李乾元 周秀扣 方征宇 潘志蕓

結(jié)直腸癌(CRC)是全球常見的惡性腫瘤[1]。近年來，隨著人們生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的變化，CRC的發(fā)病率呈持續(xù)升高趨勢。目前臨床上對CRC患者通常采用外科手術治療，但研究顯示有40%～50%的CRC患者在術后出現(xiàn)局部復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移，最終導致死亡[2-3]。CRC肝轉(zhuǎn)移是影響患者預后的主要因素，然而肝轉(zhuǎn)移的潛在機制尚未完全明確。因此，臨床亟需探尋新的CRC遠處轉(zhuǎn)移的分子標志物和治療策略。斯鈣素2(STC2)是一種分泌型糖蛋白激素，其以自分泌或旁分泌的方式在多種組織和器官中表達并發(fā)揮生物學作用[4]。研究表明，CRC組織中STC2較正常組織顯著升高，STC2高表達患者的總體生存期較短，并且STC2高表達與CRC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、晚期臨床分期顯著相關[5]。此外，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與腫瘤遠處轉(zhuǎn)移有著密切聯(lián)系，EMT的發(fā)生會加快CRC進展。Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路可通過影響腫瘤細胞的增殖、分化及凋亡，參與CRC的發(fā)生、發(fā)展。本研究基于Wnt/β-catenin信號通路，探討了沉默STC2對人結(jié)腸癌SW480細胞肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型的影響及作用機制，以期為臨床尋找新的CRC遠處轉(zhuǎn)移的分子標志物和治療策略提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株與動物 人結(jié)腸癌細胞株SW480購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。SPF級BALB/c雄性裸鼠共30只(6～8周齡，體質(zhì)量16～20 g)，購自上海市西普爾-必凱實驗動物有限公司，于SPF級實驗室中飼養(yǎng)，濕度、溫度適宜。本研究動物實驗獲得醫(yī)院動物倫理委員會批準，同時遵循中國動物護理和機構(gòu)倫理指導方針。

1.1.2 主要試劑與儀器 (1)實驗材料：H-E染色試劑盒購自上海信帆生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒購自武漢純度生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海烜雅生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國賽默飛世爾科技有限公司；脂質(zhì)體lipofectamine 2000試劑盒購自北京伊塔生物科技有限公司；一抗[STC2、波形蛋白(Vimentin)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、T細胞因子4(TCF-4)、C-myc、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、GAPDH]和二抗(羊抗鼠、羊抗兔)均購自美國Abcam公司；一抗[E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、β-catenin]購自美國CST公司；(2)實驗儀器：1855195-OG型定量PCR儀購自美國Biorad公司；DYCZ-20E型電泳設備購自北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)和傳代 將SW480細胞置于含10%胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗RPMI-1640培養(yǎng)基中，并于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。按1︰2.5的比例隔天傳代。待培養(yǎng)基細胞密度達80%，用吸管抽吸培養(yǎng)基中舊培養(yǎng)液，用PBS沖洗一遍，加入少量乙二胺四乙酸(EDTA)與胰蛋白酶的混合液，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使液體能覆蓋整個細胞面為宜。在顯微鏡下觀察，當細胞間隙增大、細胞質(zhì)回縮時吸出消化液，加入新的培養(yǎng)液，用移液管輕輕吹打培養(yǎng)基形成單細胞懸液。在顯微鏡下采用計數(shù)板計數(shù)后，取2.5 mL細胞懸液接種至新的培養(yǎng)基中，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細胞在培養(yǎng)基中均勻分布，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。

1.3.2 慢病毒載體介導的基因沉默 pLL3.7載體購自上?？吕咨锟萍加邢薰?，設計針對STC2的RNA干擾序列shRNA，并構(gòu)建pLL3.7-shSTC2質(zhì)粒，根據(jù)脂質(zhì)體lipofectamine 2000試劑盒說明書進行細胞轉(zhuǎn)染，構(gòu)建pLL3.7-shSTC2細胞，記為pLL3.7-shSTC2組。將以陰性病毒載體(pLL3.7-NC)轉(zhuǎn)染的SW480細胞作為陰性對照，記為pLL3.7-NC組。將僅以轉(zhuǎn)染試劑處理的SW480細胞作為空白對照，記為pLL3.7-Con組。

1.3.3 構(gòu)建結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型 SPF級雄性BALB/c裸鼠共30只，隨機分為pLL3.7-STC2組、pLL3.7-NC組和pLL3.7-Con組，每組各10只。3組分別于脾下緩慢注射2.5×107/mL的SW480細胞懸液，待注射部位腫脹、發(fā)白后拔針，并立即用棉球按壓止血，保留脾臟建立結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型。常規(guī)飼養(yǎng)并定期觀察裸鼠的精神活動狀態(tài)、體質(zhì)量變化，3周后頸椎脫臼處死裸鼠。各組裸鼠處死后剖腹，觀察記錄肝轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量、直徑及肝臟質(zhì)量，留取各組肝轉(zhuǎn)移瘤組織以備后續(xù)實驗使用。

1.3.4 H-E染色觀察 取肝轉(zhuǎn)移瘤組織塊，用10%甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、包埋、切片、脫蠟、水化，經(jīng)H-E染色，中性樹膠封片，在100倍顯微鏡下觀察病理變化，實驗重復3次。

1.3.5 RT-PCR法檢測 取各組肝轉(zhuǎn)移瘤組織，加入1 mL TRIzol試劑提取總RNA，采用紫外分光光度計檢測其濃度，并用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應模式：預變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 10 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計算各基因相對表達量，以GAPDH為內(nèi)參，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測 取組織及細胞，采用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取總蛋白，并根據(jù)BCA蛋白水平測定各種蛋白水平，取20 μL樣品上樣至SDS-PAGE凝膠泳道上進行電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉，加入一抗(STC2、Vimentin、MMP-9、TCF-4、C-myc、Cyclin D1、GAPDH、E-cadherin及β-catenin)，4 ℃孵育過夜，用TBST漂洗3次(10 min/次)。加入二抗(羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG)，用TBST漂洗3次(10 min/次)。采用ECL化學發(fā)光法進行圖像顯影，以GAPDH為內(nèi)參，應用ImageJ軟件進行分析。

1.3.7 免疫組織化學法觀察 取小鼠肝轉(zhuǎn)移瘤組織，組織切片采用二甲苯乙醇水化，加熱進行抗原修復，在室溫下用H2O2孵育。組織切片加入β-catenin一抗于4 ℃孵育過夜，滴加AP標記羊抗鼠二抗于室溫下孵育20 min。采用DAB顯色，蘇木精染液復染，脫水、透明、干燥、封片，在100倍顯微鏡下觀察各組的β-catenin表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)印跡法檢驗建模效果

蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測結(jié)果顯示，pLL3.7-shSTC2組SW480細胞的STC2蛋白表達水平明顯低于pLL3.7-NC組和pLL3.7-Con組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

注：與pLL3.7-NC組比較，***P<0.001圖1 3組SW480細胞的STC2蛋白表達水平比較 A STC2蛋白電泳圖 B STC2蛋白表達柱狀圖

2.2 建模后各組的一般情況比較

建模后第1周，各組裸鼠的精神狀態(tài)、攝食飲水正常，活動自如，腹部未見明顯腫塊。建模后第2周開始，pLL3.7-Con組和pLL3.7-NC組裸鼠的精神狀態(tài)較差，攝食量減少，行動逐漸遲緩，部分裸鼠可見腹部膨??；pLL3.7-shSTC2組中部分裸鼠出現(xiàn)精神狀態(tài)欠佳、攝食量偏少、行動較緩慢、體質(zhì)量下降現(xiàn)象。建模3周后，頸椎脫臼處死裸鼠，解剖取出肝臟。各組的肝臟體積變小，外形部分受損，質(zhì)地脆硬；各組的部分肝組織被轉(zhuǎn)移瘤替代，肝臟表面可見散在分布的灰白色針尖大小的微小轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn)移瘤主要位于肝葉邊緣和肝葉臟面。與pLL3.7-shSTC2組相比，pLL3.7-NC組和pLL3.7-Con組的肝臟外形不規(guī)則程度、質(zhì)地脆硬度、瘤體破潰等現(xiàn)象均更嚴重，見圖2。

圖2 建模3周后各組的肝臟標本比較 A pLL3.7-Con組 B pLL3.7-NC組 C pLL3.7-shSTC2組

pLL3.7-Con組、pLL3.7-NC組、pLL3.7-shSTC2組的肝轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量分別為(11.75±1.25)個、(12.15±1.38)個、(5.72±1.02)個，肝轉(zhuǎn)移瘤直徑分別為(2.22±0.21)mm、(2.24±0.20)mm、(1.51±0.18)mm，肝臟質(zhì)量分別為(1.81±0.14)g、(1.85±0.15)g、(1.59±0.11)g。結(jié)果提示pLL3.7-shSTC2組的肝轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量、直徑及肝臟質(zhì)量均明顯小于pLL3.7-Con組和pLL3.7-NC組。見圖3。

注：與pLL3.7-NC組比較，**P<0.01，***P<0.001圖3 各組的肝轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量、直徑及肝臟質(zhì)量比較 A 肝轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量 B 肝轉(zhuǎn)移瘤直徑 C 肝臟質(zhì)量

各組的肝組織H-E染色結(jié)果顯示，pLL3.7-Con組和pLL3.7-NC組的肝小葉結(jié)構(gòu)大部分被破壞，且肝轉(zhuǎn)移瘤區(qū)可見大量腫瘤細胞聚集成團形成癌結(jié)節(jié)，腫瘤細胞異型性明顯，腫瘤細胞呈梭形，細胞質(zhì)較少，細胞核呈圓形，核分裂相增多。pLL3.7-shSTC2組的肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，視野內(nèi)見少許腫瘤細胞聚集成團或散在分布，腫瘤細胞異型性明顯，細胞質(zhì)較少，細胞核固縮，核分裂相增多。結(jié)果提示pLL3.7-shSTC2組的肝臟病理變化較pLL3.7-NC組和pLL3.7-Con組輕。見圖4。

圖4 各組裸鼠的肝組織病理圖 H-E染色 ×100 A pLL3.7-Con組 B pLL3.7-NC組 C pLL3.7-shSTC2組

2.3 各組肝轉(zhuǎn)移瘤組織中STC2、EMT及Wnt/β-catenin信號通路相關基因的蛋白表達水平比較

Western blotting法檢測結(jié)果顯示，與pLL3.7-Con組、pLL3.7-NC組相比，pLL3.7-shSTC2組肝轉(zhuǎn)移瘤組織中STC2、Vimentin、MMP-9、β-catenin、TCF-4、C-myc及Cyclin D1的蛋白表達水平表達明顯降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。見圖5、表2。

注：與pLL3.7-NC組比較，***P<0.001圖5 各組肝轉(zhuǎn)移瘤組織中STC2、EMT及Wnt/β-catenin信號通路相關基因的蛋白表達水平比較 A STC2、E-cadherin、Vimentin、MMP-9蛋白電泳圖 B STC2、E-cadherin、Vimentin、MMP-9蛋白表達柱狀圖 C β-catenin、TCF-4、C-myc、Cyclin D1蛋白電泳圖 D β-catenin、TCF-4、C-myc及Cyclin D1蛋白表達柱狀圖

表2 各組肝轉(zhuǎn)移瘤組織中STC2、EMT及Wnt/β-catenin信號通路相關基因的蛋白表達水平比較

本研究中，RT-PCR法檢測結(jié)果顯示，與pLL3.7-Con組、pLL3.7-NC組相比，pLL3.7-shSTC2組裸鼠的肝轉(zhuǎn)移瘤組織中TCF-4、C-myc、CyclinD1的mRNA表達水平均明顯降低(P均<0.05)。見圖6、表3。

注：與pLL3.7-NC組比較，***P<0.001圖6 各組TCF-4、C-myc、Cyclin D1的mRNA表達水平比較

表3 各組肝轉(zhuǎn)移瘤組織中TCF-4、C-myc、Cyclin D1的mRNA表達水平比較

本研究中，免疫組織化學染色結(jié)果顯示，與pLL3.7-Con組、pLL3.7-NC組相比，pLL3.7-shSTC2組裸鼠的肝轉(zhuǎn)移瘤組織中β-catenin表達水平明顯降低。見圖7。

圖7 各組的β-catenin表達比較 免疫組織化學染色 ×100 A pLL3.7-Con組 B pLL3.7-NC組 C pLL3.7-shSTC2組

3 討論

在中國，CRC是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。研究報道，全球每年CRC新發(fā)病例約110萬，死亡病例約50萬[6-7]。近年來，隨著中國人口老齡化及飲食結(jié)構(gòu)中脂肪占比的升高等原因，CRC的發(fā)病率呈升高趨勢。研究表明，肝轉(zhuǎn)移是造成CRC患者死亡的主要原因，該過程中有多因素、多基因參與[8]。雖然CRC的發(fā)病機制研究取得了一定的進展，但CRC發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的具體機制迄今未完全明確。因此，探討新的CRC肝轉(zhuǎn)移標志物及治療策略是目前亟待解決的重要問題。

STC2是一種糖蛋白激素，主要在魚的腸道及腮中發(fā)揮抑制鈣攝取的作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，STC2廣泛存在于人體的十二指腸、腎小管和集合管等組織中，在細胞增殖、代謝等生理過程中發(fā)揮著一定的作用[10]。近年來，多項研究表明，STC2與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[11-12]。為進一步探討STC2對CRC肝轉(zhuǎn)移的影響，本研究將pLL3.7-shSTC2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入SW480細胞，發(fā)現(xiàn)pLL3.7-shSTC2組SW480細胞的STC2蛋白表達水平明顯低于pLL3.7-Con組和pLL3.7-NC組，提示成功構(gòu)建沉默STC2的SW480細胞。本研究進一步構(gòu)建了結(jié)腸癌細胞肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型，結(jié)果顯示pLL3.7-shSTC2組裸鼠的一般情況較pLL3.7-Con組和pLL3.7-NC組好，肝轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量、直徑及肝臟質(zhì)量較小，肝組織病理變化較輕，提示沉默STC2對結(jié)腸癌細胞肝轉(zhuǎn)移有抑制作用。

腫瘤遠處轉(zhuǎn)移與EMT的發(fā)生、腫瘤微環(huán)境的變化，以及細胞質(zhì)基質(zhì)的降解密切相關[13]。EMT是指上皮細胞在生理、病理因素作用下，通過一系列基因的表達轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型細胞的過程，在胚胎發(fā)育、器官形成和腫瘤細胞侵襲、遠處轉(zhuǎn)移等諸多生理、病理現(xiàn)象中發(fā)揮重要作用[14]。Vimentin、MMP-9及E-cadherin是EMT相關分子標志物，Vimentin、MMP-9表達水平上調(diào)，可通過重塑基質(zhì)膜與細胞外基質(zhì)，繼而下調(diào)E-cadherin水平，改變上皮細胞的微環(huán)境，促使EMT發(fā)生，誘導腫瘤細胞發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。此外，上述過程與Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)導途徑密切相關，在生長因子的刺激下，激活Wnt/β-catenin通路的級聯(lián)反應，能增強腫瘤細胞的增殖和抗凋亡能力[15]。β-catenin是Wnt/β-catenin通路的核心元件，其在正常結(jié)腸細胞中可與E-cadherin及α-catenin結(jié)合形成復合體，發(fā)揮細胞間黏附作用，可防止細胞轉(zhuǎn)移。而在腫瘤細胞中，Wnt處于失活狀態(tài)，復合體被降解，導致β-catenin聚集于細胞質(zhì)內(nèi)，當細胞質(zhì)內(nèi)β-catenin達到一定水平后可激活細胞核內(nèi)的TCF-4，導致通路下游靶基因C-myc、CyclinD1被激活，從而導致腫瘤細胞過度增殖及凋亡受阻[16]。

目前STC2是否通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路促進結(jié)腸癌細胞肝轉(zhuǎn)移仍有待研究。為進一步闡明沉默STC2在結(jié)腸癌細胞肝轉(zhuǎn)移中的作用機制，本研究分析了結(jié)腸癌細胞肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型中STC2、EMT及Wnt/β-catenin信號通路相關基因的蛋白表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與pLL3.7-Con組、pLL3.7-NC組相比，pLL3.7-shSTC2組肝轉(zhuǎn)移瘤組織中β-catenin、TCF-4、C-myc、Cyclin D1、Vimentin及MMP-9的蛋白表達均明顯降低，E-cadherin蛋白表達明顯升高，提示沉默STC2可能通過下調(diào)β-catenin表達，進而阻礙Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因啟動子激活，阻礙TCF-4激活，下調(diào)C-myc及Cyclin D1表達水平，阻礙EMT的發(fā)生，從而抑制CRC肝轉(zhuǎn)移進程。

綜上所述，沉默STC2可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路減少結(jié)腸癌細胞的增殖和侵襲，以及EMT的發(fā)生，從而抑制腫瘤肝轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果為臨床探尋新的CRC遠處轉(zhuǎn)移的分子標志物和治療策略提供了思路，本研究僅用SW480細胞進行了初步探討，今后將采用多種結(jié)腸癌細胞株及開展臨床研究進行驗證。