張化濤 高麗萍 李秀君 楊 勇

肝細胞癌(HCC)是一種常見的惡性腫瘤，患者預后不良的發(fā)生率較高，嚴重威脅著人們的生命健康[1]。有研究報道，HCC是全球惡性腫瘤相關死亡的第3大原因[2]。2018年一項全球范圍的調(diào)查結果顯示，由HCC導致死亡的人數(shù)占惡性腫瘤總死亡人數(shù)的8.2%左右[3]。現(xiàn)有的預測HCC患者預后的指標存在敏感度較低或特異度較低等不足[4-6]，因此，探尋敏感度和特異度均較高的生物標志物以準確預測HCC患者的預后情況具有重要意義。

研究表明，RhoA/ROCK信號轉導通路可通過影響細胞骨架蛋白重構，或者調(diào)控細胞血管形成擬態(tài)的生成，參與HCC細胞的侵襲、轉移過程[7-8]。RhoA/ROCK信號轉導通路的主要信號分子包括RhoA、ROCK、肌球蛋白磷酸酶靶亞基1(MYPT1)和磷酸化MYPT1[9]。由此推測，檢測HCC組織中MYPT1的表達水平對于預測HCC患者的預后情況具有一定參考價值。本文探究了MYPT1與HCC患者的臨床病理特征及預后的關系，以期為HCC預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2013年3月至2015年1月在勝利石油管理局臨盤醫(yī)院確診的113例HCC患者作為研究對象，經(jīng)手術切除或經(jīng)皮穿刺獲取患者的HCC組織和癌旁組織(距腫瘤病灶邊緣>2 cm)，于液氮罐中保存。參照《原發(fā)性肝癌規(guī)范化診治專家共識》[10]診斷HCC。納入標準：(1)接受肝臟活體組織病理檢查；(2)確診為HCC；(3)病理資料完整；(4)簽署了知情同意書。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)合并自身免疫性疾??；(3)年齡>70歲；(4)預計生存期<3個月。113例HCC患者中，男性78例，女性35例，年齡47～70歲，平均年齡為(62.10±5.74)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(批件號：201300118)。

1.2 方法

1.2.1 臨床數(shù)據(jù)收集 應用CT檢查收集HCC患者的腫瘤數(shù)量、腫瘤直徑及血管侵犯情況等；應用病理切片檢查了解HCC病灶的分化程度；采用ELISA法檢測乙型肝炎表面抗原(HBsAg)水平；采用放射免疫法檢測甲胎蛋白(AFP)水平。根據(jù)HCC患者有無肝性腦病、腹水、總膽紅素、白蛋白、凝血酶原時間判定Child-Pugh分級情況，各項分值為1～3分，總分為各項得分之和，5～6分為A級，7～9分為B級，≥10分為C級。

1.2.2 HCC組織中MYPT1水平檢測 采用蛋白質(zhì)印跡法檢測HCC及癌旁組織中MYPT1的表達水平。實驗步驟如下：首先，加入細胞裂解液裂解肝臟組織細胞，4 ℃下3 500 r/min離心15 min，離心半徑為8 cm，采用BCA試劑盒(購自上海吉至生化科技有限公司)進行蛋白定量。然后，依次進行電泳、轉膜、封閉，在4 ℃下孵育兔抗人MYPT1抗體(1∶500，購自武漢菲恩生物科技有限公司)過夜，次日室溫下孵育二抗(1∶3 000，購自武漢菲恩生物科技有限公司)1 h。最后，應用ChemiDocTMXRS凝膠成像系統(tǒng)(購自美國Bio-Rad公司)成像，并用ImageJ軟件分析實驗結果。

1.2.3 隨訪 采用電話方式收集113例HCC患者的5年預后生存情況。于患者出院后1個月開始隨訪，每月隨訪1次，隨訪終點為2020年1月18日或者患者死亡，中位隨訪時間為47個月。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 MYPT1在HCC組織和癌旁組織中的表達水平

結果顯示，MYPT1在HCC組織中的相對表達量為0.44±0.16，低于癌旁組織(1.06±0.16)，兩組差異有統(tǒng)計學意義(t=29.927，P<0.001)，見圖1。

注：T指HCC組織，N指癌旁組織圖1 MYPT1表達的蛋白電泳圖

2.2 MYPT1與HCC臨床病理特征的關系

如表1所示，MYPT1與HCC患者的年齡、性別、腫瘤數(shù)量、分化程度和HBsAg無關(P均>0.05)，而與腫瘤直徑、Child-Pugh分級、AFP和血管侵犯有關(P均<0.05)。MYPT1在腫瘤直徑≥5 cm、Child-Pugh分級為B級、AFP≥40 μg/L、存在血管侵犯的HCC患者腫瘤組織中的表達水平分別低于腫瘤直徑<5 cm、Child-Pugh分級為A級、AFP<40 μg/L、無血管侵犯的患者，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

表1 MYPT1與HCC臨床病理特征的關系

2.3 MYPT1預測HCC患者預后的效能

113例HCC患者1年、3年和5年的生存率分別為92.04%(104/113)、85.84%(97/113)和37.17%(42/113)。MYPT1預測HCC患者預后生存的ROC曲線下面積(AUC)為0.895(95%CI：0.824～0.945)，最大約登指數(shù)為0.671，最佳截斷值為0.39，敏感度為71.83%，特異度為95.24%，見圖2。

圖2 MYPT1預測HCC患者預后生存的ROC曲線

2.4 MYPT1與HCC患者預后的關系

以MYPT1預測HCC患者預后的最佳截斷值將113例HCC患者分為高表達組(MYPT1≥0.39，n=65)和低表達組(MYPT1<0.39，n=48)。高表達組的中位生存時間長于低表達組(60個月比39個月)，兩組差異有統(tǒng)計學意義(log-rankχ2=38.025，P<0.001)，見圖3。將HCC患者的預后生存情況作為因變量，將可能與HCC患者預后有關的因素，包括年齡、性別、腫瘤數(shù)量、腫瘤直徑、分化程度、HBsAg、Child-Pugh分級、AFP、MYPT1和血管侵犯作為自變量納入Cox單因素回歸分析，結果顯示腫瘤直徑、Child-Pugh分級、MYPT1和血管侵犯與HCC患者預后有關(P<0.05)。將Cox單因素回歸分析中可能與HCC患者預后有關的因素(P<0.1)，包括性別、腫瘤直徑、Child-Pugh分級、MYPT1及血管侵犯作為自變量，將HCC患者的預后生存情況作為因變量納入Cox多因素回歸分析，結果顯示血管侵犯是HCC患者預后生存的獨立危險因素(P<0.05)，MYPT1是HCC患者預后生存的獨立保護因素(P<0.05)，見表2。

圖3 MYPT1高表達組和低表達組的預后生存曲線

表2 影響HCC患者預后生存的單因素和多因素Cox比例風險回歸分析

3 討論

MYPT1基因可表達于機體的多種組織中，在平滑肌細胞中的表達水平較高[11-12]。MYPT1在腫瘤進展中發(fā)揮著重要作用，可調(diào)控細胞周期、侵襲和轉移[13]。研究表明，MYPT1在胃癌和前列腺癌組織中的表達水平較低；過表達MYPT1可抑制胃癌細胞增殖和轉移，而抑制MYPT1表達可促進人前列腺癌血管生成，并影響患者預后[14-15]。由此推測，檢測HCC組織中MYPT1的表達水平可能有助于了解患者的預后情況。

本研究采用蛋白質(zhì)印跡法檢測HCC組織及癌旁組織中MYPT1的表達水平，結果顯示MYPT1在HCC組織中的表達水平低于癌旁組織，這提示MYPT1可能參與了HCC的發(fā)病及進展過程。本研究結果顯示，腫瘤直徑≥5 cm、Child-Pugh分級為B級、AFP≥40 μg/L和存在血管侵犯的HCC患者腫瘤組織中MYPT1的表達水平較低，這提示MYPT1可能通過調(diào)節(jié)HCC患者腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移及AFP水平，進而參與HCC的發(fā)病和進展，并影響HCC患者的預后生存情況。本研究構建了MYPT1預測HCC患者預后生存情況的ROC曲線，結果顯示AUC、敏感度和特異度分別為0.895、71.83%和95.24%，這提示MYPT1預測HCC患者的預后生存情況具有較高效能，但敏感度較低。此外，本研究結果顯示，MYPT1高表達組的中位生存時間長于低表達組，進一步表明MYPT1與HCC患者的預后生存關系密切，其表達水平越高提示HCC患者的預后生存期越長。杜培源等[16]研究指出，存在微血管侵犯的HCC患者發(fā)生預后不良的風險較高，其是HCC患者術后生存的獨立危險因素。本研究采用單因素和多因素Cox比例風險回歸模型分析影響HCC患者預后生存的相關因素，結果顯示血管侵犯是HCC患者預后生存的獨立危險因素，與上述研究結果相符。此外，本研究結果還顯示MYPT1是HCC患者預后生存的獨立保護因素。

綜上所述，MYPT1在HCC組織中低表達，且MYPT1表達水平越低，提示HCC患者預后生存期越短。檢測HCC組織中MYPT1的表達水平有助于預測患者的預后生存情況，為臨床治療提供參考。本課題組今后將進一步探究MYPT1參與HCC發(fā)病和進展的病理、生理機制。