gè)較為獨(dú)特的分子，通過(guò)與下游靶蛋白相互作用，進(jìn)而誘導(dǎo)多種細(xì)胞反應(yīng)，包括調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白骨架和基因轉(zhuǎn)錄等[8]。RhoB與RhoA及RhoC一起，共同構(gòu)成Rho亞家族。Rho亞家族各成員是細(xì)胞分裂、細(xì)胞遷移、傷口愈合或免疫監(jiān)視等多種細(xì)胞和生理過(guò)程中的關(guān)鍵介質(zhì)，其功能失調(diào)與不同的人類疾病有關(guān)[9]。這3個(gè)蛋白質(zhì)有高度的相似性(87%以上的氨基酸序列具有同源性)。但是與RhoA及RhoC相反，RhoB是由一個(gè)外顯子編碼的蛋白分子，它被認(rèn)為是在脊椎動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中從RhoA反向拷貝整合而來(lái)[10]。目前關(guān)于RhoB研究最廣泛的是在腫瘤領(lǐng)域。楊鵬春等[11]通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-223可能靶向作用于RhoB，進(jìn)而影響結(jié)直腸癌的發(fā)展及轉(zhuǎn)移。在許多類型的細(xì)胞中，RhoB基因表達(dá)是由損壞的DNA刺激引起的，說(shuō)明RhoB可能參與了DNA 損傷信號(hào)機(jī)制的某些下游水平，進(jìn)而成為細(xì)胞死亡效應(yīng)器或死亡信號(hào)修飾器。他汀類藥物與降低AD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，其可能機(jī)制在于抑制類異戊二烯途徑，調(diào)節(jié)小GTP酶RhoA、B和C分子的活性[12]。因此，小分子RhoB可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理反應(yīng)最重要的介導(dǎo)因子之一。在中毒或創(chuàng)傷性刺激下，RhoB在神經(jīng)元中的表達(dá)量會(huì)迅速上調(diào)，RhoB有望成為神經(jīng)退行性疾病嚴(yán)重性的重要預(yù)測(cè)分子[13]，但是目前關(guān)于RhoB在AD進(jìn)展中的作用尚不明確。

a 與空白組相比，P<0.05; b 與陰性組相比，P<0.05; c 與miR-223-m組及miR-223-m+LV組相比，P<0.05

a 與空白組相比，P<0.05; b 與陰性組相比，P<0.05; c 與miR-223-m組相比，P<0.05

圖5 miR-223和RhoB存在靶向結(jié)合關(guān)系

通過(guò)miRcode預(yù)測(cè)到RhoB 3′UTR存在2個(gè)與miR-223相結(jié)合的位點(diǎn)；雙熒光素酶報(bào)告基因分析也進(jìn)一步證實(shí)了miR-223對(duì)于RhoB表達(dá)具有一定的靶向調(diào)控作用。miR-223參與多種細(xì)胞病理過(guò)程的調(diào)節(jié)，如癌癥、自身免疫性疾病和炎癥性疾病。既往miR-223被認(rèn)為是NLRP3炎癥小體的陰性調(diào)節(jié)因子。慢性炎癥體激活為神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)基本特征，是由包括淀粉樣β蛋白和α-突觸核蛋白在內(nèi)的錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)聚集體引起的，導(dǎo)致促炎癥細(xì)胞因子的分泌和神經(jīng)炎癥的傳播[14]。Mancuso等[15]也通過(guò)人體血液樣本證實(shí)，與健康人群相比，miR-223在AD患者、帕金森患者、輕度認(rèn)知功能障礙者人群血清中表達(dá)量降低。miR-223有望成為鑒別診斷神經(jīng)退行性疾病的潛在非侵入性生物標(biāo)志物。在本研究miR-223對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元生物學(xué)行為的影響結(jié)果提示，miR-223通過(guò)抑制RhoB的表達(dá)，進(jìn)而增加海馬神經(jīng)元活性，并抑制其凋亡，說(shuō)明miR-223/RhoB軸在損傷神經(jīng)元修復(fù)和再生中具有重要作用，但本研究的不足之處是還未探討RhoB是如何調(diào)控Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白的表達(dá)量，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，Aβ1-42誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元中miR-223表達(dá)下調(diào)，同時(shí)RhoB表達(dá)下調(diào)。miR-223通過(guò)靶向抑制RhoB表達(dá)阻止AD海馬神經(jīng)元的凋亡。