王 雯 蒲 育 趙東利

食管鱗狀細胞癌(ESCC)是生物學上具有侵襲性的惡性腫瘤之一，患者的預后較差，5年生存率為15%～25%[1]。近年來，雖然ESCC的臨床診斷及綜合治療取得了一定進展，但是患者預后的改善程度仍較低。因此，探究預測效能較高的指標以評估ESCC患者的預后情況具有重要意義，有助于臨床醫(yī)師制定個性化的治療方案。

右開放閱讀框激酶2(RIOK2)是RIO家族成員之一，參與了rRNA的前處理及核糖體的生物合成[2-3]。有研究報道，RIOK2可參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤、非小細胞肺癌的發(fā)病及進展過程，并可反映患者的預后情況[4-5]；RIOK2可被miR-145調(diào)控，參與非小細胞肺癌細胞的遷移、侵襲過程[6]。已有多項研究表明，miR-145與ESCC的關系密切，并可反映ESCC治療的療效[7-10]?；谏鲜鲅芯浚茰yRIOK2可能與ESCC患者的預后有關，其有望成為預測ESCC患者預后的重要指標。本研究檢測了ESCC患者中RIOK2的表達水平，并分析其與ESCC患者預后情況的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年4月至2015年6月在西安交通大學第一附屬醫(yī)院就診的218例ESCC患者作為研究對象。參照《中國早期食管癌篩查及內(nèi)鏡診治專家共識意見(2014年，北京)》[11]診斷ESCC。納入標準：(1)經(jīng)活體組織病理檢查確診為ESCC；(2)接受根治性切除術治療；(3)ESCC組織標本完好，保存于液氮罐中；(4)患者均知情、同意。排除標準：(1)根治性切除術前接受過放射治療或化學治療；(2)合并其他惡性腫瘤；(3)嚴重肝、腎功能不全；(4)感染性疾病史、血液系統(tǒng)疾病或自身免疫性疾?。?5)臨床資料不完整。218例ESCC患者中男性140例，女性78例，年齡44～75歲，平均年齡為(58.25±6.07)歲；腫瘤位于胸上段10例，胸中段152例，胸下段56例。本研究經(jīng)西安交通大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 信息收集

收集入組患者的年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤位置、腫瘤直徑、TNM分期、分化程度等資料。采用電話隨訪方式了解ESCC患者的預后生存情況，于患者出院后1個月開始隨訪，每3個月隨訪1次，隨訪終點為患者死亡。

1.3 RIOK2表達水平檢測

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測ESCC組織中RIOK2的表達水平[12]。實驗步驟如下：(1)使用RIPA裂解液提取ESCC組織中總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量；(2)10% SDS-PAGE凝膠電泳，電壓由80 V增加至120 V，直至溴酚藍跑出膠面；(3)在300 mA電流下電泳；(4)5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；(5)加一抗，4 ℃孵育過夜；(6)加二抗，室溫孵育2 h；(7)ELC顯影。應用ImageJ 1.8.1軟件讀取膠片，以β-actin作為內(nèi)參，記錄RIOK2的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 ESCC患者的預后情況

對218例ESCC患者進行為期6～60個月的隨訪，隨訪時間中位數(shù)為37個月，結(jié)果顯示患者的1年、3年和5年生存率分別為77.06%(168/218)、46.33%(101/218)和38.53%(84/218)。

2.2 RIOK2表達水平檢測

根據(jù)ESCC患者的5年生存情況將其分為生存組(n=84)和死亡組(n=134)。生存組RIOK2的相對表達量為0.75±0.10，低于死亡組(0.94±0.16)，兩組差異有統(tǒng)計學意義(t=10.622，P<0.001)，見圖1。

注：A1、A3為死亡組；A2、A4、A5、A6為生存組圖1 生存組和死亡組RIOK2的表達水平 A 蛋白質(zhì)印跡圖 B 兩組RIOK2的相對表達量比較

2.3 患者的生存情況比較

結(jié)果顯示，RIOK2預測ESCC患者預后的ROC曲線下面積(AUC)、最佳截斷值、敏感度和特異度分別為0.832(95%CI：0.776～0.879)、0.82、78.36%和79.76%(見圖2)。以RIOK2預測ESCC患者預后的最佳截斷值作為分界點，將218例ESCC患者分為高表達RIOK2組(n=124)和低表達RIOK2組(n=94)。高表達RIOK2組的中位生存時間為24個月，短于低表達RIOK2組(60個月)，兩組差異有統(tǒng)計學意義(log-rankχ2=68.916，P<0.001)，見圖3。

圖2 RIOK2預測ESCC患者預后的ROC曲線

圖3 高表達RIOK2組和低表達RIOK2組的生存曲線

2.4 影響ESCC患者預后的危險因素

將ESCC患者的5年生存情況作為因變量，將可能與預后有關的因素，包括年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤位置、腫瘤直徑、T分期、N分期、G分期和RIOK2作為自變量，分別納入Cox單因素回歸分析，結(jié)果顯示性別、腫瘤直徑、T分期、N分期、G分期和RIOK2與ESCC患者的預后有關，而年齡、吸煙史、飲酒史和腫瘤位置與ESCC患者的預后無關，見表1。以P≤0.1作為納入標準，將年齡、性別、飲酒史、腫瘤位置、腫瘤直徑、T分期、N分期、G分期和RIOK2納入Lasso回歸分析，結(jié)果顯示飲酒史、腫瘤位置、腫瘤直徑、T分期、N分期、G分期和RIOK2與ESCC患者的預后有關(P<0.05)，見圖4、5。將飲酒、腫瘤位置、腫瘤直徑、T分期、N分期、G分期和RIOK2納入Cox多因素回歸分析，結(jié)果顯示T分期、N分期、G分期和RIOK2均是ESCC患者預后的獨立危險因素(P<0.05)，見表1。

圖4 Lasso回歸中最佳lambda判定圖

圖5 Lasso回歸中各自變量的系數(shù)

表1 影響ESCC患者預后生存的單因素和多因素Cox比例風險回歸分析

3 討論

ESCC組織中的部分蛋白或基因與患者的預后密切相關。胥凱凱等[13]研究表明，ESCC組織中表皮生長因子受體過表達的患者的預后較差。王璐瑤等[14]的研究表明，Erbin蛋白在ESCC組織中高表達，其表達量越高提示ESCC患者發(fā)生預后不良的風險越高。本文主要探究了ESCC組織中RIOK2的表達水平與患者預后的關系。

李娜等[15]的研究表明，ESCC患者的3年、5年生存率分別為45.0%和39.3%。苗曉慧等[16]的研究結(jié)果顯示，ESCC患者的1年、3年和5年生存率分別為77.3%、51.1%和38.6%。本研究中218例ESCC患者的1年、3年和5年生存率分別為77.06%、46.33%和38.53%，與上述研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果顯示，RIOK2在生存組中的表達水平低于死亡組，這提示ESCC組織中RIOK2的表達水平與患者的預后有關。

為進一步闡明RIOK2的表達水平與ESCC患者預后的關系，本文比較了高表達RIOK2組和低表達RIOK2組的生存時間，結(jié)果顯示高表達RIOK2組的中位生存時間短于低表達RIOK2組，這提示ESCC組織中RIOK2的表達水平與患者的預后生存情況密切相關。本研究結(jié)果顯示，性別、腫瘤直徑、T分期、N分期、G分期和RIOK2與ESCC患者的預后有關。以P≤0.1作為標準，篩選納入Cox多因素回歸分析的相關指標，結(jié)果顯示有9項指標符合納入標準，因本研究的樣本量偏小，且為了避免部分指標存在共線性關系而影響分析結(jié)果，本研究采用Lasso回歸分析對影響ESCC患者預后的相關因素進行篩選，并將篩選結(jié)果納入Cox多因素回歸分析，結(jié)果顯示T分期、N分期、G分期和RIOK2均是ESCC患者預后的獨立危險因素。黃鑫等[17]的研究表明，ESCC患者的腫瘤分化程度和腫瘤分期均是影響預后的獨立危險因素；另有多項研究表明，ESCC患者的T分期、N分期和腫瘤分化程度與預后密切相關[18-22]，與本文的結(jié)論相符。

有研究表明，miR-145在ESCC組織中低表達，且與腫瘤的浸潤深度有關[7-8]，過表達miR-145可抑制ESCC細胞的增殖和遷移[8-9]；RIOK2可靶向miR-145參與非小細胞肺癌細胞的遷移和侵襲過程[6]。由此推測，RIOK2的表達水平可以反映ESCC細胞的侵襲和遷移能力，進而反映患者的預后情況。

綜上所述， ESCC組織中RIOK2的表達水平與患者的預后有關，其表達水平越高提示患者5年生存率越低。本研究尚存在一定不足，如為單中心研究、納入的樣本量偏小等，今后需進一步對RIOK2通過調(diào)控miR-145參與ESCC進展的機制進行探究。